לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

סיכום

שיטה של הכנת הדוגמא פותחה כדי להתאים coculture תאים ורקמות לזהות מולקולה קטנה exchange באמצעות ספקטרומטר מסה הדמיה.

תקציר

הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS) באופן שגרתי הוחלה על שלושה סוגים של דוגמאות: מקטעי רקמת spheroids, מושבות חיידקים. סוגי דגימה אלה יש נותחו באמצעות לייזר בסיוע מטריקס (MALDI-TOF MS) ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה desorption/יינון להמחיש את ההפצה של חלבונים, ליפידים ו מטבוליטים מעבר הדגימה הביולוגי של עניין. פיתחנו שיטה הכנה מדגם רומן המשלב את נקודות החוזק של היישומים הקודמת שלוש לפנות בגישה כשתפסעו לצורך זיהוי תקשורת כימית ב סרטן, על ידי זריעה בתרבית של תאים מהונדסים לתוך agarose ב coculture עם רקמות בריא ואחריו לייבוש של המדגם. בתרבית של רקמות ותאים cocultured בסמיכות המאפשר תקשורת כימית באמצעות דיפוזיה בין רקמת תאים. בנקודות זמן מסוימות, המדגם מבוססי agarose הוא מיובש באותו אופן כמו מושבות חיידקים מוכן לניתוח IMS. השיטה שלנו פותחה על מודל התקשורת בין סרטן השחלות הצפק כיתה גבוהה, נגזר החצוצרה כמו זה מקיים אינטראקציה עם השחלה במהלך גרורות. אופטימיזציה של הכנת המדגם הביאו הזיהוי של נוראדרנלין בתור מרכיב כימי מפתח microenvironment השחלות. פיתח שיטה זו ניתן ליישם מערכות ביולוגיות אחרות הדורשות הבנה של תקשורת כימית בין תאים סמוכים או רקמות.

מבוא

הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS) מוטבה כדי לאפיין את התפוצה המרחבית של תכונות מולקולרית ב שלושה יישומים בשימוש נרחב: פרוסות רקמות, spheroids ומושבות חיידקים^1,2,3. פרוסות רקמות ניתן להעריך הלוקליזציה של מטבוליטים בהקשר של תנאי ביולוגי מחשב מארח, ממוקד או untargeted בתוך טווח מסוים המוני. עם זאת, הבדלים בין התכונות מולקולרית הם הכי משמעותי, ברור כאשר רקמה בריאה לעומת מצב חולני, לדוגמה, גידול. גישה זו IMS הוא מותאם במיוחד זיהוי סמנים למחלת, עם זאת, רכישת דגימות רקמה בשלבים דיסקרטית בהתקדמות המחלה (כגון ציונים הגידול) מונע זיהוי אותות יכול להיות חשוב לטקס החניכה של המחלה. חילופי מידע דרך החלל הוא תכונה בכל מקום של מערכות ביולוגיות רבות, רקמות פרוסות אינה יכולה ללכוד את ממסר כימי דינמי. טכניקה אחת המסוגלת להמחיש כימי exchange ודיפוזיה היא IMS של מושבות חיידקים גדל על פלטות אגר; מולקולות קטנות מסוגלים לנטרל את דרך ומעבר של אגר, ניתן ללכוד באמצעות ספקטרומטר מסה לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI-TOF)⁴. תוכנית התקנה זו הצמיחה יכול לשמש כדי לזהות מולקולות המוחלפות בין ישויות ביולוגיות דיסקרטית (מושבות), באפשרותך גם לקבוע כיוון מטבוליט הייצור. פלטפורמת תוכנן במקור לצמיחה מושבת חיידקים הותאם לחקור את חילוף החומרים העיקרי של רקמות explants גדל עם בתרבית של תאים, IMS שימש כדי להעריך את ההחלפה כימי דינמי במערכת יונקים במבחנה.

מספר השנים האחרונות, הוא הפך ברור כי ציון גבוה סרטן שחלות נסיובי (HGSOC) לעיתים קרובות מהכנסותיהן האפיתל החצוצרה (FTE) ואז מתפשט השחלה במהלך בתחילת המחלה פיתוח^{5,6, 7 , 8}. הסיבה tumorigenic FTE תאים התפשט אל השחלה, איפה גידולים גדולים בסופו של דבר יוצרים, גרורות נוספות, ברור כעת. מחקרים קודמים התמקדה התפקיד של חלבונים השחלות ב ראשי גרורות אל השחלה; עם זאת, זה לאחרונה הוכח כי המעבר בריאה טישו tumorigenic גורמת הרס גדול של חילוף החומרים הסלולר ומשנה את הייצור של מולקולות קטנות^9,10,11. לכן, אנחנו שיערו כי מולקולות קטנות המוחלפות בין FTE את השחלה עשויים להיות אחראים חלקית גרורות העיקרי של HGSOC.

