אנו מציגים פרוטוקול לצורך שיטת הצביעה של פעילות ציטראט ומטריקה לכימות של מסה מיטוכונדריאלי שלמה ברקמת דרוזוהילה .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
המיטוa לשחק את התפקידים הבולטים ביותר בחילוף החומרים הסלולר על ידי הפקת ATP באמצעות זרחון חמצוני ויסות מגוון של תהליכים פיזיולוגיים. תפקוד מיטוכונדריאלי הוא הגורם העיקרי של מספר מחלות מטבולית וניווניות. המיטו, שלמים הם קריטיים. לתפקוד התקין שלהם האנזים ציטראט סינתאז מקומי במטריקס מיטוכונדריאלי ולכן ניתן להשתמש בו כסמן אנזים כמותי של מסה מיטוכונדריאלי שלמה. בהינתן כי מולקולות ומסלולים רבים כי יש פונקציות חשובות במיטויום הם שימור מאוד בין בני אדם, Drosophila ילה, וכי מערך של כלים גנטיים רבי-עוצמה זמינים בדרוזוהילה, drosophila ילה משמש מערכת מודל טובה ללימוד תפקוד מיטוכונדריאלי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מדידה מהירה ופשוטה של פעילות ציטראט סינתאז ברקמות הומואכל מזבובים מבוגרים מבלי לבודד המיטו,. פרוטוקול זה מתאים גם למדידת פעילות ציטראט וסינתאז בזחלים, בתאים מתורבתים וברקמות היונקים.
מבוא
המיטויום הם הידועים ביותר כארגון הפקת כוח ברוב האורגניזמים איקריוטית, אשר מייצרים את מטבע האנרגיה, ATP, דרך מחזור חומצה tricarboxylic (כלומר, מחזור קרבס) וזירחון חמצוני. המיטומטר מצאו גם לשחק תפקידים חשובים הרבה תהליכים פיזיולוגיים אחרים, כגון רגולציה של אפופטוזיס1, Ca2 + הומאוסטזיס2,3, מינים חמצון תגובתי (ROS) דור4, ו-רשתית פלזמית רשתית (ER)-התגובה הלחץ5. תפקוד מיטוכונדריאלי יכול להשפיע על כל איבר בגוף בכל גיל והוא גורם עיקרי של חילוף החומרים, ההזדקנות6, מחלות ניווניות7. המיטו, של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. צביעת מטריקה ציטראט ושיטת הפעילות של ד. מלאנוגסטר16
- לאסוף 10 זבובים מבוגרים עבור כל דוגמה. לאסוף דגימות לפחות טרילקאט עבור כל גנוטיפ.
- להכין 500 μL של מאגר החילוץ קר קרח המכיל 20 מ"מ HEPES (pH = 7.2), 1 מ"מ EDTA, ו 0.1% טריטון X-100 במבחנה בתוך 1.5 mL עבור כל מדגם.
- מבוגר מורדם זבובים עם CO2 על משטח הרדמה ולבודד את הרקמות הרצויות. כדי לבודד את התצירים הבוגרים לטוס, למשל, לתקן את הטורצירים לטוס על ידי זוג מלקחיים, ולאחר מכן לבודד את בטנם לעוף על ידי חיתוך לאורך הגבול של בית החזה והבטן באמצעות זוג מספריים. לאסוף את ת'ורקס לטוס עבור השריר שריר ציטראט סטנדרטים הפעילות.
הערה: לקבוע את המשקל הטרי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג דוגמה של עקומות קינטית לספיגת OD ב 412 ננומטר לאורך זמן שהושג באמצעות היישום המקביל של הפעילות הציטראט למדוד את מדידת הרקמה בבית החזה. ידוע היטב כי PGC-1α הוא וסת מאסטר של biogenesis מיטוכונדריאלי. PGC-1α שימור מבחינה פונקציונלית בין דרוזוהילה ובני אדם. דרוסופילה RNF34 (dRNF34) הוא מהווה E3 אוביקוויב ליגאז עבור drosophila ילה pgc-1α, dpgc-1, ומקדם השפלה חלבון dpgc-117. מיקרוסקופ אלקטרוני .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים מטבולית באמצעות Drosophila ילה כמודל חייב לקחת בחשבון את הרקע הגנטי, דיאטה, ותחזוקה של מניות של זבובים18. כדי למנוע את ההשפעות של רקעים גנטיים שונים על המדידה של פעילות ציטראט סינתז, זנים שונים של דרוסופילה צריך להיות מוצלב למתח שליטה עבור 10 דורות. הרקע הגנטי של כל הזנים Drosophila ילה בשימוש בניסויים שלנו הוא w1118, אז השתמשנו w1118 כפקד. באופן כללי, אנו חושבים w1118 הוא שליטה טובה, כפי שהוא הרקע הגנט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי המענקים מן הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (31401013 ו 31471010), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי, שנגחאי Pujiang התוכנית (14PJ1405900), והקרן למדעי הטבע של שנגחאי (19ZR1446400).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיניל]חומצה אתנסולפונית (HEPES) | סיגמא-אולדריץ' | ||
| -(הידרוקסימתיל)-1,3-פרופנדיול (בסיס טריזמה) | סיגמא-אולדריץ' | V900483 | |
| אצטיל-CoA | סיגמא-אולדריץ' | A2181 | |
| חומצה דיתיו-ביס-ניטרובנזואית (DTNB) | סיגמא-אולדריץ' | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| גלולה עלי | Sangon | F619072 | |
| גלולה עלי מנוע | Tiangen | OSE-Y10 | |
| קורא צלחות | BioTek | Eon | |
| חלבון BCA ערכת בדיקה | Beyotime | P0010S | |
| מספריים | WPI | 14124 | |
| טריטון X-100 | סנגון | A110694-0100 |
מקורות
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
