הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59555

⸱

30 באפריל 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

במאמר זה

סיכום

אנו מדגימים תרבות תא יחיד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק (GVs). GVs המכיל תאים חיידקיים הוכנו על ידי שיטת העברת droplet היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע זכוכית להתבוננות ישירה של גידול חיידקי. גישה זו עשויה להיות גם הסתגלות לתאים אחרים.

תקציר

פיתחנו שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק (GVs). התרבות התא חיידקי חשוב להבנת הפונקציה של תאים חיידקיים בסביבה הטבעית. בגלל ההתקדמות הטכנולוגית, ניתן לגלות פונקציות שונות של תאים חיידקיים במפלס התא היחיד בתוך מרחב סגור. GVs הם תאים מיקרו בגודל כדורי מורכב מולקולות השומנים האמפיפילי והוא יכול להכיל חומרים שונים, כולל תאים. במחקר זה, תא חיידקי בודד הועבר 10 – 30 יקרומטר gvs על ידי שיטת העברת droplet ו-gvs המכיל תאים חיידקיים היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע הזכוכית. השיטה שלנו היא שימושית להתבוננות בצמיחה בזמן אמת של חיידקים בודדים בתוך GVs. אנו מתורבתים Es, האנתכיה קולי (E. coli) תאים כמודל בתוך gvs, אבל שיטה זו ניתן להתאים לסוגי תאים אחרים. ניתן להשתמש בשיטה שלנו בתחומי המדע והתעשייה של מיקרוביולוגיה, ביולוגיה, ביוטכנולוגיה וביולוגיה סינתטית.

מבוא

התרבות של תאים חיידקיים ברמה תא אחד קיבל את תשומת הלב הגוברת. התאים חיידקי בקטריאלי ברמת תא בודד בתוך שטח מוגבל יכול להבהיר פונקציות חיידקיים כגון השונות פנוטימית1,2,3,4, התנהגות התא5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9, ו עמידות לאנטיביוטיקה10,11. בגלל ההתקדמות האחרונה בטכניקות התרבות, ניתן להשיג את התרבות של חיידקים בודדים בתוך מקום מוגבל, כגון שבב היטב4,7,8, ג'ל droplet12,13 , והמים בשמן (W/O) droplet5,11. כדי לקדם הבנה או ניצול של תאים חיידקיים בודדים, יש צורך בהתפתחויות טכניות נוספות של טכניקות טיפוח.

שלפוחיות המחקים את קרום התא הביולוגי הן תאים כדוריים המורכב ממולקולות אמפיפיליות ויכולות להכיל חומרים שונים. שלפוחיות מסווגים לפי גודל וכוללות שלפוחיות קטנות (SVs, קוטר < 100 ננומטר), שלפוחיות גדולות (LVs, < 1 μm), ושלפוחיות ענק (GVs, > 1 μm). SVs או LVs משמשים בדרך כלל כנשאים לתרופות בשל הזיקה לקרום התא הביולוגי14. GVs יש גם שימש כמערכת הכור עבור הבנייה של פרוטותאים15 או מלאכותי תאים16. כימוס של תאים ביולוגיים לתוך gvs דווח17,18, ולכן gvs להראות פוטנציאל כמערכת תרבות התא כאשר בשילוב עם מערכת הכור.

כאן, יחד עם וידאו של הליכים ניסיוניים, אנו מתארים כיצד GVs יכול לשמש ככלי תרבות התא הרומן19. GVs המכילים חיידקים נעשו על ידי שיטת ה-droplet העברת20 והיו מקיבוע על קרום נתמך על זכוכית כיסוי. השתמשנו במערכת זו כדי להתבונן בגידול חיידקי ברמה של תא בודד בתוך GVs בזמן אמת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת GVs המכיל תאים חיידקיים על ידי שיטת העברת Droplet

