המטרה של פרוטוקול זה היא גנוטיפ של כלנית המים ne, שושנת הימים במהלך המאבק מבלי להקריב את העובר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
המתואר כאן הוא פרוטוקול ה-PCR כדי גנוטיפ העובר בשלב הגאולה של האנתוזואן לאחר הדלקת הקרום האנוטזיס מבלי להקריב את חיי החיה. בעקבות הפריה חוץ גופית ו-de-jellying, הזיטים מורשים להתפתח 24 שעות בטמפרטורת החדר כדי להגיע לשלב מוקדם עד באמצע הגאולה. העוברים הגאוטרולה מונחים לאחר מכן על מיטת ג'ל בצלחת פטרי המכילה מי ים. תחת מיקרוסקופ מבתר, מחט טונגסטן משמש בניתוח להפריד משבר רקמת הבורג מעובר כל. העוברים לאחר הניתוח מורשים להירפא ולהמשיך בפיתוח. דנ א גנומית מופק מרסיס רקמות מבודדים משמש כתבנית ל-PCR ספציפי לוקוס. ה-גנוטיפ ניתן לקבוע בהתבסס על גודל מוצרי ה-PCR או נוכחות/היעדרות של מוצרי PCR ספציפיים של allele. העוברים לאחר הניתוח ממוינים לאחר מכן לפי ה-גנוטיפ. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים שיוקרנו, אך הדבר מחייב את השעה 4 – 5 h. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות הסתרה מתוך אוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים ומאפשר ניתוח של פנוטיפים במהלך הפיתוח.
מבוא
החברה מייצגת קבוצה מגוונת של בעלי חיים הכוללים מדוזה, אלמוגים וכלניות ים. הם דיפלותקיעות, המורכב מעור ומעור, המופרדים על-ידי מטריצה מיגלנת (מזוגליא). Cנדבך היא קבוצת אחיות לסוגז בילוניה, שאליה מודלים מסורתיים של בעלי חיים כגון דרוסוהילה ומיוז שייכים ל- 1. בנוסף, הסטייה מהקטריה-בילוניה התרחשה בתקופה הקדם-קמברנית2. ככזה, מחקרים השוואתיים של בילנים ובילואים חיוניים לקבלת תובנות לגבי הביולוגיה של הקדמון המשותף העדכני ביותר שלהם. לאחרונה, גנומיקה השוואתית גילה כי הקטנים ו bilaterians חולקים הרבה גנים ערכת הכלים התפתחותיים כגון חריץ ו bhlh, רומז כי אבותינו המשותפים כבר היו אלה גנים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אינדוקציה של השאיפה, הפריה חוץ גופית , ו-דה-jellying
- שמירה על שלפוחית הזרע בתוך מי ים עם מליחות של 12 חלקים לאלף (ppt) בחשיכה ב -16 ° c, האכלה artemia מדי יום.
- ביום לפני הבהיית השראה, מניחים בעלי חיים בחממה בטמפרטורה ובשליטה קלה. לתכנת את החממה כך שבעלי החיים ייחשפו ל -8 מעלות של אור ב -25 ° c. אופציונלי: האכילו חתיכה קטנה (< 1 מ"מ3) של צדפה לבעלי חיים בודדים לפני הצבת אותם לתוך החממה כדי לשפר את ההשריץ.
- השאירו את החיות בחממה במשך 1 h ב -16 ° c.
- הסר את בעלי החיים מהאינקובטור והשאר אותם על שחקן ספסל עם אור בטמפרטורת החדר (RT) כדי לאפשר השאיפה. ההשמה מתרחשת בדרך כלל בתוך 1.5-2 h הבאה. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הגנום Ne, סטלה יש לוקוס יחיד המקודד חלבון מקודמן עבור GLWamide נוירופפטיד. שלוש הנוקאאוט של המוטציות בלוקוס זה (glw-a, glw-b, ו -glw-c) דווחו בעבר5. ארבעה זכרים heterozygous נושאת אלל פראי (+) ו הנוקאאוט אלל glw-cב glwamide לוקוס (גנוטיפ: +/glw-c) נחצה עם נקבה heterozygous נושאת אלל פראי ונוקאאוט שונים אלל glw-a באותו לוקוס (גנוטיפ: +/glw
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המתואר כאן פרוטוקול PCR על מנת גנוטיפ בודד העובר כלנית ים מבלי להקריב את החיה. הביצים המוופרות מורשות להתפתח בעקבות ההשאיפה והדה-מיולים. האזור הבורג של העובר כל גאורולה הוא הוסר בניתוח, ואת רקמת הבורג המבודד משמש להפקת DNA הבאים גנומית, בעוד העוברים שלאחר ניתוח שנותרו לרפא ולהמשיך בפיתוח. תמציות ה-Dna משמשות לצורך שיטת PCR כדי לקבוע את ה-גנוטיפ של כל עובר. שיטה זו מנצלת את היכולת של החצאים אוראלי של העובר כלנית הים לווסת ולפתח10,11, ואת רוב העוברים (> 90%) בדרך כ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. לסופר אין מה לגלות
תודות
אנו מודים לסוקרים אנונימיים על הערות על הגרסה המוקדמת של כתב היד, ששיפרו את כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת ארקנסו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Drosophila Peltier חממה מקוררת | Shellab | SRI6PF | משמש לאינדוקציה אינדוקציה |
| אינסטנט אוקיינוס מלח ים | מיידי אוקיינוס | 138510 | |
| ציסטות שרימפס מלח | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-ציסטאין הידרוכלוריד | סיגמא אולדריץ' | C7352 | |
| שייקר אורביטלי סטנדרטי, דגם 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | איכות ביולוגית | 351-007-01 | |
| אשלגן כלורי | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 תחליף | US ביולוגי | N3500 | |
| Proteinase K תמיסה (20 מ"ג/מ"ל), RNA כיתה | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| מחזיק מחט מיקרו חיתוך | Roboz | RS-6060 | |
| מחט ניתוח טונגסטן | Roboz RS-6063 | ||
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion פולימראז DNA בנאמנות גבוהה | ניו אינגלנד BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | ניו אינגלנד BioLabs | N0447L | |
| GLWamide פריימר | 5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3' | ||
| פריימר הפוך ספציפי ל-glw-a | 5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3' | ||
| פריימר הפוך ספציפי ל-glw-c | 5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3' |
מקורות
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
