הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59454

⸱

16 בינואר 2020

 ,  ,  , 
1Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital, 2Department of Anatomy of Physiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול לצורך שיטת הצביעה של פעילות ציטראט ומטריקה לכימות של מסה מיטוכונדריאלי שלמה ברקמת דרוזוהילה .

תקציר

המיטוa לשחק את התפקידים הבולטים ביותר בחילוף החומרים הסלולר על ידי הפקת ATP באמצעות זרחון חמצוני ויסות מגוון של תהליכים פיזיולוגיים. תפקוד מיטוכונדריאלי הוא הגורם העיקרי של מספר מחלות מטבולית וניווניות. המיטו, שלמים הם קריטיים. לתפקוד התקין שלהם האנזים ציטראט סינתאז מקומי במטריקס מיטוכונדריאלי ולכן ניתן להשתמש בו כסמן אנזים כמותי של מסה מיטוכונדריאלי שלמה. בהינתן כי מולקולות ומסלולים רבים כי יש פונקציות חשובות במיטויום הם שימור מאוד בין בני אדם, Drosophila ילה, וכי מערך של כלים גנטיים רבי-עוצמה זמינים בדרוזוהילה, drosophila ילה משמש מערכת מודל טובה ללימוד תפקוד מיטוכונדריאלי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מדידה מהירה ופשוטה של פעילות ציטראט סינתאז ברקמות הומואכל מזבובים מבוגרים מבלי לבודד המיטו,. פרוטוקול זה מתאים גם למדידת פעילות ציטראט וסינתאז בזחלים, בתאים מתורבתים וברקמות היונקים.

מבוא

המיטויום הם הידועים ביותר כארגון הפקת כוח ברוב האורגניזמים איקריוטית, אשר מייצרים את מטבע האנרגיה, ATP, דרך מחזור חומצה tricarboxylic (כלומר, מחזור קרבס) וזירחון חמצוני. המיטומטר מצאו גם לשחק תפקידים חשובים הרבה תהליכים פיזיולוגיים אחרים, כגון רגולציה של אפופטוזיס1, Ca2 + הומאוסטזיס2,3, מינים חמצון תגובתי (ROS) דור4, ו-רשתית פלזמית רשתית (ER)-התגובה הלחץ5. תפקוד מיטוכונדריאלי יכול להשפיע על כל איבר בגוף בכל גיל והוא גורם עיקרי של חילוף החומרים, ההזדקנות6, מחלות ניווניות7. המיטו, שלמים הם המכונה הקשורים לתפקוד מיטוכונדריאלי. לפיכך, כימות נאותה של מסה מיטוכונדריאלי שלם חשוב מאוד להערכת פונקציה מיטוכונדריאלי8. ציטראט סינתאז, האנזים הגבלת קצב בשלב הראשון שלמחזור חומצהtricarboxylic מקומי מותאם מטריצה מיטוכונדריאלי בתוך התאים איקריוטית, ולכן ניתן להשתמש בתור סמן כמותי לנוכחות של המסה מיטוכונדריאלי שלם9,10. פעילות ציטראט סינתאז יכולה לשמש גם כגורם נורמליזציה עבור חלבונים מיטוכונדריאלי שלמים11,12.

זבוב הפירות, דרוסופילה מלאנוסטר, היא מערכת מודל מעולה לחקר תפקוד מיטוכונדריאלי, כמו מולקולות ומסלולים רבים הפועלים תפקידים מרכזי במיטו, שנשמרים בפועל מדרוסוהילה לבני אדם13,14,15. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיטה מהירה ופשוטה למדידה של פעילות ציטראט ומדידה באמצעות שיטת הצביעה בשיטת דרוזוהילה הומוכטים16 בפורמט 96 לצלחת היטב. בתוך שיטת הפעילות הציטראט, הציטראט של העור בדרוזואז , מזרז את התגובה של הקוקלואצטט באמצעות קוקסיל (coa) כדי ליצור את ה-coa הציטראט-SH ו-H+. CoA-SH מגיב לאחר מכן 5, 5 '-dithiobis-(2-החומצה בנזועית) (DTNB) כדי ליצור מוצר צבעוני, 2-ניטרו-5-thiobenzoate (TNB), אשר ניתן למדוד בקלות spectrophotometrically ב 412 nm. פעילות ציטראט סינתאז יכול להיות משתקף על ידי שיעור ייצור הצבע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. צביעת מטריקה ציטראט ושיטת הפעילות של ד. מלאנוגסטר16