  1. הכנת פתרונות מניות ליפיד של 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC, 10 מ"מ, 1 מ ל) ו-1, 2-distearoyl-sn-גליקו-3-פוספולאטאנאמין-N-[ביוטיקסיל (פוליאתילן)-2000] (biotin-יתד-DSPE, 0.1 מ"מ, 1 מ ל) בכלורופורם/ מתנול פתרון (2/1, v/v) ולאחסן את המניה ב-20 ° c.
  2. הכנת תמיסת שמן המכילה שומנים בדם
    1. יוצקים 20 μL של פתרון POPC ו 4 μL של הפתרון biotin-יתד-DSPE לתוך צינור זכוכית (איור 1b (i)).
    2. להתנדף את הממס האורגני על ידי זרימת האוויר כדי ליצור סרט השומנים ולמקם את הסרט desiccator עבור 1 h כדי לאדות לחלוטין את הממס אורגני (איור 1b (ii)).
      הערה: יש צורך לאדות את הממס האורגני בתוך מכסה המנוע.
    3. הוסף 200 μL של שמן מינרלי (0.84 g/mL, טבלת חומרים) לבקבוקון זכוכית (איור 1b (iii)).
    4. עטוף את החלק הפותח של בקבוקון זכוכית עם הסרט וsonicate אותו באמבטיה אולטרה סאונד (120 W) עבור לפחות 1 h (איור 1b (iii)). הריכוזים הסופיים של POPC ו biotin-יתד-DSPE הם 1 מ"מ ו 0.002 מ"מ, בהתאמה.
  3. טרום תרבות של תאים חיידקיים
    1. החיידק הקולי לתוך מדיום 1x ליברות (1 גרם שמרים לחלץ, 2 g bacto טריטונים, ו 2 גרם נתרן כלוריד ב 200 mL של מים מיוהים) מ לוחית LB ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 12 – 14 h (לילה).
    2. לאחר הדגירה, לאסוף 20 μL של פתרון התרבות ולהעביר ל 1.98 mL של טריים 1x בינוני LB, ותרבות התאים שוב עבור 2 h.
    3. בדוק את הדחיסות האופטית ב600 nm (OD600) ערך של פתרון טרום תרבות (מוכן בשלב 1.3.2). יש להשתמש בפתרון טרום תרבות של OD600 = 1.0 – 1.5.
  4. הכנת פתרונות המים החיצוניים והפנימיים של GVs
    1. התמוססות גלוקוז ב-1x ליברות בינונית כדי להכין פתרון מימית החיצוני של GVs. הכן 20 מ ל של פתרון גלוקוז מניות (500 mM).
    2. לדלל את התמיסה הגלוקוז במניה עם מדיום 1x ליברות 200 מ"מ (שולחן 1).
    3. מתמוסס התמוססות ב 1x ליברות בינונית כדי להכין פתרון מימית פנימי של GVs. הכינו 20 מ ל של מניות הפתרון של סוכרוז (500 מ"מ).
    4. לערבב את הפתרון טרום תרבות (OD600 = 1.0 – 1.5), סוכרוז פתרון (500 mM), ו 1X LB בינונית (טבלה 1). ה-OD הסופי600 ערך של הפתרון התרבותי צריך להיות 0.01 – 0.015 והריכוז האחרון של סוכות צריך להיות 200 מ"מ.
      הערה: . תדאג להימנע מלחץ אוסמוטי יש צורך לאזן את הריכוז בין הפתרון הפנימי והחיצוני.
  5. הכנת המים בשמן (W/O) טיפות המכילות תאים חיידקיים
    1. הוסף 2 μL של הפתרון הפנימי מימית של GVs (מוכן בשלב 1.4.4) כדי 50 μL של פתרון שמן המכיל שומנים (שמן מינרלי עם POPC ו biotin-יתד-DSPE) בצינור פלסטיק 0.6 mL (איור 1b (iv)).
    2. אמולסיה של שני הרכיבים בצינור הפלסטיק על-ידי הקשה על הצינור באמצעות יד (איור 1b (v)).
  6. היווצרות של GVs המכיל תאים חיידקיים
    1. הוסף 50 μL של הפתרון החיצוני מימית של GVs (מוכן בשלב 1.4.2) בצינור פלסטיק של 1.5 mL (איור 1b (vi)) ושכבה בעדינות 150 μl של פתרון השמן המכיל שומנים (שמן מינרלי עם popc ו BIOTIN-יתד-dspe) על המשטח של מימית החיצונית (איור 1b (vii)). מיכל הדגימה בטמפרטורת החדר (RT, 25 ° c) במשך 10 – 15 דקות בדוק כדי לוודא כי הממשק של השמן ופתרונות מימית הוא שטוח.
    2. הוסף 50 μL של הפתרון של W/O droplet (מוכן בשלב 1.5.2) על הממשק של השמן ואת התמיסה מימית באמצעות פיפטה (איור 1b (viii)).
    3. צנטריפוגה את שפופרת הפלסטיק 1.5 mL (משלב 1.6.2) עבור 10 דקות ב 1,600 x g ב RT ב צנטריפוגה שולחן עבודה (איור 1b (ix)). לאחר צנטריפוגה, לאכול את השמן (השכבה העליונה) מצינור פלסטיק 1.5-mL בעקבות הצינורות, ולאסוף את GVs המכיל תאים חיידקיים (איור 1b (x)).