באמצעות הליך IMS פיתח שלנו, יש לנו נחוש כי coculture של tumorigenic FTE ורקמות השחלות בריא גורם הייצור של נוראדרנלין מן השחלה. עם זאת, תאים נורמליים FTE או סוגי תאים אחרים לא זכה אפקט זה. יתרון יוצאת דופן של שיטה זו הוא כי ניתן לאבחן את הייצור המולקולרי ואת חילופי אותות המייצגים מולקולות אמיתי, כך גם ב- coculture זה אפשרי לקבוע את מקור האות. נמצא יתרון על פני ניתוח דוגמאות הומוגני, כל המידע המרחבי אבוד. במערכת מודל שלנו, היינו יכולים להקצות באופן ברור את הייצור של נוראדרנלין השחלה. נוראדרנלין נקשר גרורה של chemoresistance של סרטן השחלות, שלנו זיהוי של מולקולה זו אומתה כי השיטה IMS הרומן יכול לחשוף מולקולות ביולוגית רלוונטית^{12,13, 14}. אימות זה מאפשר לנו להציע כי היישום החדש הזה של IMS יכול להיות שימושי במיוחד למחקר קבוצות אשר מנסים לזהות מולקולות קטנות בסביבות coculture, כדי להבין בתחילת האירועים המשפיעים על טרנספורמציה תא גרורות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להבהיר את הזהות ואת התפוצה המרחבית של מולקולות קטנות במהלך חילופים בין רקמות ואיברים, המיוצג על-ידי במבחנה תרביות תאים תלת-ממד או רקמות ex-vivo .

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים היו בהתאם מוסדות לאומיים של בריאות להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרה על ידי הוועדה על עצמך (IACUC) ושימוש חיה מוסדיים ב אוניברסיטת אילינוי בשיקגו.

1. הכנת נוגדנים

1. לשמור על תאים אפיתל מאתר oviductal (מו) ב 37° C עם 5% CO₂ ב חממה humidified בתקשורת אלפא מינימום הכרחי בינוני (αMEM), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין, אינסולין 10 מ"ג/מ"ל, transferrin, סלניום (ITS) , 1.8 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין gentamycin 1 מ"ג/מ"ל, אסטרדיול 18.2 ng/mL-17β. . תעביר את התאים כל 3-4 ימים, הבטחת שישנם מספיק תאים באותו יום העכברים יוקרב.
2. להכין 2% agarose על ידי ערבוב 1g של התכה נמוכה agarose עם 50 מ ל מים מזוקקים. אוטוקלב agarose, להתקרר ולאחר מכן aliquot (1 מ"ל) ב- 2 mL צינורות (ראה טבלה של חומרים) לפני עפור agarose. Agarose ניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.
3. להכין לפחות 2 מ"ל של מדיה בינוני (DMEM) שונה הנשר של Dulbecco x 1.
4. עבור המטריצה עבור MALDI-TOF MS, להכין 10 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל חומצה אלפא-cyano-4-hyroxycinnamic 1:1 (CHCA): חומצה dihydroxybenzoic (DHB) (ראה טבלה של חומרים) 90:10 ACN:H₂O + 0.1% חומצה trifluoroacetic (TFA). Sonicate פתרון עד מטריקס היא התפרקה.

