מאמר שיטה

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

DOI:

10.3791/59570

⸱

8 באוגוסט 2019

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את העברת הפלסטיות הגבוהה ביותר של תאי היונקים בצלחת 384-היטב באמצעות טכנולוגיית הפליטה האקוסטית של ה-droplet. הזמן גוזלת, שגיאות-DNA לחילוק ו ריבוב, אבל גם התרגום המקביל מגיב, הם תוכנה מונחה ומבוצעת על ידי מכשיר ננו. התאים הם הנזרע לאחר מכן בארות מלאות אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעבר תאים, הכרחי למחקרים ביולוגיים רבים, דורש שליטה בפרמטרים רבים להשגת הישגים מדויקים ומוצלחים. בדרך כלל ביצוע בתפוקה נמוכה, זה יותר מדי זמן ושגיאות נוטה, אפילו יותר, כך כאשר ריבוב מספר פלמידים. פיתחנו שיטה קלה, מהירה ומדויקת לביצוע מעבר תאים בפריסת צלחת 384 באמצעות הוצאה אקוסטית של droplet (ADE). מכשיר ננו משמש במחקר זה מבוסס על טכנולוגיה זו ומאפשר משלוח מדויק ננונפח במהירות גבוהה מצלחת מקור היטב ליעד אחד. זה יכול לוותר על מולטיפלקס DNA ו-הזיהום מגיב לפי גיליון אלקטרוני מעוצב מראש. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי כדי לבצע מבוסס אייד התפוקה הגבוהה בתפוקת האוויר הגבוה, מה שמאפשר להגיע ליעילות של עד 90% ו כמעט 100% הזיהום בניסויים הפנים. אנו מרחיבים את העבודה הראשונית על-ידי הצעת מאקרו ידידותי למשתמש המבוסס על גיליון אלקטרוני, מסוגל לנהל עד ארבע פלמידים/בארות מספרייה המכילה עד 1,536 שונים פלמידים, ויישום מדריך ליטוף מבוסס-לוח. המאקרו מעצב את התבניות הדרושות ללוחית המקור (ות) ויוצר את הקבצים המוכנים לשימוש עבור היישומים המבוססים על הננו-מנפק והלוח. פרוטוקול ארבעה שלבים החוצה כרוך i) מדלל לוותר עם מטפל הנוזל הקלאסי, ii) הפצה פלארמיד ו ריבוב, iii) מגיב החוצה על ידי הננו מנפק, ו iv) ציפוי תא על בארות מלאות. השליטה המבוססת על התוכנה של ריבוב הפלגיסינג והתרגום של ADE מאפשרת אפילו לא מומחים בתחום לבצע מעבר תאים אמין בדרך מהירה ובטוחה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של הגדרות מיטביות עבור סוג תא נתון וניתן להשורבן לגישות בקנה מידה גבוה וידני. הפרוטוקול מקל על יישומים, כגון חלבון ORFeome אנושי (סט של מסגרות קריאה פתוח [ORFs] ביטוי הגנום) או CRISPR-Cas9-מבוסס על הפונקציה הגנטית אימות, באסטרטגיות סינון שאינם במאגר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המוצגת כאן מתארת בפרוטרוט כיצד לבצע בדיקת מידע והעברה של דנ א בתאי היונקים בתפוקה גבוהה באמצעות ננו-מתקן נוזלי מבוסס-אקוסטי בצלחת 384-באר, אפילו עבור שאינם מומחים בתחום. זו שיטה שפורסמה לאחרונה1 מאפשר לבצע ככל 384 באופן עצמאי מרבב ו-DNA בתנאי הזיהום בניסוי אחד, בתוך פחות מ 1 h. ניסויים בודדים או מעבר הצליחו, להגיע קרוב ל 100% זיהום בתוך אוכלוסיית התאים המזוהמים. פרוטוקול זה מאפשר העברה קלה יותר מכיוון שרוב השלבים המייקלים, הצורכים זמן ומועדים לשגיאות הם כעת מונחי תוכנה (ראה איור 1 עבור מבט כללי). מאמצים נוספים נעשו לפתח כלים ייעודיים להגברת קלות השימוש תוך הימנעות מטעויות אנוש במהלך התהליך הכולל ולקידום התפתחות מוצלחת גם עבור שאינם מומחים בתחום. הפרוטוקול המתואר כולל גיליון מאקרו "ידידותי למשתמש" שפיתחנו על מנת לנהל 384 מצבים בלתי תלויים עם אפשרויות ריבוב של עד ארבע פלמידים בכל באר. המאקרו מייצר באופן אוטומטי תבניות של לוחית המקור (s) כדי לטעון את ה-DNA הצפוי באמצעי האחסון להתחיל פתרונות המניה ואת הקבצים הדרושים כדי לכונן את התוכנה ננומנפק על העיצוב הניסיוני כי כבר inputted. כמו הידני מחלק של ה-DNA לוחית מקור 384-ובכן הוא מייגע ומועדים, אנו גם פיתח יישום ייעודי מבוסס לוח כדי להנחות את המשתמש בזמן לחלק פתרון DNA על פי התבנית.

