מאמר שיטה

הכנה ויישום של ביוסנסור בקטריאלי חדש לאיתור שוערת של שאריות ירי

DOI:

10.3791/59471

⸱

9 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מוצג באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטי כדי לסנתז סט של חיישנים ביולוגיים לניתוח שאריות ירי, כדי לבדוק את תפקוד המכשירים לשימוש המיועד שלהם באמצעות ספקטרוסקופיית הזריחה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbocop הוא ביוסנסור כי תוכנן עבור יישום ייחודי בכימיה משפטית. MicRoboCop היא מערכת מורכבת משלושה מכשירים כי, כאשר משתמשים יחד, יכול להצביע על נוכחות של שאריות ירי (GSR) על ידי הפקת אות פלואורסצנטית בנוכחות של שלושה אנליטים מפתח (אנטימון, עופרת, ורכיבים אורגניים של GSR). הפרוטוקול מתאר את הסינתזה של הביוחיישנים באמצעות es, coli קולי (E. coli), ושיטות הכימיה האנליטיות המשמשות להערכת הסלקטיביות והרגישות של החיישנים. תפקוד המערכת מוצג באמצעות GSR שנאסף מתוך מעטפת מחסנית בילה. ברגע שהוכן, הביוחיישנים ניתן לאחסן עד הצורך, והוא יכול לשמש כמבחן עבור אלה מקשים מנתחי. תגובה חיובית של כל שלושת האנליטים מספק בדיקה חיובית שוערת עבור GSR, בעוד כל מכשיר בודד יש יישומים לגילוי האנליטים בדגימות אחרות (למשל, גלאי להוביל זיהום מים שתייה). המגבלה העיקרית של המערכת היא הזמן הנדרש עבור אות חיובי; עבודה עתידית עשויה להיות כרוכה בלימוד אורגניזמים שונים כדי למטב את זמן התגובה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביוסנסור הוא כל מכשיר אנליטי המשתמשת ברכיבים ביולוגיים (כגון חלבונים, חומצות גרעין, או אורגניזמים שלמים) המייצרים תגובה כי ניתן להשתמש לאיתור חומר כימי או מכשיר. כדוגמה, תעשיית כריית הפחם בשימוש ביוסנסור עבור הרבה של המאהה -20 כדי לזהות את הנוכחות של גזים רעילים מוקש: הקנרית במכרה פחם1. תגובת האורגניזם הביולוגי (מוות או מצוקה) לאנליטה כימית (פחמן חד-חמצני) נצפתה על ידי הכורים כדי להגן על העובדים. בדוגמה מודרנית ומתוחכמת יותר, ניתן לשנות חיידקים באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטית כדי להגיב לנוכחות של משתמש כימי מסוים על ידי המציגות תגובה ספציפית, כגון ביטוי של חלבון פלורסנט.

ביולוגיה סינתטית היא מונח רחב המתי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: סינתזה של E. coli המבטא rfp מוצג.

1. הכנת ה-DNA פלמיד מ E. coli

  1. הפשרת e. coli המכיל פלבין עם גן rfp וגנים אמפיצילין התנגדות ולגדול E. Coli על לוריא ציר (LB) אגר לוחות המכילים 100 μg/ML אמפיצילין ב 37 ° צ' עבור 24 h. לדוגמה, השתמשו בJ10060 פלמיד מהרישום של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים המשמשים לביולוגיה סינתטית (ראו טבלת חומרים). פלאביניים J10060 כולל גן RFP (חלבון פלורסנט אדום) תחת שליטה של אזור מקדם pBad ו גן התנגדות אמפיצילין. לחילופין, להפוך את E. coli (להתייחס לשלב 3.2) עם הפלסמיד לפני הצמיחה על לוחות LB אגר.
  2. בצע את פרוטוקול miniprep רגיל (ראה טב....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרום של קרינה פלואורסצנטית עבור משתנה RFP המשמש בעבודה זו מוצגים באיור 2. נתונים אלה הם מן PbRFP המכשיר כפי שהוא מגיב להוביל ואת TNT-RFP המכשיר כפי שהוא מגיב לשני אנליטים, 2, 4-DNT ו 1, 3-DNT. איור זה מציג את הספקטרום של שליטה שלילית (לא הוסיף אנליטה), ואת ספקטרום בשתי רמות שונות של אנליטה הוסיף. האות המקסימלי הפלואורסצנטית עבור המשתנה RFP בשימוש נצפתה ב 575 nm (עירור אורך הגל 500 nm). הנתונים באיור 3 מייצגים של ניסוי טיטור בודד (ולכן לא כלולים קווי שג.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים ופתרון בעיות