2. הכנת מערכת תצפית GV (מערכת תרבות התא חיידקי)

  1. הכנת שלפוחיות קטנות (SVs) לקונסטרוקטי ng ממברנה בילייר נתמכת
    1. יוצקים 20 μL של פתרון POPC ו 4 μL של הפתרון biotin-יתד-DSPE לתוך צינור זכוכית (באמצעות הרכב השומנים זהה משמש הכנה GV בשלב 1.1).
    2. להתנדף את הממס האורגני על ידי זרימת האוויר כדי ליצור סרט השומנים ולמקם את המדגם הזה desiccator עבור 1 h כדי להתאדות לחלוטין את הממס האורגני.
    3. הוסף 200 μL של הגלוקוז 200 mM ב 1x בינונית LB (הפתרון החיצוני מימית של GVs) לבקבוקון זכוכית.
    4. עטוף את החלק הפותח של בקבוקון זכוכית עם הסרט וsonicate אותו באמבטיה אולטראסוניות (120 W) עבור לפחות 1 h.
    5. הכינו SVs על ידי שיטת ההבלטה21 באמצעות הבלטת ממד מיני קרום פוליקרבונט עם 100 בגודל נקבובית ננומטר.
  2. הכנת תא בעבודת יד
    1. מקדחה חור 7 מ"מ עם אגרוף חלול על אטם כפול פנים (10 מ"מ x 10 מ"מ x 1 מ"מ).
    2. הדבק את החותם כפול פנים עם החור על זכוכית כיסוי (30 מ"מ x 40 מ"מ, עובי 0.25 – 0.35 mm).
  3. הכנת קרום bilayer נתמך על הזכוכית המכסה בחור של התא
    1. הוסף 30 μL של פתרון SV לחור של התא (מוכן בסעיף 2.2) ו דגירה ב RT עבור 30 דקות.
    2. בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 μL של 1x בינוני LB המכיל 200 mM גלוקוז (הפתרון החיצוני מימית של GVs) על ידי ליטוף.
  4. השתק של GVs על ה הממברנה הנתמכת על הזכוכית המכסה בחור החדר
    1. הצג 10 μL של neutravidin עם הפתרון החיצוני מימית של GVs (1 מ"ג/mL) לתוך החור ו-דגירה ב RT עבור 15 דקות.
    2. בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 μL של 1x בינוני LB המכיל 200 mM גלוקוז (הפתרון החיצוני מימית של GVs) על ידי ליטוף.
    3. הוסף את כל הפתרון המכיל GVs (מוכן בשלב 1.6.3) לתוך החור של התא וחותם עם זכוכית כיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ, עובי 0.13 – 0.17 מ"מ) (איור 2b).
  5. התבוננות מיקרוסקופית של צמיחת תאים חיידקיים בתוך GVs
    1. הגדר מערכת הבמה חימום מיקרוסקופיים עם מיקרוסקופ הפוך מצויד בצמצם 40x/0.6 מספרית (NA) העדשה האובייקטיבית עם מרחק עבודה ארוך (איור 2b).
    2. מניחים את התא על מערכת הבמה חימום מיקרוסקופיים (איור 2b). דגירה של GVs המכיל תאים חיידקיים בחדר במצב סטטי עבור 6 h ב 37 ° c.
    3. ללכוד ולהקליט תמונות מיקרוסקופ של צמיחת תאים חיידקיים בתוך GVs כל 30 דקות באמצעות מדעית מתכת משלימה תחמוצת מוליכים למחצה (sCMOS) מצלמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנו מציגים שיטה פשוטה ליצירת GVs המכיל תאים חיידקיים בודדים באמצעות שיטת ה-droplet העברה (איור 1). איור 1a מראה תמונה סכמטית של המשקעים של gvs המכילים חיידקים. W/O טיפות המכילים חיידקים מועברים על