פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מערכת תלת-ממדי תא צורב של צינור המרה extrahepatic העכבר. אלה organoids בכיס המרה יכול להישמר בתרבות ללמוד ביולוגיה cholangiocyte. Organoids בכיס המרה אקספרס סמנים של קדמון והן תאים בכיס המרה, המורכבת של תאי אפיתל מקוטב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
Cholangiopathies, אשר משפיעים על צינורות המרה extrahepatic (EHBDs), כוללים בהכנת בכיס המרה, מחלת כבד כרונית חסימתית ו- cholangiocarcinoma. להם אין אפשרויות טיפולית יעילה. כלים ללמוד EHBD מוגבלים מאוד. המטרה שלנו הייתה לפתח מודל ייחודיים, תכליתי למבוגרים, תאי גזע, נגזר, פרה cholangiocyte זה ניתן להפיק בקלות של פראי סוג ועכברים מהונדסים גנטית. לפיכך, אנו מדווחים על הטכניקה הרומן של פיתוח מערכת תרבות תא צורב (EHBDO) EHBD מ- EHBDs העכבר למבוגרים. המודל הוא חסכוניים, מסוגל בקלות להיות מנותח, ויש לו מספר יישומים במורד הזרם. באופן ספציפי, אנו מתארים את המתודולוגיה של העכבר EHBD בידוד, דיסוציאציה תא בודד, חניכה תרבות תא צורב, הפצת, ואת תחזוקה לטווח הארוך ואחסון. כתב יד זה מתאר גם EHBDO עיבוד אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של mRNA שפע כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית-PCR). פרוטוקול זה יש יתרונות משמעותיים בנוסף לייצור organoids EHBD ספציפיים. השימוש במדיום ממוזגים מתאי L-WRN מפחית באופן משמעותי את העלות של מודל זה. השימוש העכבר EHBDs מספק רקמות כמעט בלתי מוגבל לדור תרבות, בניגוד רקמה אנושית. העכבר שנוצר EHBDOs להכיל אוכלוסיה טהור של תאים אפיתל עם סמנים של קדמון endodermal והוא הבדיל תאים בכיס המרה. Organoids בתרבית לשמור על מורפולוגיה הומוגנית דרך מעברים מרובים, ניתן לשחזר לאחר אחסון לטווח ארוך של חנקן נוזלי. המודל מאפשר לחקר התפשטות תאים קדמון בכיס המרה, ניתן לטפל בנושא פרמקולוגית, וכן עלול להיווצר מתוך עכברים מהונדסים גנטית. מחקרים עתידיים נחוצים כדי למטב את תרבות תנאים על מנת להגביר את היעילות יופיצ, להעריך תא פונקציונלי בגרות ולאחר ישירה תאית התמיינות. פיתוח מודלים של תרבות משותפת, מטריצה חוץ-תאית נייטרלי יותר ביולוגית הם גם רצוי.
מבוא
Cholangiopathies הן הפרעות פרוגרסיבית כרונית חשוכת מרפא המשפיעים על תאים בכיס המרה ממוקם אינטרה - ו צינוריות המרה extrahepatic (EHBDs)1. Cholangiopathies מסוימים, כמו מחלת כבד כרונית חסימתית, cholangiocarcinoma, בהכנת בכיס המרה, ציסטות choledochal, משפיעים בעיקר על EHBDs. ההתפתחות של טיפולים cholangiopathies הוא מוגבל על ידי המוגבל של מודלים פרה. בנוסף, מחקרים קודמים התמקדו cholangiopathies המקובצים יחד: הכבד, אינטרה- ו EHBDs. עם זאת, אינטרה - EHBDs של מקור עובריים שונים והם יהיו, לכן, צריך להיחשב פתולוגיות מולקולרית ברורים. צינורות המרה intrahepatic להתפתח הלוחות ductal intrahepatic והחלק הגולגולת של הסעיף הכבד, EHBDs כל לפתח מן החלק סימטרית ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
1. הכנת ציוד וחומרים לבידוד EHBD העכבר
- להכין בינונית זריעה, מאגר כביסה (טבלה של חומרים) ב- 50 מ ל צינורות חרוט ולשמור אותם ב 4 ° C או על קרח עד השימוש.
- בצע כיוונון טבלה כירורגי (איור 1B). להכין כלי כירורגי סטיריליים (איור 1C).
- מניחים צלחת 24-ובכן סטרילי בחממה תרביות רקמה 37 ° C כדי לחמם אותה.