  1. לאסוף 10 זבובים מבוגרים עבור כל דוגמה. לאסוף דגימות לפחות טרילקאט עבור כל גנוטיפ.
  2. להכין 500 μL של מאגר החילוץ קר קרח המכיל 20 מ"מ HEPES (pH = 7.2), 1 מ"מ EDTA, ו 0.1% טריטון X-100 במבחנה בתוך 1.5 mL עבור כל מדגם.
  3. מבוגר מורדם זבובים עם CO2 על משטח הרדמה ולבודד את הרקמות הרצויות. כדי לבודד את התצירים הבוגרים לטוס, למשל, לתקן את הטורצירים לטוס על ידי זוג מלקחיים, ולאחר מכן לבודד את בטנם לעוף על ידי חיתוך לאורך הגבול של בית החזה והבטן באמצעות זוג מספריים. לאסוף את ת'ורקס לטוס עבור השריר שריר ציטראט סטנדרטים הפעילות.
    הערה: לקבוע את המשקל הטרי של הרקמה בשלב זה אם להשתמש בו כדי לנרמל את פעילות ציטראט וסטנדרטים.
  4. העברה 10 מבוגרים לטוס thoraxes כדי 100 μl של מאגר החילוץ קר הקרח באופן מיידי והמגון עם כתש על הקרח. כדי לשמור את הדגימות קרח קר, המגון לסדר את הדגימות עבור 5-10 s על הקרח, אז יש את הדגימות לשבת על הקרח עבור 5 s, ולחזור עד שכל הרקמות בצינור הם הומוגניים לחלוטין.
    הערה: הקלטת את השפופרת, בדוק את ההומוטים כדי לוודא שאין קרישי דם במגון ושהרקמות בצינור הן הומוגניים לחלוטין. כל הטיפולים לדוגמה צריך להתבצע על קרח.
  5. קח 10 μL של כל מדגם הומוגניים בצינור חדש עבור מדידת תוכן חלבון. שמור את הדגימות. למדידת חלבון על הקרח
    הערה: ניתן להקפיא את דגימות החלבון ולאחסנו ב-80 ° c לניתוח מאוחר יותר. ריכוזי החלבון משמשים כפרמטר פנימי לנורמליזציה של פעילויות ציטראט סינתאז.
  6. הוסף 400 μL של מאגר החילוץ קר קרח לכל מדגם שנותר כדי להפוך את הנפח הכולל של 500 μL. Mix היטב על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה לפחות 5x, הימנעות היווצרות בועה. עבור כל תגובה, להוסיף 1 μL של תא מדולל ליפוסט כדי 150 μL של פתרון התגובה טרי מוכן (20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 m מילימטר מיקרומטר, 1 מ"מ חומצה אוקאלואצטט). מערבבים ביסודיות ובאופן מיידי על ידי ליטוף בעדינות, הימנעות היווצרות בועה. למדוד את ספיגת ב 412 ננומטר כל 10-30 s עבור 4 דקות ב 25 ° c באמצעות קורא צלחת מסוגל למדוד ספיגת בשנת 412 nm במרווחי זמן מינימלי של 10 s.
    הערה: שנה את העצה לפני ליטוף מגיב שונה ולהימנע להרכיב בועות בבארות. ערבוב לא שלם של הריאגנטים עלול לגרום וריאציות במידות. שיטת הפעילות הציטראט הקיימת צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר מיד לאחר איסוף הדגימות, מאחר שניתן להשתמש באותה שיטת לכמת מסה מיטוכונדריאלי שלמה. מאגר התגובות צריך להיות מוכן מיד לפני השימוש ולא צריך להיות מאוחסן.
  7. התוויית נתונים כדחיסות אופטית (OD) ספיגת (abs) (ציר Y) לעומת זמן (בדקות) (ציר X). לאחר מכן חשב את השיפוע עבור החלק הליניארי של העקומה, כאשר קצב התגובה מ

    figure-protocol-1

    לחלק את הערך על ידי ריכוז החלבון לדוגמה כדי לנרמל את הפעילות הציטראט סינתאז. הפעילות הציטראט מחושבת כ

    figure-protocol-2

    הערה: ניתן למדוד את ריכוז החלבון לדוגמה על-ידי ערכת שיטת ריכוז חלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג דוגמה של עקומות קינטית לספיגת OD ב 412 ננומטר לאורך זמן שהושג באמצעות היישום המקביל של הפעילות הציטראט למדוד את מדידת הרקמה בבית החזה. ידוע היטב כי PGC-1α הוא וסת מאסטר של biogenesis מיטוכונדריאלי. PGC-1α שימור מבחינה פונקציונלית בין דרוזוהילה ובני אדם. דרוסופילה RNF34 (dRNF34) הוא מהווה E3 אוביקוויב ליגאז עבור drosophila ילה pgc-1α, dpgc-1, ומקדם השפלה חלבון dpgc-117. מיקרוסקופ אלקטרוני ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים מטבולית באמצעות Drosophila ילה כמודל חייב לקחת בחשבון את הרקע הגנטי, דיאטה, ותחזוקה של מניות של זבובים18. כדי למנוע את ההשפעות של רקעים גנטיים שונים על המדידה של פעילות ציטראט סינתז, זנים שונים של דרוסופילה צריך להיות מוצלב למתח שליטה עבור 10 דורות. הרקע הגנטי של כל הזנים Drosophila ילה בשימוש בניסויים שלנו הוא w1118, אז השתמשנו w1118 כפקד. באופן כללי, אנו חושבים w1118 הוא שליטה טובה, כפי שהוא הרקע הגנט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים מן הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (31401013 ו 31471010), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי, שנגחאי Pujiang התוכנית (14PJ1405900), והקרן למדעי הטבע של שנגחאי (19ZR1446400).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיניל]חומצה אתנסולפונית (HEPES)סיגמא-אולדריץ'
-(הידרוקסימתיל)-1,3-פרופנדיול (בסיס טריזמה)סיגמא-אולדריץ'V900483
אצטיל-CoAסיגמא-אולדריץ'A2181
חומצה דיתיו-ביס-ניטרובנזואית (DTNB)סיגמא-אולדריץ'D8130
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichV900106
OxaloacetateSigma-AldrichO4126
גלולה עליSangonF619072
גלולה עלי מנועTiangenOSE-Y10
קורא צלחותBioTekEon
חלבון BCA ערכת בדיקהBeyotimeP0010S
מספרייםWPI14124
טריטון X-100סנגוןA110694-0100
V900477-2-אמינו-2

מקורות

  1. Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
  2. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
  3. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  4. Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).
  5. Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
  6. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
  7. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984(2014).
  8. Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
  11. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
  12. Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).
  13. Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).
  14. Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
  15. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
  16. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
  17. Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
  18. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  19. Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.