פני מי השמן (מונאולד מונואולייר) ממשק ידי צנטריפוגה כדי ליצור GVs. ההבדל בין הצפיפות בין התמיסה הפנימית והגלוקוז (פתרון המים החיצוני) מסייע גם לחציית ממשק מי השמן של טיפות W/O. יש צורך לפקח על הלחץ אוסמוטי בפתרון מימית פנימי וחיצוני, כי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא אחד בתוך GVs. שיטה פשוטה זו כרוכה ביצירת GVs המכיל תאים חיידקיים ברמה תא יחיד באמצעות שיטת ה-droplet העברה. לעומת גישות אחרות להשגת GVs המכיל תאים חיידקיים, שיטה זו יש שני יתרונות: (אני) זה קל לפתח, ו (ii) נפח קטן (2 μL) של פתרון לדוגמה נדרש כדי להכין את GVs. שיטת ה-droplet העברת20 להכנת gvs המכילים תאים חיידקיים היא פשוטה יותר מאשר לחות קלאסית22 ו מיקרופלואידיקה שיטות מיקרופלואידיקה17. לדוגמה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי יוזמה מובילה לחוקרים צעירים מצוינים (מנהיג, No. 16812285) ממשרד החינוך, התרבות, ספורט, מדע וטכנולוגיה (MEXT) של יפן, מענק סיוע למחקר מדען צעיר (No. 18K18157, 16K21034) מחברה יפן לקידום המדע (JSPS) ל M.M., ו גרנט-עזרה מ-MEXT ל-K.K. (No. 17H06417, 17H06417).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BactotryptoneBD Biosciences211705
ChloroformWako Pure Chemicals032-21921
כיסוי זכוכית (18 ופעמים; 18 מ"מ)Matsunami Glass Ind.עובי C0181810.13– זכוכית כיסוי 0.17 מ"מ
(30 פעמים; 40 מ"מ)Matsunami Glass Ind.הזמנה מותאמת אישית0.25– 0.35 מ"מ
צנטריפוגה שולחניתהיי-טק ושות'ATT101סוג רוטור נדנדה
אטם דו-פרצופי (10 פעמים; 10 ופעמים; 1 מ"מ)NitomsT4613
בקבוקון זכוכיתAS ONE6-306-01צינור תסיסה של דורהאם
גלוקוזWako Pure Chemicals049-31165
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX-73
מתנולWako Pure Chemicals133-16771
מערכת חימום מיקרוסקופית stageמערכת TOKAI HITTP-110R-100
שמן מינרליNacalai Tesque23334-85
מיני מכבשAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
עדשת אובייקטיביתOlympusLUCPLFLN 40&/0.6 NA
ממברנות פוליקרבונטAvanti Polar Lipids610005גודל נקבוביות 100 ננומטר
מצלמת sCMOSAndorZyla 4.2 בתוספת
נתרן כלוריWako Pure Chemicals191-01665
סוכרוזWako Pure Chemicals196-00015
אמבט אולטרסאונדכאחדASU-3D
BDBiosciences212750
0.6 מ"ל צינור פלסטיק מכוסהווטסון130-806C
1.5 מ"ל צינור פלסטיק מכוסהSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocolineAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]Avanti Polar Lipids880129Pביוטין-PEG-DSPE
עובי תמצית שמרים

מקורות

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024(2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Escherichia coli
תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.