2. עכבר המושבה והסרה השחלה

1. לשמור על זוגות של עכברים CD-1 באמצעות הליכים דיור סטנדרטית. ליד מיום parturition, לבדוק אם העכברים כל יום כך גיל הגורים ידוע.
2. המתת חסד הגורים 16 – 18 ימים של גיל באמצעות אינהלציה₂ CO לפי הנחיות NIH. לספק CO₂ (100%) זרם בשיעור של 10% – 20% קאמרית נפח לדקה, במשך שתי דקות. אחרי נשימה נפסק. לאשר המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
3. לחטא כל הציוד הכירורגי על ידי השוקע 70% אתנול. לחמם את המדיה L-15 של ליבוביץ עם פניצילין 1 x-סטרפטומיצין כדי 37 מעלות צלזיוס.
4. פני השטח בטן עם 70% אתנול לחטא את האזור ולצמצם זיהום עם שיער רטוב. תפיסתו העור המכסה את דופן הבטן באמצעות מספריים כירורגיים בוטה מלקחיים והשימוש כדי להפוך גדול V-צורה לחתוך העור, דופן הבטן, לחשוף את האיברים הפנימיים.
5. העבר האיברים הפנימיים בצד באמצעות מלקחיים. בנפרד לתפוס כל קרן הרחם עם מלקחיים בסדר והרם מעט.
6. אתר השחלה, אשר יהיה בסוף הקרן הרחם, מיד מתחת הכליה. השתמש מספריים כירורגיים כדי לנתח את השחלה חינם של רקמת חיבור. לאחר מכן, לחצי הקרן השחלות.
7. להזיז את השחלה, oviduct ואחד כ חצי של כל קרן הרחם למדיה L-15 של ליבוביץ ומחוממת מראש.
8. תחת מיקרוסקופ ויבתר להעביר בזהירות כל השחלה בורסה שמסביב, פינוי זה את oviduct, בורסה, כל רקמת שומן. להעביר את השחלה כל תבשיל חדש של התקשורת L-15 של ליבוביץ.
9. לחצי כל השחלה axially. לשמור את החלקים השחלות (נקרא עכשיו explants) שמרו ב 37 ° C עד ציפוי של agarose.

3. הגדרת ו המקננת השקופית שטופלו איטו עבור Cocultures

1. Cocultures המלאה
   1. ' נזילות ' את agarose-70 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.
   2. מקם את המפריד 8-ובכן מעל tinoxide אינדיום (ITO)-מטופלים שקופית (איור 1 א'). לתחתית גומי על המחיצה מסייע אדהזיה לשקופית, אך הקפד להחיל רציפה לחץ כלפי מטה בעדינות במהלך agarose יופיצ כדי להבטיח לא דולף או ערבוב בין בארות.
   3. איסוף תאים צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה (5 דקות במהירות של 800 סל ד), resuspend ל 50k תאים לכל µL 150 בתקשורת x DMEM 1. אם צפיפות התאים היא אופטימלית, ודא כי בשלב זה הוא התליה תא 2 x צפיפות הסופי הרצוי (למשל, עבור ריכוז סופי של 50,000 תאים ב- 300 µL, צפיפות התאים בשלב זה הוא 50,000 תאים 150 µL).
   4. לפני ציפוי תרבית תאים, להוסיף explant השחלות למרכז באר (איור 1B).
   5. להוסיף agarose לכל תרבית תאים בודדים mL 2 צינורות לפני ציפוי. כל טוב, לשלב µL 200 של השעיה תא ו- 200 µL של agarose נזיל צינור 2 מ"ל. לדוגמה, עבור מארבע בארות לשלב 800 µL של השעיה תא µL 800 של 2% agarose. תערובת יישאר, אבל גורם הכרחי מעט יותר מונע בועות אוויר במהלך pipetting.
      1. להוסיף agarose תרביות תאים בודדים מיד לפני ציפוי הזה תרבית תאים. Agarose מגניב בתוך פחות מדקה, וכדאי להתכונן צלחת במהירות.
   6. מיד להוסיף 300 µL של תערובת תא/agarose כל טוב (איור 1C). איור 1C מציג שלושה תנאים התא ובכל תנאי מדיה אחד, שכל אחד מצופה עם ובלי שחלה.
   7. דגירה שקופיות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב חממה humidified.
2. Cocultures חצויה.
   1. חותכים חוצצים מפלסטיק דק, חלקה (איור 2 א).
      הערה: הניסוי הזה משתמש את הצדדים של אגן מדיה חד פעמי סטרילי כי הם שטוחים ודקים. חותכים אותם רחב מספיק כדי להתאים בקלות לכף היתר של הבאר (~ 13 מ מ).
   2. ' נזילות ' את agarose-70 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.
   3. מקם את המפריד 8-טוב על גבי השקופית שטופלו איטו (איור 2B). לתחתית גומי על המחיצה מסייע אדהזיה לשקופית, אך הקפד להחיל רציפה לחץ כלפי מטה בעדינות במהלך agarose יופיצ כדי להבטיח לא דולף או ערבוב בין בארות.
   4. איסוף תאים צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה (5 דקות במהירות של 800 סל ד), resuspend ל 50k תאים לכל µL 150 בתקשורת x DMEM 1. אם צפיפות התאים הוא אופטימלי, ודא כי בשלב זה התליה תא 2 x צפיפות הסופי הרצוי (למשל עבור ריכוז סופי של 50,000 תאים 300 µL, צפיפות התאים בשלב זה הוא 50,000 תאים 150 µL).
   5. הכנס חוצצים פלסטיק באלכסון וולס (איור 2C).
   6. להוסיף agarose כל השעיה תא אחד בכל פעם לפני ציפוי. כל טוב, לשלב 100 µL תא השעיה, µL 100 של agarose נזיל צינור 2 מ"ל. לדוגמה, עבור מארבע בארות לשלב µL 400 של תרבית תאים µL 400 של 2% agarose. תערובת תא/agarose יישאר אבל גורם הכרחי מעט יותר מונע בועות אוויר במהלך pipetting.
      1. להוסיף agarose תרביות תאים בודדים מיד לפני ציפוי הזה תרבית תאים. Agarose מגניב בתוך פחות מדקה, וכדאי להתכונן צלחת במהירות.
   7. בצד אחד של המחיצה, צלחת 150 µL תערובת תא/agarose. לאפשר agarose מגניב, לחזק (בערך דקה אחת), אז הסרה של הקו המפריד (איור דו-ממדי).
   8. מקום explant השחלה במרכז החצי הריקה של הבאר. במקום 150 µL תערובת מדיה/agarose מעל של השחלה, ולא רק על הצד הנכון של הבאר (2E איור).
   9. דגירה שקופיות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב חממה humidified.