ניתן לשנות את הניסוי המתואר בטבלה 4 בכל דרך המתאימה לחיישנים שעוצבו. ההיבט החשוב ביותר של החיישן הכימי הוא להעריך את רגישותו ואת הספציפיות. זה מועיל כדי להבטיח כי מגוון רחב של ריכוזים של האנליטה מנותח כדי לקבוע את מגוון אנליטי שימושי של החיישן. כדאי גם לקבוע רמה מקסימלית של אנליטה עבור התאים. בגלל האנליטים המשמשים במחקר זה הם רעילים מתכות (Pb ו-Sb) או תרכובות אורגניות בפתרון מתנול (עבור נגזרות TNT), יש רמה העליון שבו מוות תאים בשל רעילות ש.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להכיר את התלמידים באוניברסיטת Longwood ב BIOL 324 (גנטיקה) והסטודנטים בכימיה 403 (פתרון בעיה כימית מתקדמת מעבדה) אשר היו מעורבים הכנה הראשונית ובדיקות של אנטימון וחיישנים ביולוגיים עופרת. הרעיון של MicRoboCop היה שנוצר ב-GCAT SynBIO הסדנה (קיץ 2014), אשר ממומן על ידי NSF והווארד יוז המכון הרפואי מתארח על ידי אוניברסיטת מרילנד בבולטימור קאונטי. המחברים גם להכיר מימון שהתקבלו באוניברסיטת Longwood המכללה לאמנויות ומדעים ומענק GCAT SynBio בוגרים.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,3-דיניטרובנזן, 97%אולדריץ'D194255-25 גרם
2,4-דיניטרוטולואן, 97%אולדריץ'101397-5G
אגרפישר סיינטיפיקBP1423-500
אמפיציליןפישר סיינטיפיקBP1760-5
אנטימון, תמיסה סטנדרטית ייחוס (1000 עמודים לדקה ± 1%/מוסמך)פישר סיינטיפיקSA450-100תקן במאגר חכם מדולל HNO3
CutNew England BioLabsB7204S
דופלקס מאגרמשולב DNA טכנולוגיות11-01-03-00
אנזים הגבלה EcoRI-HFניו אינגלנד BioLabsR3101S
אתנול, דרגת HPLC,Acros OrganicsAC611050040ממיסים אינם צריכים להיות בדרגת HPLC, ACS או דרגת ריאגנט יעבדו.
ערכות ריצוף DNA של Eurofins Genomics SimpleSeqEurofins GenomicsSimpleSeq Kit פריימר קדימה סטנדרטי
עבור מושבה PCRטכנולוגיות DNA משולבות5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'
פריימר קדימה לריצוף DNAטכנולוגיות DNA משולבות5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
IBI Science במהירות גבוהה פלסמיד מיני-קיטIBI ScientificIB47101
LB מרק, מילרפישר סיינטיפיקBP1426-500
עופרת, פתרון סטנדרטי ייחוס (1000ppm ± 1%/מוסמך)Fisher ScientificSL21-100Standard בניקוי חד פעמי מדולל HNO3
LeadOff ומגבוני דקוןHygenall45NRCNנמכר במיכלים או עטוף בנפרד, כל מגבון על בסיס אלכוהול יעבוד.
מתנול, HPLC כיתהפישר סיינטיפיקA452-4ממיסים אינם צריכים להיות בדרגת HPLC, ACS או דרגת ריאגנט יעבדו.
NEB 5-alpha מוכשר E. coli תאיםניו אינגלנד BioLabsC2987I
NheI-HF אנזים הגבלהניו אינגלנד BioLabsR3131S
מים ללא נוקלאזניו אינגלנד BioLabsB1500S
OneTaq 2X Master Mix עם מאגר סטנדרטיניו אינגלנד BioLabsM0482S
פלסמידים מרישום החלקים הביולוגיים הסטנדרטיים המשמשים לביולוגיה סינתטיתרישום של חלקיםhttp://parts.igem.org/Main_Page
רצפי מקדםטכנולוגיותמקדם Sb: 5'-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGAACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5'
מקדם Pb: 5'-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5'
מקדם TNT: 5 אינץ' GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATGATCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3'
3' CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTTAATTAACTTAA
GCGTA5'
פריימר הפוך לטכנולוגיותDNA משולבות5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'
פריימר הפוך לריצוף DNAטכנולוגיות DNA משולבות5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'
T4 DNA Ligaseניו אינגלנד BioLabsM0202S
מפורק ביולוגיים סטנדרטיים DNA משולבות PCR של מושבה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
  2. The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
  3. Roda, A., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Escherichia coli

מאמרים קשורים