figure-introduction-1
איור 1: זרימת עבודה ניסויית. ייצוג סכמטי של פרוטוקול העברת התפוקה האוטומטית האופטימלי האוטומטי (החל מהתכנון הנסיוני ועד לקבלת שיטת ביולוגית מותאמת אישית). שלבים ידניים מצוינים באמצעות סמל היד והזמן המשוער לכל שלב כתוב בתיבה אדומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רבים מבוססי תא ניסויים להתחיל עם התפתחות DNA פלמיד, וגם אם הרבה ריאגנטים ייעודי היו ועדיין מפותחים כדי לשפר את יעילות הטיפול ו/או להקל על ההליך, שנותר הרבה להיעשות2,3 , 4. DNA מעבר התא הזיהום כרוך כמה צעדים כדי להגיע ליעילות גבוהה, כגון ספיגה מורכבת ראשונית, בריחה אנדוזוממית, ו cytoplasmic הובלה לגרעין5,6. בנוסף סידן משקעים או טכניקות פיזיות כגון אלקטרופורציה או מיקרוהזרקה באמצעות מכשירים ייעודיים7, שיטות כימיות מודרניות התמקדו שיפור מסירת ה-DNA בזמן הורדת cytoxicity תא8, . בסדר, תשע השימוש בשומנים או פולימרים מיוצרים ליפובי מתחמים כמו, לאחרונה, מערכות כימיה פולימריים ליפוזוממית הפכה קלה ויעילה יותר10. למרות ההתפתחויות הללו, התפתחות התא עדיין דורש מיומנויות ספציפיות להתבצע באופן מדויק כמו רוב הפרוטוקולים הללו הפיזי או כימי מחייב מדענים להכין ידנית כל מצב תגובת דנ א, ולכן פוגע בתפוקה. כדי לעקוף בעיה זו, היפוך הפרוטוקולים הפוכים פותחו בעזרת ריאגנטים כימי העברת כימיקלים11,12,13, המאפשר למשתמש לבדוק או לשלב מספר פלמידים בצורה מהירה יותר. בפרוטוקולים אלה, חומצות גרעין מתחמים עם ריאגנטים החצייה נוצרות לפני זריעת התאים על התסביכים. עם זאת, פרוטוקולים אלה הפוכה עדיין מוגבלים על ידי טיפול ידני של פתרונות DNA ועל ידי שילוב של כל אחד מהתנאים העצמאיים. למרות שזה אפשרי לבצע אותם בפורמט הצלחת 96-באר, ההכנה DNA והיתר יהיה מייגע, וסביר להניח כי יהיו טעויות. כאשר כמויות שונות של מספר פלמיונים DNA נדרשים ומפולדלים אחד עם השני, הזיהום התא הופך אפילו קשה יותר להשיג יותר זמן רב, ושגיאות האדם להיות די בלתי נמנע. שינוי קנה מידה של עד לפורמט 384-באר בגישה הפוכה לאחור, למרות מספר התנאים הניתנים לשינוי בשיטת ה-DNA, הופך לאתגר בלתי אפשרי עקב הסיבות הבאות. i) כמויות ה-DNA, מגיב העברה, או התגובה תערובת אמצעי לניהול הם נמוכים מ-1 μL עבור כל באר. ii) ריבוב של פלמידים ל384 מצבים עצמאיים הופך למסובך ביותר. המסירה בכל אחד 384 בארות הוא גם iii) מאוד ארוך זמן ו iv) מועדת לשגיאות. ואכן, הפתרון הנכון בבארות הצפויות קשה לניהול מכיוון שאמצעי האחסון הנמוכים כבר אינם מאפשרים מעקב ויזואלי בין הבארות הריקות והמלאות. v) בסופו של דבר, יש סיכון גבוה לייבוש התערובת על ידי התאיידות לפני הוספת התאים בגלל הזמן הדרוש לביצוע הצעדים הדרושים לחילוק. לסיכום, הגורם המגביל להגדיר את ה-DNA התפוקה הגבוהה בשיטת הסינון מראה מופיע להיות המזעור של הטיפול, אשר מרמז על ריבוב בנפח נמוך וניהול כי לא ניתן לטפל באופן ידני יותר, אבל הם גם בקושי השגה ב דרך אמינה ע י מטפלים בנוזלים קלאסיים.

כהוכחה לקושי לספק מידע שכזה ולהשיג תפוקה גבוהה, רק נסיונות מעטים להפוך את החצייה לאוטומטית פורסמו עד כה: בתבנית צלחת 96-באר באמצעות מכשיר מסחרי טיפול נוזלי וסידן פוספט משקעים14 ו, לאחרונה, מגיב ליפולקס, ו שבב מיקרופלואידיג המאפשר 280 בלתי תלוי העברה של15 אבל דורש כישורים מיוחדים בתחום זה. שיטה נוספת, המאפשרת ריחוף נוזלי והובלת מניפולציה וערבוב נוזלים, נעשה שימוש כדי לבצע העברה של דנ א ב 24-כדי 96-צלחת לוחית בפורמטים16. למרות ריאלי, גישה זו סובלת תפוקה נמוכה מאוד כמו ערבוב של תאים עם התערובת DNA הזיהום דורש 60 s דגירה עבור כל נקודה אחת לפני זריעת. זה מרמז על משך של לפחות 96 דקות עבור צלחת מלאה 96-באר. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא רחוק מלהיות קלה הקהל הכולל של הביולוגים כמו עבודה זו נעשתה עם מכשיר בבית מעוצב ומיוצר אשר כרגע לא זמין בשוק. להיפך, בשנים האחרונות, קל לשימוש מונחה תוכנה בטכנולוגיה מבוססת אקוסטי התפתחה עם מכשירי מנפק ננו נפח. באמצעות אנרגיה אקוסטית ממוקדת, התקנים אלה מאפשרים הוצאה בשליטה הדוקה של כרכים נוזליים קטנים מ 2.5 nL כדי 500 nL מלוחית המקור ליעד אחד17. טכנולוגיה זו, הנקראת לפליטה אקוסטית (ADE), היא בעלת יתרונות רבים: היא אוטומטית לחלוטין, ללא מגע, מדויקת, מדוייקת, מדויקת ומאוד מתאימה, והיא בעלת תפוקה גבוהה של18. המוקדש הראשון להעברת diמתיל סולפוקסיד (DMSO) פתרונות, הגדרות שופרו כדי לוותר על מאגרים מימית19. מכשירי ננו אקוסטי, לאחר מכן, נראה מתאים להפוך פרוטוקולים הפוכה תא החצייה והוא יכול לעקוף את רוב המגבלות הנ ל המדריך. מאחר שלא תוארו בעבר בטכנולוגיה זו, הערכנו לאחרונה את התאמתו של מערכת החילוק האקוסטית המבוססת לביצוע הפיכת תאים הפוכים.