- במקום של aliquot של מטריקס במרתף על קרח. השתמש במרתף מטריקס רק כאשר זה הוא נוזלי לגמרי.
2. EHBD בי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול שלנו מתאר את הדור של העכבר EHBD organoids רקמות ספציפיות, מבוגר נגזר תאי גזע. לאחר organoids מתורבתים, ניתן לצפות מוקדם ככל 1 יום לאחר הבידוד EHBD צורה מבנה פיברוזיס. זיהום עם fibroblasts לא נצפית בדרך כלל בעת יצירת תרבות. EHBDO יופיצ יעילות הוא כ 2% כאשר מבודד neonatal או למבוגרים (שגילם חודשיים) עכברים (איור 2B). ציפוי היעילות של EHBD organoids נגזר עכברים בוגרים גדל ל- 11% מעבר 2, נשאר יציב (איור 2B). הרוב המכריע של o.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבודה זו מתארת את הדור של מודל תלת-ממדי organotypic של העכבר EHBD cholangiocytes. צעדים חשובים בדור תרבות EHBDO כוללים ניתוח קפדני EHBD כדי למנוע זיהום תא לבלב, תחזוקת בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום חיידקים ופטריות, מניפולציה זהיר לאחר צנטריפוגה כדי למנוע אובדן חומר הסלולר. הדבקות קרוב בתנאי טמפרטורה שתואר נדרש. ישנן כמה מגבלות על הטכניקה. EHBDs של עכברים בוגרים הם קטנים (כ- 1 מ מ בקוטר; איור 1E), אשר דורשים עדינות לבידוד. מיקרוסקופ ניתוח יכול לשמש כדי לסייע עם לנתיחה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האמריקאית את פרס מחקר של פסגת מחלות הכבד (ל. נ) מכוני הבריאות הלאומיים, במכון הלאומי של סוכרת ואת העיכול ומחלות כליה (פרסים P30 DK34933 נ, DK062041 P01 כדי J.L.M.). אנו מודים ד ר רמון Ocadiz-רואיז (אוניברסיטת מישיגן) על העזרה שלו עם פיתוח מתודולוגיה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>L-WRN תרבית תאים בינונית | |||
| מתקדמת DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| <חזק>מאגר כביסה | |||
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | 50 מ"ל | Life Technologies | 10010-023 |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| אמפוטריצין B | 6.25 ומיקרו; g/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| <חזק>מדיום תרבית אורגנואידית | |||
| L-WRN מדיום ממוזג | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| מתקדם DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-גלוטמין | 10 ומיקרו; l/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 ומיקרו; l/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 ומיקרו; l/mL | Gibco | 17502-048 |
| <חזק>מדיום זריעה אורגנואידי | |||
| מדיום תרבית אורגנואידית | |||
| גורם גדילה אפידרמיס (EGF) | 50 ננוגרם/מ"ל | Invitrogen | PMG8041 |
| גורם גדילה פיברובלסטים-10 (FGF10) | 100 ננוגרם/מ"ל | PeproTech | 100-26 |
| ><נוגדנים ראשוניים | |||
| אנטי-ציטוקרטין 19 (CK19), ארנב | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| אזור קביעת מין נוגדן Y-Box 9 (SOX9), ארנב | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| נוגדן תריסריון הלבלב 1 (PDX1), ארנב | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| נוגדן E-cadherin, עז | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| נוגדן אצטילציה ואלפא;-טובולין, עכבר | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| נוגדנים | |||
| 488 מתויג נגד ארנב, חמור IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 מסומן נגד עזים, חמור IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 מסומן נגד עכבר, עז IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt כתב מבחן | |||
| <חזק>TopFlash HEK293 קו תאים | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| <חזק>חומרים וריאגנטים נוספים | |||
| מטריצת מרתף, מטריג'ל | CORNING | 356237 | |
| מאגר דיסוציאציה, Accutase | Gibco | ||
| A1110501 מדיום הקפאת תרבית תאים, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| מסננת תאים (70 ומיקרו; מ', מעוקר) | פישרברנד | 22363548 | |
| מיצוי RNA גואנידיניום תיוציאנט-פנול, ג'ל לעיבוד דגימות 15596026 TRIzol | Invitrogen | ||
| , HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| ערכת זיהוי מיקופלזמה אוניברסלית | ATCC | 30-1012K | |
| 05-408-129 | |||
| צלחת | ארה"ב Scientific | CC7682-7524 | |
| צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל | פישר מדעי | 14-432-22 | |
מקורות
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).
- DiPaola....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
