מאמר שיטה

לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59490

⸱

3 באפריל 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

במאמר זה

סיכום

שיטה של הכנת הדוגמא פותחה כדי להתאים coculture תאים ורקמות לזהות מולקולה קטנה exchange באמצעות ספקטרומטר מסה הדמיה.

תקציר

הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS) באופן שגרתי הוחלה על שלושה סוגים של דוגמאות: מקטעי רקמת spheroids, מושבות חיידקים. סוגי דגימה אלה יש נותחו באמצעות לייזר בסיוע מטריקס (MALDI-TOF MS) ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה desorption/יינון להמחיש את ההפצה של חלבונים, ליפידים ו מטבוליטים מעבר הדגימה הביולוגי של עניין. פיתחנו שיטה הכנה מדגם רומן המשלב את נקודות החוזק של היישומים הקודמת שלוש לפנות בגישה כשתפסעו לצורך זיהוי תקשורת כימית ב סרטן, על ידי זריעה בתרבית של תאים מהונדסים לתוך agarose ב coculture עם רקמות בריא ואחריו לייבוש של המדגם. בתרבית של רקמות ותאים cocultured בסמיכות המאפשר תקשורת כימית באמצעות דיפוזיה בין רקמת תאים. בנקודות זמן מסוימות, המדגם מבוססי agarose הוא מיובש באותו אופן כמו מושבות חיידקים מוכן לניתוח IMS. השיטה שלנו פותחה על מודל התקשורת בין סרטן השחלות הצפק כיתה גבוהה, נגזר החצוצרה כמו זה מקיים אינטראקציה עם השחלה במהלך גרורות. אופטימיזציה של הכנת המדגם הביאו הזיהוי של נוראדרנלין בתור מרכיב כימי מפתח microenvironment השחלות. פיתח שיטה זו ניתן ליישם מערכות ביולוגיות אחרות הדורשות הבנה של תקשורת כימית בין תאים סמוכים או רקמות.

מבוא

הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS) מוטבה כדי לאפיין את התפוצה המרחבית של תכונות מולקולרית ב שלושה יישומים בשימוש נרחב: פרוסות רקמות, spheroids ומושבות חיידקים1,2,3. פרוסות רקמות ניתן להעריך הלוקליזציה של מטבוליטים בהקשר של תנאי ביולוגי מחשב מארח, ממוקד או untargeted בתוך טווח מסוים המוני. עם זאת, הבדלים בין התכונות מולקולרית הם הכי משמעותי, ברור כאשר רקמה בריאה לעומת מצב חולני, לדוגמה, גידול. גישה זו IMS הוא מותאם במיוחד זיהוי סמנים למחלת, עם זאת, רכישת דגימות רקמה בשלבים דיסקרטית בהתקדמות המחלה (כגון ציונים הגידול) מונע זיהוי אותות יכול להיות חשוב לטקס החניכה של המחלה. חילופי מידע דר....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים היו בהתאם מוסדות לאומיים של בריאות להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרה על ידי הוועדה על עצמך (IACUC) ושימוש חיה מוסדיים ב אוניברסיטת אילינוי בשיקגו.

1. הכנת נוגדנים

  1. לשמור על תאים אפיתל מאתר oviductal (מו) ב 37° C עם 5% CO2 ב חממה humidified בתקשורת אלפא מינימום הכרחי בינוני (αMEM), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין, אינסולין 10 מ"ג/מ"ל, transferrin, סלניום (ITS) , 1.8 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין gentamycin 1 מ"ג/מ"ל, אסטרדיול 18.2 ng/mL-17β. . תעביר את התאים כל 3-4 ימים, הבטחת שישנם מספיק תאים באותו יום העכברים יוקרב.
  2. להכין 2% ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שקופית מיובשים בצורה אופטימלית איטו תגרום מדגם מיובש שטוח עם מינימלי אין קמטים על פני השטח של agarose ושל חלקים agarose לשמור על הפרדה מרחבית על השקופית (איור 3). איור 3A מראה ייבוש אופטימלית, בעוד דמות 3B מראה הקמטים שיש להימנע. מיטוב זה דורש זהירות ניטור של השקופית בתנור, כמו באותו הזמן יכול להשתנות בהתאם ללחות יחסית. בעוד קמטים מעט יכול להשפיע על הגובה, ולכן דיוק מסת השמ אותות, קמטים קלים לא תשפיע.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש גופה הגוברת של ראיות שמסבך את התפקיד של נוראדרנלין HGSOC12,17,18, טכניקה זו תרמה מכניסטית יותר מידע. עם תנאים ביולוגית לפחות שמונה קיים על השקופית אותו, השיטה יכולה להתחשב ביולוגית פקדים כגון ג'ין, ירידה לפרטים תא, כמו גם הפקדים מדיה IMS יחיד להפעיל. בעוד השיטה היה מותאם להעריך החליפו מולקולות קטנות במודל של גרורות הראשי ב HGSOC, תא כלשהו או סוג הרקמה ניתן להציב אותם agarose. הרבה כדי לנתח מגוון רחב של שאלות ביולוגיות ועם מצב.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף

תודות

מימון סופק על ידי האיחוד ביו שיקגו עם תמיכה מקרנות סרל ב שיקגו הקהילה הקרן (C-076) (L.M.S.); אוניברסיטת אילינוי בשיקגו הפעלה קרנות (L.M.S.); מענק 543296 של הברית הקרן לחקר סרטן השחלות (רופאה); UG3 ES029073 (J.E.B.), על ידי המרכז הלאומי עבור קידום Translational מדעי, המכון הלאומי לבריאות, דרך גרנט UL1TR002003 (ג'ב & LMS).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות פלקון 15 מ"לדנווילC1017-Oלאיסוף תאים
תא 8 בארות (תא שקופיות Millipore EZ)MilliporePEZGS0816ייעוד מחדש משקופית תא Millipore Millicell EZ-slide
AcetonitrileSigma-Aldrich34998-4Lממס למטריצה מרוססת
אלפא מינימום מדיום חיוני (ואלפא; MEM)פישר10-022-CVמדיה תרבית תאים
מהירות Autoflex MALDI-TOF LRFBrukerלניתוח נתוני IMS
צנטריפוגהEppendorf5810 Rלאיסוף תאים והסרת
מטריצת CHCABruker Daltonic 8201344מטריקס מרוסס על שקופית מיובשת
מטריצת DHB BrukerDaltonic 8201346מרוססת על שקופית
מיובשת אזמל חד פעמיפישר22-079-707להסרת השחלות
מספריים לכריתתפישר13-804-6להסרת השחלות
DMEM MediaGibco11995-065מדיה מעורבבת עם
גורם גדילה אפידרמליPeprotech Inc.100-15תוסף מדיה לתרבית תאים
צינורות אפנדורףGenesee Scientific22-282עבור agarose aliquots
Estradiol-17 βSimga-AldrichE2758תוסף מדיה לתרבית תאים
סרום בקר עוברידנווילfb5001תוסף מדיה לתרבית תאים
FlexControl 3.4Bruker DaltonicIMS תוכנת רכישת נתונים
FlexImaging 4.1Bruker Daltonicתוכנת ניתוח נתונים IMS
מלקחיים (בסדר)Fsiher22-327379להסרת שחלות
GentamycinCellgro30-005-CRתוסף מדיה לתרבית תאים
אינסולין, טרנספרין, סלניום (ITS)Sigma-Aldrich11074547001תוסף מדיה לתרבית תאים
שקופית מצופה ITOBruker8237001פלטפורמה לדגירה
L-15 MediumGibco11415064בשימוש במהלך הרקמה דיסקציה
L-גלוטמיןGibco25030-081תוסף מדיה לתרבית תאים
אגרוז נמסנמוך Sigma-AldrichA9414-10Gמעורבב עם מדיה לציפוי
אגן מדיהCorning4870משמש לחיתוך מחיצות פלסטיק לתאים מחולקים
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122תוסף
מדיה לתרבית תאיםכיול פפטיד סטנדרטיBruker Daltonic8206195קליבר לטווח מסה בינוני
Phophorus redSigma-Aldrich343-242-5GCalibrant לטווח מסה נמוך
SCiLS Lab 2015Bruker Daltonicנתוני IMS ניתוח סטטיסטי
מלקחיים כירורגיים (קהים)פישר08-875-8Bלהסרת השחלות
TFAפישר טכנולוגיותA116-50נוספו לפתרון מטריצה
TM מרססHTX טכנולוגיותליישום מטריצה
אגרוז משותפת Media של לייבוביץ

מקורות

  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MALDI TOF MS

מאמרים קשורים