ניצול תפוקת הננו וקלות השימוש, אנו אופטימיזציה פרוטוקול היפוך החוצה עבור תאי הלה על ידי החוצה בדיקה מספר פרמטרים שיכולים להשפיע על העברת דנ א על 384-ובכן, צלחת אחת, כלומר, סכום ה-dna סה כ ו מקור ה-DNA מתחיל ריכוז, מדלל נפח, מגיב העברה, ומספר תאים כפולה. הפרוטוקול המפותח חוסם את המגבלות הידניות שתוארו לעיל, ומציג מספר יתרונות על פני ניסיונות אחרים לשימוש אוטומטי. ראשית, זה מיניאטורי, ובכך מאפשר מגיב חסכונית הזיהום על ידי שמירת DNA ההכנות והזיהום התרגום. שנית, היא הרבה יותר גבוהה התפוקה והניתנת לקריאה מאשר הפרוטוקול הידני (אפילו למתחילים), כמו העברת הצלחת של 384 שלם-באר ניתן להשיג בפחות מ 1 h. לבסוף, זה מונחה תוכנה, המאפשר את השליטה של כמות ה-DNA מבוקר ואת ריבוב של מספר פלמידים. אכן, הודות לתוכנה ננו מנפק (טבלה של חומרים), המשתמש יכול להרחיב את תוכנית המחקר כדי לשלוט על אמצעי האחסון כדי להיות מוכן צלחת מקור מוגדר היטב ליעד אחד.

הפרוטוקול המוצג כאן מיועד בעיקר לאלה שיש להם גישה לננו-מנפק ורוצים להגדיר ניסויים בתפוקה גבוהה, אלא גם עבור אלה שרוצים למטב במהירות את הפרמטרים שלהם עבור סוג תא נתון על ידי החלת פרוטוקול זה כדי להצליב מספר פרמטרים בתפוקה גבוהה. אכן, הצגנו כי הפרמטרים אופטימיזציה מזוהה עם פרוטוקול זה ננו-סולם יכול להיות משתנה לניסויים בקנה מידה גדול וידני. בסופו של דבר, כמו מגיב החידוש המשמש בפרוטוקול הנוכחי מאפשר DNA או siRNA העברה על פי היצרן, הפרוטוקול הוא גם מעניין לאלה המכוונים לבצע גישות מערך עבור הבעות היתר של הגן או הנוק-אובר. לוחיות היעד המלאות מראש ב-DNA ניתן לשנות עד 7 ימים לפני השימוש בתוך שיטת החצייה ללא אובדן של יעילות, שהוא יתרון נוסף של הפרוטוקול הבא עבור סוג זה של יישום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ההכנות מראש

  1. הכנת תוכניות המטפל הנוזלי הפריסטלטיות
    הערה: לגבי הצעדים המידללים והסלולאריים של הפרוטוקול, יש להכין תוכנית ייעודית, תוך התחשבות בגובה הראש החלק לצלחת המשמשת ובכוונת השלב.
    1. עבור 1 μL דילול הצעד, הר a 1 הקלטת μL ולהכין תוכנית עם ההגדרות כמתואר בשלבים 1.1.1.1 ו 1.1.1.2.
      1. התאם את פרמטר קצב הזרימה לגבוה עבור התפוקה הטובה ביותר כיוון שלא צפוי נזק לחומרים ביולוגיים בשלב זה. כוונן את גובה מדבקות ל 9.6 מ"מ (בהתאם ללוח התרבות של התא המשמש, משלים איור 1) כדי לאפשר את טיפת μl 1 לגעת בתחתית הבארות במהלך היתר.
        הערה: שלב זה חיוני כדי למנוע שמירה של טיפות על הראש מחלק עד להגיע נפח מספיק לרדת.
      2. להתאים את הצלחת ברורה לגובה 14.4 מ"מ כדי לאפשר עקירה חינם של הראש מחלק על הצלחת לאחר החילוק כל שורה. שלוט באופן חזותי על ההגדרות המתאימות של גובה ראש המטפל הנוזלי הפריסטטי: ודא שלא נשמרים טיפות על העצות המקובעות בזמן החילוק ולוודא שהראש מספיק גבוה כדי לאפשר עקירה של הראש לאחר שהוא מחלק כל שורה.
        הערה: הימנעות משמירת השחרור היא פרמטר מכריע כפי שהוא יפגע בדיוק של עוצמת הקול של היתר.
    2. עבור לחילוק השעיית תא 40 μL, טעינת קלטת 10 μL והכנת תוכנית עם ההגדרות כמתואר בשלבים 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. כוונן את פרמטר קצב הזרימה לנמוך כדי לחלק את התאים במהירות נמוכה כדי להימנע מקידום נזקים פוטנציאליים לתאים על-ידי הטיית מתח והשפעה גבוהה בתחתית הבארות. להתאים את גובה היתר כדי 11.43 מ"מ (על פי צלחת תרבות התא המשמש, משלים איור 1), גבוה מספיק כדי להקטין את השפעת התא על החלק התחתון של הבארות במהלך התהליך מחילוק אבל נמוך מספיק כדי למנוע שמירה של טיפות על ה . הראש החוצה להתאים את הצלחת ברורה גובה 16 מ"מ כדי לאפשר הזחה חינם של הראש מחלק על הצלחת לאחר החילוק כל שורה.
      2. שלוט באופן חזותי על ההגדרות המתאימות של גובה ראש המטפל הנוזלי הפריסטטי: ודא שלא נשמרים טיפות על העצות המקובעות בזמן החילוק ולוודא שהראש מספיק גבוה כדי לאפשר עקירה של הראש לאחר שהוא מחלק כל שורה.
        הערה: הימנעות החזקת שחרור היא פרמטר מכריע כפי שהוא יוביל לחילוק מספר סלולרי לא אמין.
  2. הכנה לבדיקת דנ א (פרוטוקול מיני הכנה קלאסית)
    1. לגדול DH5α חיידקים שינוי זן בינונית LB בתוספת עם 125 μg/mL אמפיצילין בחירה אנטיביוטי (טבלה של חומרים) לילה ב 37 ° c ו תחת עצבנות עדינה (200 rpm) על שייקר מסלולית (לוח חומרים).
    2. הקציר 2 מ ל של התרבות, גלולה את התאים על ידי תפרידו עבור 5 דקות ב 6,000 x g, ולמחוק את supernatant.
    3. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית עם 250 μL של מאגר מחדש המכיל RNase A (טבלת חומרים). הוסף 250 μL של מאגר הליזה ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, על פי הוראות היצרן.
    4. להפסיק את תגובת הליזה על ידי הוספת 300 μL של ניטרול מאגר (טבלת חומרים) ו-הודעות בזמן קצר. צנטריפוגה את הצינורות עבור 5 דקות ב 11,000 x g.
    5. המקום החדש פלבאמצע מיני-מיני (לוח חומרים) בתוך שפופרת אוסף של 2 מ"ל ו decant סופרנטאנט בעמודה על ידי תפרידו עבור 1 דקות ב 11,000 x g.
    6. למחוק את הזרימה ולמקם את מיקום בחזרה בצינור האוסף.
    7. שטוף את מועדון הפלבין בינוני עם 500 μL של מאגר כביסה אופציונלי (טבלת חומרים) וצנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, על פי הוראות היצרן.
    8. להשליך את הזרימה-דרך ולמקם את הפלבאמצע מועדון בחזרה בצינור האוסף.
    9. הוסף 700 μL של מאגר כביסה (טבלת חומרים) שיושלם עם אתנול וצנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, על פי הוראות היצרן.
    10. להשליך את הזרימה-through ו צנטריפוגה את הפלבאמצע הפלסטיק ואת שפופרת האוסף שלה 1x יותר עבור 2 דקות ב 11,000 x g כדי לייבש את קרום סיליקה.
    11. המקום היבשים ביותר מיני מיני בצינור 1.5 mL חדש ולהוסיף 30 μL של מים מזוקקים prewarmed ב 60 ° צ', מודתיאת זה עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן, צנטריפוגה אותו עבור 1 דקות ב 11,000 x g.
    12. ולשמור על המנוע המכיל את ה-DNA מטוהרים פלמיד.
    13. מדוד את ריכוז ה-DNA של ה-DNA חומקת באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume (טבלת חומרים).
      1. הפעל את הספקטרוסקופיה ובחר את הגדרות מדידת ה-DNA .
      2. הרימו את זרוע הדגימה של הספקטרוסקופיה והפיפטה 1 μL של מים על המעמד המדידה כדי לבצע כיול ריק.
      3. הנמך את זרוע הדגימה, הפעל את המדידה הריקה והמתן להשלמה.
      4. הרם את זרוע הדגימה ונגב את הדגימה מהכנים העליונים והתחתונים.
      5. פיפטה 1 μL של פתרון ה-DNA על המעמד התחתון כדי למדוד אותו.
      6. הנמך את זרוע הדגימה, הפעל את מדידת הריכוז של הדנ א, והמתן להשלמה.
      7. הרם את זרוע הדגימה ונגב את הדגימה מהכנים העליונים והתחתונים.
      8. לקבלת מדידות ריכוז DNA נוספות, חזור על שלבים 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. לאחר סיום המדידות, לאחסן את פתרונות ה-DNA ב 4 ° צ' עד השימוש.