4. ייבוש שקופית והכנת MALDI-TOF MS

1. אחרי ארבעה ימים (או בכל נקודת זמן מועדף), הסר את המפריד קאמרית השתלים agarose, השקופית (איור 1D). בעדינות לנתק את צידי agarose מן החדר עם מרית שטוחה ומשוך בעדינות את התא כלפי מעלה, נזהר לא לזוז כל אטמי agarose. אם הם יזוזו בעדינות מיקום אותם כך הם לא נוגעים אחד בשני.
2. מקם את השקופית בתנור 37 מעלות צלזיוס במשך כ- 4 שעות, סיבוב 90 מעלות כל h.
   הערה: הסיבוב של השקופית חשוב להבטיח הפצה חימום לאורך כל המדגם.
3. לאחר יבש, להסיר את השקופית מן התנור (איור 1E).
4. להחיל מטריקס פתרון באמצעות המרסס (איור 1F), עם הפרמטרים הבאים: טמפרטורת = 30 ° C, קצב הזרימה = 0.2 מ ל/דקה, מספר עובר = 8, כיוון = CC, ו זרבובית מרחק = 40 מ מ.
   הערה: במקום ריסוס מטריקס, מברשת אמנותית אוויר יכול לשמש כדי להחיל מטריקס נוזלי. הפתרון מטריקס אותו יכול לשמש כדי לרסס, אך כ פתרון כפול נדרש. כאשר השקופית כשכרטיס כך זה נתקע אנכית, לרסס את השקופית מזווית 90° מ כ רגל אחת משם (Adapted הופמן¹⁵) עד המטריקס שכבה מוצגת.
5. להוסיף 1 µL של calibrant (זרחן אדום עבור מטרות < דא 500, תערובת פפטיד (ראה טבלה של חומרים) עבור מטרות < 5,000 Da) ברור ספוט בשקופית. זרחן אדום מחייב כל ערבוב עם מטריקס, אך התערובת פפטיד דורש תערובת 1:1 עם מטריקס לסייע יינון. חכו calibrant יבש.
6. לצייר X באמצעות סמן קבוע בכל פינה של השקופית וקח תמונה אופטי באמצעות מצלמה או סורק ברזולוציה של 1200 dpi.

5. הדמיה ספקטרומטר מסה קירור והקפאה

1. פתח רצף חדש על תוכנת ניתוח נתוני IMS (ראה טבלה של חומרים). הגדר את רוחב רסטר הרזולוציה המרחבית הרצויה, לפחות 50 מיקרומטר.
2. להעלות את התמונה האופטי של השקופית לתוכנה ניתוח וללמד קבע שלוש נקודות בעזרת של צמתים ב האיקסים נמשך בכל פינה.
3. לייעד אזורי עניין עבור הדמיה בתוכנה רכישה ותנו שם אותם בהתאם.
4. לכייל את המכשיר באמצעות התוכנה רכישת נתונים (ראה טבלה של חומרים) בתוך 5 ppm שגיאה.
5. להציל את שיטת אופטימיזציה ולהתחיל לרוץ. הניסוי הזה מיטבי בפרמטרים הבאים: קוטביות = חיובי, גלאי = Reflectron, לייזר גודל = 2, עוצמת הלייזר = 50%, המשקף רווח גלאי מצב = 3 x.