2. תכנון ניסיוני והדור של רשימות הפיקסים לכונן את החלק המבוסס על אייד

הערה: מאקרו אלקטרוני ייעודי "ידידותי למשתמש" פותח לניהול כמויות DNA ולערבב עד ארבעה פלמידים בפורמט 384-צלחת. בהתבסס על העיצוב הניסיוני המוזן, מאקרו זה יוצר את הקבצים הדרושים כדי לכונן את פרוטוקול ה-DNA מבוסס-ADE על ידי ננו מנפק. כדי ליצור קבצים אלה, יש למלא מספר שדות בגיליון התבניות כמוצג באיור 2.

figure-protocol-1
איור 2 : יצירת רשימות הפיקפיזציה לכונן היתר של ADE באמצעות מאקרו הגיליון האלקטרוני. יש למלא פרמטרים שונים, כלומר (1) את מגיב המשגר (TR) ואת אמצעי האחסון המינימליים/מרביים שישמשו בלוחית המקור, (2) ריכוזי הפלפ1 הראשוניים שניתן לחלק בלוחית המקור, ו (3) ה עיצוב לוחית שלמה, כולל כמויות הפלסטיות הצפויות ו ריבוב בכל אחד 384-בארות. (4) הפעלת רשימות בפיקדות מאפשרת אימות של השדות השונים, ולאחר מכן מולאו כראוי, רשימות ברירת מקור ל-DNA ו-TR, ותבנית המקור הדרושה נוצרת באופן אוטומטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הזן את הפרמטרים של פרוטוקול ננו-מנפק בשדות הוורודים. הגדר את ערך התערובת של מגיב ההעברה (TR) ל-500 nL. הגדר את ערך אמצעי האחסון המינימלי בבארות לוח המקור ל-4 μL. הגדר את אמצעי האחסון המקסימלי בבארות לוח המקור ל-11.25 μL.
    הערה: הננו-מתקן המשמש כאן יכול רק להעביר מקסימום של 500 nL בהפעלה אחת של ADE. שדות ורודים אלה מתמלאים מראש בערכים המומלצים, אך ניתן לשנותם בהתאם לצורכי המשתמש.
  2. הזן 100 ng/μL ה-DNA מתחיל ריכוזי בשדות הכחולים המתאימים לדנ א הבסיסי.
    הערה: ערך זה הוא הריכוז האופטימלי שהוגדר בעבר אך יכול, עם זאת, להשתנות לצורכי משתמש שונים.
  3. הזן את כמות ה-DNA הרצויה בשדות האפורים/הירוקים. הזן את הכמויות ואת שמות הפלביניים עבור 384 בארות, להבטיח את האיות זהה אם באותו פלבמיד משמש במספר בארות.
  4. צור את העיצוב של לוחית המקור, קבצי הפיקרשימות וקובץ מדריך ליטוף. לחץ על צור רשימות בחירה כדי לאפשר למאקרו ליצור את ה-DNA-Picklist. csv, את ה-T. R.-picklist הבחירה. csv ואת 384 מספר קבצי ה-. csv של מדריך הנתונים שנאספו בגיליון המתאים. אם התבקש, תקן את ערכי התא המלאים בכתום כפי שהוא מציין שגיאות או אמצעי אחסון שלא ניתן לטפל בהם על-ידי הננו-מנפק.
  5. הדפס את התבניות מגיליון לוח המקור . שמות פלמיד ונפח מינימלי למילוי הבארות מצוינים. באופן דומה, כמויות התערובת הכימית שיהיו בהמשך יהיו מלאות בבארות הבאות, מסומנות כ- TR ומודגשות בירוק.

3. צלחת מקור ה-DNA הכנה באמצעות 384-היטב pipetting יטוף מדריך יישום

  1. לדלל את ה-DNA מאוחסן פלמיד משלב 1.2.14 כדי 100 ng/μL באמצעות מים מזוקקים.
  2. כיול את הרשת 384-היטב למידות הצלחת: פתח את היישום המנחה 384-היטב ליטוף על לוח (איור 3). מקם את לוחית המקור על הרשת במסך התחתון, ובתפריט הכיול השמאלי העליון, לחץ על + או - (או השתמש בסמן האדום) כדי לשפר או להקטין את גודל הרשת והבארות כדי לכוונן את הבארות הירוקות לארבע בארות הפינה של הלוח .

figure-protocol-2
איור 3 : שימוש בטופס 384-מדריך ליטוף. (1) כיול של הרשת 384-ובכן לגודל הצלחת; (2)) הר של מתאם לוח אוניברסלי תלת-ממד המודפס ללוח באמצעות קלטת כפולה; (3) מיקום הלוחית על המתאם; (4) העקירה של הרשת כדי למרכז אותו לצלחת רכוב. (5) נעילת שלב הכיול. (6) פתיחת הקובץ מדריך ליטוף בארות 384. (7) בהתחשב ברשימת הקבצים, היישום יציין את שם לוחית המקור הצפוי, מגיב (ה-DNA או מגיב העברה), את הריכוז, ואת הנפח לוותר על בארות היעד, אשר יהיה מואר אחד על ידי אחד. (8) לחצני החיצים שמאלה וימינה לאפשר למשתמש לעקוב אחר מדריך ליטוף כדי לוותר בקלות את הריאגנטים בהתאם לתבנית המקור של מאקרו הגיליון (s). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. באמצעות קלטת דו-צידית, טען את מתאם הלוח התלת-ממדי על המסך כדי למנוע תנועות לוחית המקור בעת החילוק. במידת הצורך, הזז את הרשת המכוילת באמצעות חיצי הסיבוב והלחצנים למעלה/למטה/ימינה/שמאלה כדי לכוונן את הרשת על המסך למיקום הלוח. ברגע שהרשת והמידות הנאות מכוילים כראוי וממוקמות, סמן את תיבת הכיול Lock .
  2. לחץ על הקובץ ופתח את הקובץ 384 בארות ליטוף מדריך. csv . עקוב אחר הוראות המסך באופן ידני לוותר על הנפח המצוין של הפלבאמצע המצוין על הריכוז המצוין הלבן מודגש המתאים ליעד היעד המתאים של הצלחת הצפויה. השתמש בחיצים או בחצים כדי לחזור או להמשיך בתהליך החילוק של הדנ א. להפסיק לחילוק כאשר מגיעים לפתרון הראשון לטעינת התמיסה הכימית.
  3. לאחר הקלות היתר של DNA הם סיימו, להסיר את לוחית המקור מהמתאם. אם יש למלא לוחיות מקור מסוימות, לאחר מכן הצב לוחית מקור חדשה על המתאם ובצע את ההוראות המשונות. לאחר היתר היתר של dna סיימה, צנטריפוגה את הצלחת המקור dna (s) (ב 1,500 x g עבור 2 דקות) כדי להבטיח איזון נוזלי הנכון כדי להסיר בועות המובילות כדי חוסר דיוק ב-ADE מבוססי העברות.

4. הטיפול הנוזלי הפריסטסטי-בסיס 1 μL מדלל את היתר בלוח היעד

הערה: בצע את השלבים 4.1-4.5 בארון בטיחות ביולוגי.

  1. חטא את ראש הקלטת 1 μL על-ידי התזת החומר בריסוס תרסיס (טבלת חומרים), ואפשר לפתרון זה להיכנס למחזיק הטיפים. לספוג את שארית חיטוי על נייר סופג. טען את הקלטת 1 μL בהתקן המטפל הנוזלי הפריסטטי. הפעל את ההתקן וודא שהגדרת סוג הקלטת נכונה (1 μL), כמו גם את תבנית הלוח (384 בארות).
  2. לחטא את לומן כולו של אבובים: להוסיף את הסדרן צינור (להחזיק את שמונת הצינורות יחד) בתוך כלי סטרילי ולמלא אותו עם 5 מ ל של 70% אלכוהול. באמצעות הפונקציה לטרמה של המטפל נוזלי קנולות, הראשון לשטוף את האלכוהול אבובים ולאחר מכן לשטוף אותו על ידי העברת 5 מ ל של מים מזוקקים 5 מ ל של סרום ללא מדיום (בינונית שונה של הנשר של דולבקה [dmem] שיושלם עם 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין; טבלה של חומר), מילוי ברציפות באותו כלי. ודא שאף אחד מהעצות אינו סתום על-ידי בדיקה חזותית של זרימת הנוזלים מכולן.
  3. הממשלה אבובים עם מדיום ללא סרום על ידי מילוי כלי סטרילי חדש עם 10 מ ל של בינונית ללא תשלום סרום וצלילה מארגן הצינור בו. לחץ על הלחצן הראשי של המטפל הנוזלי הפריסטטי במשך כ -10 ס. שוב, ודא ששום עצה אינה סתומה על-ידי בדיקה חזותית של זרימת הנוזלים מכולן.
  4. למלא את הצלחת עם 1 μL של דילול. מניחים לוחית סטרילית 384-היטב לתרבות (יעד) על המנשא הנוזלי הפריסטטי המטפל ולהסיר את המכסה שלה.
  5. הפעל את התוכנית מכוילים מראש כדי לוותר על 1 μL בכל אחד מיטב הצלחות של 384-ובכן. . זמן החילוק הוא בערך 8 שנות ואז להחליף את המכסה של הצלחת 384-היטב.
    הערה: לחלופין, שלב זה יכול להיות מטופל באופן ידני, בארון בטיחות, באמצעות מיקרופיפטה רב-ערוצי.

5. ביצוע סקר לשליטה באמצעי האחסון שעברו באופן ידני

הערה: לקבלת פרטים, ראה איור 4.