6. עיבוד נתוני IMS

1. ייבוא קובץ .mis לתוך תוכנה סטטיסטית (ראה טבלה של חומרים) לצורך ניתוח של משמעות.

תוצאות

שקופית מיובשים בצורה אופטימלית איטו תגרום מדגם מיובש שטוח עם מינימלי אין קמטים על פני השטח של agarose ושל חלקים agarose לשמור על הפרדה מרחבית על השקופית (איור 3). איור 3A מראה ייבוש אופטימלית, בעוד דמות 3B מראה הקמטים שיש להימנע. מיטוב זה דורש זהירות ניטור של השקופית בתנור, כמו באותו הזמן יכול להשתנות בהתאם ללחות יחסית. בעוד קמטים מעט יכול להשפיע על הגובה, ולכן דיוק מסת השמ אותות, קמטים קלים לא תשפיע...

דיון

יש גופה הגוברת של ראיות שמסבך את התפקיד של נוראדרנלין HGSOC^12,17,18, טכניקה זו תרמה מכניסטית יותר מידע. עם תנאים ביולוגית לפחות שמונה קיים על השקופית אותו, השיטה יכולה להתחשב ביולוגית פקדים כגון ג'ין, ירידה לפרטים תא, כמו גם הפקדים מדיה IMS יחיד להפעיל. בעוד השיטה היה מותאם להעריך החליפו מולקולות קטנות במודל של גרורות הראשי ב HGSOC, תא כלשהו או סוג הרקמה ניתן להציב אותם agarose. הרבה כדי לנתח מגוון רחב של שאלות ביולוגיות ועם מצב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות פלקון 15 מ"ל	דנוויל	C1017-O	לאיסוף תאים
תא 8 בארות (תא שקופיות Millipore EZ)	Millipore	PEZGS0816	ייעוד מחדש משקופית תא Millipore Millicell EZ-slide
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998-4L	ממס למטריצה מרוססת
אלפא מינימום מדיום חיוני (ואלפא; MEM)	פישר	10-022-CV	מדיה תרבית תאים
מהירות Autoflex MALDI-TOF LRF	Bruker		לניתוח נתוני IMS
צנטריפוגה	Eppendorf	5810 R	לאיסוף תאים והסרת
מטריצת CHCA	Bruker Daltonic 8201344		מטריקס מרוסס על שקופית מיובשת
מטריצת DHB Bruker	Daltonic 8201346		מרוססת על שקופית
מיובשת אזמל חד פעמי	פישר	22-079-707	להסרת השחלות
מספריים לכריתת	פישר	13-804-6	להסרת השחלות
DMEM Media	Gibco	11995-065	מדיה מעורבבת עם
גורם גדילה אפידרמלי	Peprotech Inc.	100-15	תוסף מדיה לתרבית תאים
צינורות אפנדורף	Genesee Scientific	22-282	עבור agarose aliquots
Estradiol-17 β	Simga-Aldrich	E2758	תוסף מדיה לתרבית תאים
סרום בקר עוברי	דנוויל	fb5001	תוסף מדיה לתרבית תאים
FlexControl 3.4	Bruker Daltonic		IMS תוכנת רכישת נתונים
FlexImaging 4.1	Bruker Daltonic		תוכנת ניתוח נתונים IMS
מלקחיים (בסדר)	Fsiher	22-327379	להסרת שחלות
Gentamycin	Cellgro	30-005-CR	תוסף מדיה לתרבית תאים
אינסולין, טרנספרין, סלניום (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	תוסף מדיה לתרבית תאים
שקופית מצופה ITO	Bruker	8237001	פלטפורמה לדגירה
L-15 Medium	Gibco	11415064	בשימוש במהלך הרקמה דיסקציה
L-גלוטמין	Gibco	25030-081	תוסף מדיה לתרבית תאים
אגרוז נמס	נמוך Sigma-Aldrich	A9414-10G	מעורבב עם מדיה לציפוי
אגן מדיה	Corning	4870	משמש לחיתוך מחיצות פלסטיק לתאים מחולקים
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140-122	תוסף
מדיה לתרבית תאיםכיול פפטיד סטנדרטי	Bruker Daltonic	8206195	קליבר לטווח מסה בינוני
Phophorus red	Sigma-Aldrich	343-242-5G	Calibrant לטווח מסה נמוך
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		נתוני IMS ניתוח סטטיסטי
מלקחיים כירורגיים (קהים)	פישר	08-875-8B	להסרת השחלות
TFA	פישר טכנולוגיות	A116-50	נוספו לפתרון מטריצה
TM מרסס	HTX טכנולוגיות		ליישום מטריצה