  1. הפעל את התוכנית nanodispenser נפק, עבור אל הכרטיסיה אבחון, סמן את לוחית המקור Out box, טען את לוחית המקור על מחזיק הצלחת, ו לתקתק כדי להיכנס לצלחת. כשתתבקש, בחר 384Ldv_ Aq_2 כדי להגדיר את הננו-מנפק למצב מאגר ממים מימית ולחץ על אישור.
  2. בחר סקר בתפריט ' שונות ' ולחץ על ' הפעלה '. בחר את הבארות מילא כדי לנתח ולחץ על כפתור Go . ודא שאמצעי האחסון שנמדדו תואמים לאלה הצפויים וודא שאין בארות שנטענו עם אמצעי אחסון של יותר מ-12 μL מאחר שפעולה זו תמנע העברות.

figure-protocol-3
איור 4 : הגדרת פרמטרי תוכנת הסקר. (1) להתחיל בתוכנית nanodispenser נפק. (2) פתח את הכרטיסיה ' אבחון '. (3) הכנס את לוחית המקור על ידי תקתוק לוחית המקור ולאחר מכן, בתוך. (4) הגדר את סוג לוחית המקור בתפריט כשתתבקש. (5) בתיבה שונות, בחר באפשרות סקר בתפריט הנפתח. (6) השקת תוכנית הסקר על ידי לחיצה על ההשקה. (7) בחר את הבארות שמולאו מראש כדי למדוד. (8) להתחיל את הניתוח על ידי לחיצה על ללכת. (9) לאחר הסקר מבוצע, הכרכים הנמדדים נכתבים בבארות הנבחרות המתאימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

6. מונע אייד DNA היתר לתוך לוחית היעד

  1. הפעל את תוכנת רשימת הבחירה, הגדר את סוגי לוחית המקור והיעד של 384-היטב ל-384_LDV ו-Greiner 384PS_ 781096, בהתאמה (איור 5). הגדר את ההתקן למצב של מאגר ממים מימית על-ידי בחירה באפשרות 384ldv_ aq_2, ופרוש "מיטוב תפוקת העברה ".

figure-protocol-4
איור 5 : ביצועים של הקלות בחירה מבוססי הקלות. (1) הפעל את תוכנת ננו-מנפק. בכרטיסיה פרוטוקול, בחר (2) תבנית הלוחית לדוגמה (3) סוג לוח היעד ו-(4) ללא קרציות "מיטוב תפוקת העברה". (5) בחר בכרטיסיה רשימת בחירה . (6) לחץ על ייבוא ובחר את הקובץ המתאים *. csv (DNA-רשימת בחירה או טי-בחירה). (7) נבחר לאחר מכן, לחץ על יבא. (8) לחץ על הפעל ושמור את הפרוטוקול. (9) לבצע סימולציה היתר על ידי לחיצה על הדמיית, או (10) להתחיל את היתר מתוכנתים על ידי לחיצה על הפעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בחר בכרטיסיה "בחר רשימה", לחץ על יבא, בחר את הקובץ DNA-Picklist. csv. לחץ על הפעל ושמור את הפרוטוקול. לחץ על הדמיית כדי לבצע הדמיה של היתר מתוכנתים כדי לוודא כי רשימת הבחירה תואם את העיצוב הניסיוני צפוי. לאחר השלמתו, לחץ על סגור.
  2. לחץ על הפעל, ולאחר מכן להפעיל, כדי להתחיל את התוכנית לחילוק: כאשר נשאל, להכניס את לוחית המקור המבוקש (פתרונות DNA מלאים ידנית) ואת לוחית היעד (מדלל) הננו.
    הערה: זמן החילוק הוא כ 5-20 דקות לצלחת מלאה 384-באר, בהתאם לאמצעי האחסון הנבחרים ולמספר הכולל של הקלות בתכנון הניסיוני.
  3. לחילופין, להשהות את הפרוטוקול כאן כמו לדילול-ו-DNA צלחות מלאות יכול להתמודד עם אחסון יבש או קפוא עד 7 ימים. לאחסון יבש, ניתן ללוחות להתייבש על הספסל בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאחסן אותם באותה דרך. הפשרה וצנטריפוגה (ב 1,500 x g עבור 2 דקות) מוקפאים לוחות מאוחסנים לפני השימוש בשלב החצייה (סעיף 7).
     

7. היתר מגיב בשיטת אייד

  1. בארונית ביו-בטיחות, extemporaneously ליפופיוליקס מגיב בינונית ללא סרום לריכוז סופי של 1x. מערבולת ומיד לוותר על תערובת מגיב זה בהתאם ללוח המקור המוגדרים מראש (s) שתוכנן על ידי המאקרו ובאמצעות מכויל 384-ובכן מדריך ללטף את היישום כמתואר בשלב 3.4.
    הערה: אין לצנטריפוגה את לוחית המקור ברגע שהוא טעון עם מגיב כאשר החצייה לא הבחין לאחר צנטריפוגה.
  2. הפעל את התוכנית nanodispenser נפק כדי לבצע "סקר" כמתואר בסעיף 5, על מנת לשלוט על כרכים של כל מילא באופן ידני TR וולס של לוחית המקור (s) כדי למנוע שגיאות לחילוק בשל אמצעי אחסון העולה על 12 μl.
  3. לחץ על איפוס כדי לנקות את הרשימה לדוגמה של רשימת הבחירה של ה-DNA בתוכנת רשימת הבחירה, וודא שפרמטרי ההתקן עדיין מוגדרים למאגרים מימית ולסוגי לוחית המקור והיעד בהם נעשה שימוש, כמו בשלב 6.1.
  4. לחץ על יבא ובחר את הקובץ TR-Picklist. csv. לחץ על הפעל ולשמור את הפרוטוקול אם תתבקש, ו (זה אופציונלי אך מומלץ מאוד) לבצע הדמיה של הקלות מתוכנתים התערובת מגיב להקלות כדי להבטיח את העיצוב הנכון של היתר על ידי לחיצה על הדמיית לחצן. לאחר השלמתו, לחץ על סגור.
  5. לחץ על הפעל, ולאחר מכן להפעיל כפתור כדי להתחיל את התוכנית לחילוק: כפי שביקשת, למקם את לוחית המקור (עם) (TR-תערובת-מלא) ואת לוחית היעד (לדלל-ו-DNA מלא) ב nanodispenser נפק.
    הערה: זמן החילוק הוא פחות מ-20 דקות עבור צלחת מלאה 384-היטב כאשר מחלק 500 nL של תערובת TR.
  6. דגירה 15-30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הוספת TR ל-DNA כפי שמצוין על ידי פרוטוקול היצרן.

8. תא מפעיל לטיפול בנוזלים

  1. הכן את המטפל הנוזלי הפריסטטי. לתאים מסוימים חטא מראש קלטת 10 μL על-ידי ריסוס עם הגולש Aniospray לגלישה 29 חיטוי וקליטת השריד על הנייר. הר את הקלטת על המכשיר המטפל בנוזל הפריסטלטי, לשנות את הגדרת סוג הקלטת ל 10 μL, וודא שתבנית הלוח מוגדרת ל-384 בארות.
  2. חטא את הצינורות הקסטה 10 μL כפי שמתואר בעבר בשלב 4.2. לצלול מארגן הצינור בכלי סטרילי ולשטוף את אבובים עם 5 מ ל של 70% אלכוהול, אז עם 5 מ ל של מים מזוקקים, ולבסוף, עם 5 מ ל של סרום ללא מדיום, מלא ברציפות באותו כלי ו עד כל צינור ריק.
  3. הכינו את ההשעיה של התא כדי לוותר. מצלחת B10-תרבות של החברה, לשטוף את התאים 1x עם תמיסת מלח באגירה 1 x פוספט (PBS), ולאחר מכן לנתק את התאים עם טריפסין/EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° c.
  4. בדוק את הדיסוציאציה של התא מתחת למיקרוסקופ ולהפסיק את הפעולה טריפסין/EDTA על-ידי הוספת 10 מ ל של בינונית מלאה (DMEM בתוספת הסרום העוברי 10% ו-100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין; לראות את הטבלה של חומר) בצלחת התרבות. הקציר תאים בצינור 50 mL ולספור את התאים מתחת למיקרוסקופ, באמצעות תא Mal, או מונה תאים אוטומטי.
  5. הכינו לפחות 25 מ ל של השעיית תא הלה בריכוז של 37,500 תאים/mL במדיום המלא (כלומר, 1,500 תאים/40 μL) עבור צלחת מלאה 384-באר, כדי להבטיח הטרמה הצינור 40 μL/ובכן היתר.
  6. כדי לוותר על התאים, למלא כלי סטרילי חדש עם ההשעיה התא המוכן ולעורר אותו כדי למנוע שיפוכי המוביל לחוסר דיוק בצפיפות התא של היתר. הכנס את מארגן הצינור בפתרון זה ולחץ על הלחצן הראשי עד שההשעיה של התא מתחילה לשטוף מהראש החילוק. ודא שאף אחד מהעצות אינו סתום על-ידי בדיקה חזותית של זרימת הנוזלים מכולן, וודא שכל צינורית נטענת עם השעיית תא.
  7. טען את ה-DNA ו-TR-מלא 384-ובכן לוחית היעד על המוביל לוחית הטיפול הנוזלי הפריסטלטית ולהסיר את המכסה שלה. הפעל את התוכנית מכוילים מראש כדי לוותר על 40 μL של השעיית התא על צלחת השלם 384-באר (כלומר, 1,500 תאים/טוב). . זמן החילוק הוא בערך שמונה החלף את המכסה של הצלחת 384-היטב.
    הערה: לחילופין, השעיית תא 40 μL ניתן לשימוש ידני באמצעות מיקרופיפטה רב-ערוצית.

9. שיטת ביולוגית מותאמת אישית (מעקב ביעילות התא)

הערה: בעקבות ההגדרות הנסיוניות וכוונת הניסוי, השתמש בשיטות הנדרשות לאור השמש, בקרינה פלואורסצנטית, בהקרנה בתוכן הגבוה ובשיעתוק הפוך ותגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR). בחלק זה של הפרוטוקול, יעילות החצייה של התא מוערכת באמצעות מיקרוסקופ קרינה אוטומטי וניתוח תמונה.

  1. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עם 5% CO2 באווירה רווי המים עד הביטוי חלבון תקין.
    הערה: כאן, זמן דגירה 48 h משמש עבור תאי הלה לפקח על יעילות החצייה, באמצעות tdTomato-ו-mVenus-ביטוי פלמידים.
  2. הסר את התרבות בינונית 48 h לאחר ההעברה על ידי היפוך הצלחת, להוסיף 30 μl/טוב של 10% פורמלין באמצעות המטפל נוזלי הפריסטטיק (10 μl קלטת), ו דגירה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את פורמלין על ידי היפוך הצלחת; אז, מודלת את התאים 15 דקות בטמפרטורת החדר עם 0.1 ng/mL Hoechst מדולל בפתרון 1x PBS.
  4. לשטוף את התאים 3x עבור 15 דקות עם 80 μl של 1 x PBS מותאם ל-pH = 8 כדי לשחזר את האות הפלואורסצנטית גבוה איבד על ידי 6.9 ה-ph של השלב הדגירה של פתרון פורמלין.
  5. באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט אוטומטי, לרכוש תמונות של שניים או שלושה ערוצי פלורסנט (Hoechst, tdTomato, ו mVenus) ברצף עם מטרות 10x ו מסנן פליטה נכונה סט (4 ′, 6-diamidino-2-פנילילינדול [DAPI], dsRed, ו fluorescein isothiocyanate [FITC], בהתאמה).
  6. כדי להעריך את היעילות המוגברת, השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לקבוע את היעילות המוגברת באמצעות ניתוח סקריפט המבוסס על צביעת גרעינים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לקבוע אם טכנולוגיית ה-ADE יכולה לשמש לפרוטוקול היפוך אוטומטי לאחור, אנו מנטרים את יעילות השימוש בתאי הקרינה על-ידי המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית, באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט אדום. ראשית מכוון לקביעת הפרמטרים הטובים ביותר החצייה, כמויות שונות של מדלל וכמות מוחלטת של DNA היו בדיקה צולבת. נפח דילול שימש כדי לאפשר את טיפות ה-DNA, לאחר הפריסה, להתפשט בכל רחבי הבארות כדי לעקוף את הזיהום הומוגנית נצפתה בניסויים ראשוניים (כלומר, רק במרכז הבארות). כפי שמוצג באיור 6A, ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמתה והאופטימיזציה של שיטת העברה מדויקת של תפוקה גבוהה עבור קו תאים נתון מחייבת מדענים לעקוב אחר כמה פרמטרים מרכזיים המתוארים בסעיף זה. אנו מעודדים מאוד להתחיל עם הערכים המומלצים במהלך הפרוטוקול כמו הגדרות אלה אופטימיזציה עבור תאי הלה הוכיחו גם להיות יעיל עבור תאי HEK. עם זאת, ככל שהפרמטרים הטובים ביותר עשויים להיות תלויים בקווי התאים ובחומרים השונים, התנאים האופטימליים יכולים להיות מוגדרים על-ידי שינוי מספר התאים, נפח הדילול, סכום ה-DNA הכולל, והטבעה מגיב, ריכוז, או אפילו אמצעי אחסון המשמשים כ מקרה במהלך האופטימיזציה ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים חשף קבלת התמיכה הפיננסית הבאה למחקר, מחבר ו/או פרסום מאמר זה: Inserm, אוניברסיטת ליל, מכון ליל-פסטר, Conseil Régional du Nord, ופרים-HCV1 ו-2 (שיא דה רצ'רצ'ה) למשל, סוכנות הידיעות הלאומית דה לה רצ'רצ'ה (ANR-10-04-01), הפדר (12001407 (ד-אל) ציוד לשעבר ביומד והקהילה האירופית (ERC-STG n ° 260901). המחברים רוצים להודות לד ר ש. מוראד, ד ר ב. וילרומאן, ד ר ר. פרירו-קלנט, וד ר ח. גראשט על הביקורת הקריטית והתיקונים של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
384LDV MicroplateLabcyteLP-0200
384 בארות Microplate μ גריינר שחור שקוף781906
AmpicilinSigmaA9393-5Gאנטיביוטיקה לבחירה לחיידקים שעברו טרנספורמציה עם וקטור ביטוי אמפיצילין
טאבלט אנדרואידסמסונגגלקסי נוט 8משמש להנחיית המשתמש בזמן שלוחית המקור ידנית מחלק
Aniospray Surf 29Anios2421073חומר חיטוי לניקוי ראש MicroFlo
קולומבוס תוכנהפרקין אלמרתוכנת ניתוח תמונה
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובטתרמו פישר 10566032 מדעימדיום תרבית תאים
Echo Cherry Pick 1.5.3 תוכנתLabcyteהמאפשרת חלוקה מבוססת ADE על ידי מכשיר Echo550 מקובץ *.csv; תוכנת ננו-מתקן
Echo550Labcyteמתקן מבוסס
ADE Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000044להוסיף במדיום תרבית תאים
תמיסת פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lלקיבוע
תאי HeLaATCCHeLa (ATCC® CCL-2&סחר;)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל במים
INCell Analyzer 6000GE Healthcare29043323 פלטפורמת הדמיה קונפוקלית אוטומטית מבוססת לייזר
LB בינוניThermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, מדיום תרבית 12780052		אבקה לגידול
חיידקיםמאגר ליזה (A2) Macherey-Nagel740912.1מאגר מערכת הפלסמיד NucleoSpin המשמשת להכנת פלסמיד מתרבית חיידקים
MicroFlo 10µ קלטת LBiotek Instruments Inc7170013לשימוש עם מתקן Microflo MicroFlo
1μ קלטת LBiotek Instruments Inc7170012לשימוש עם מתקן Microflo
מתקן MicroFloBiotek Instruments Inc7171000מכשיר לטיפול בנוזלים מבוסס משאבה פריסטלטית
ספקטרופוטומטר ספקטרופוטומטרDenovixDS-11למדוד את ריכוז ה-DNA של דגימות
mVenus פלסמידmVenus cDNA שובט על ידי הגבלה אנזימטית, עיכול וקשירה באתרי Age1/BsrG1 של סוג וקטור הפלסמיד tdTomato-N1: ביטוי יונקים, חלבון היתוך: mVenus
Macherey-Nagel740913.1מאגר מערכת NucleoSpin Plasmid המשמשת להכנת פלסמיד מתרבית חיידקים
ערכת פלסמיד NucleoSpinMacherey-Nagel740588.50המשמשת להכנת פלסמיד מתרבית חיידקים
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) MediumThermo Fisher Scientific31985070
מאגר כביסה אופציונלי מאגר כביסה (A4)Macherey-Nagel740914.1מאגר מערכת הפלסמיד NucleoSpin המשמשת להכנת פלסמיד משייקר מסלולי תרבית חיידקים
 שייקר בעל קיבולת גדולה מודגר444-7084משמש לגידול חיידקים תחת תסיסה עדינה ו 37° C
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר 15140122 מדעי10,000 U/mL
מאגר פוספט מלוחתרמו פישר10010001
מיני עמודות פלסמידMacherey-Nagel740499.250מיני עמודה של קרום סיליקה להכנת פלסמיד מתרבית חיידקים
מאגר השעיה מחדש (A1) Macherey-Nagel740911.1מאגר מערכת NucleoSpin Plasmid המשמשת להכנת פלסמיד מתרבית חיידקים
RNAse אנזים740505 Macherey-Nagelמערכת NucleoSpin Plasmid המשמשת להכנת פלסמיד מתרבית חיידקים
tdTomato-N1 פלסמידAddgenePlasmid #54642סוג וקטור: ביטוי יונקים, חלבון היתוך: tdTomato 
מערכת אספקה דינמית TransIT-X2Mirus BioMIR 6000
Wash Buffer (AW)Macherey-Nagel740916.1מאגר מערכת NucleoSpin Plasmid המשמשת להכנת פלסמיד ממדפסת תלת מימד מתרבית חיידקים
CrealityCR10Sהמשמשת להדפסת מתאם הצלחת
תוכנת בלנדר   https://www.blender.org/
תוכנה חופשית תחת רישיון ציבורי כללי של גנו (GPL).		גרסה 2.79bהמשמשת לעיצוב מתאם הלוחית
תאים Neutralization Buffer (A3) 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36(2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4(2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1(2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937(2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023(2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ADE384

מאמרים קשורים