Method Article

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

DOI:

10.3791/59576

⸱

April 27th, 2019

 ,  ,  , 
1Integrated Science Center, Biology Department, College of William & Mary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סומו הוא הכרחי ושמרו במידה רבה, חלבון שימור קטן כמו הצירוף. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש רקומביננטי העמידות בפני סומו חלבון השמנה להשמנה (kmUTAG) כדי להמחיש מקורי, שערי סומו לא מתויגים ולוקליזציה שלהם במגוון סוגי תאים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים שיטה מקורית לחקר הסורחון של חלבונים ולוקליזציה התת-תאית שלהם בתאי היונקים והנוציטים. שיטה זו מנצלת רקומביננטי שונה חלבון השמנה משבר, kmUTAG, נגזר פרוטאז Ulp1 סומו של הלחץ עמידים שמרים הmarxianus. התאמתי את המאפיינים של kmUTAG למטרת לימוד סומולציה במגוון מערכות מודל ללא שימוש בנוגדנים. למחקר של סומו, KmUTAG יש כמה יתרונות כאשר לעומת הגישות מבוססות נוגדן. זה מאוד עמידים להשמנה סומו השמנה מופק recombinantly, הוא מזהה איזופורמים מקורי של מינים רבים, ובניגוד נוגדנים זמין מסחרית זה מראה זיקה מופחתת עבור סומו בחינם, מצומת. תוצאות הנציגה המוצגות כאן כוללות לוקליזציה של שערי מעלה סומו בתאי תרבות של רקמת היונקים ו נמטודות אוציטים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת שיטה זו היא להקל על המחקר והניתוח של חלבונים סומו מצובגים באמצעות רקומביננטי הסומו השמנה UTAG (Ulp בתחום תג) חלבון. כפי שמפורט להלן, UTAG ניתן להשתמש במקום של ריאגנטים אחרים וגישות לטהר, לזהות, ולדמיין חלבונים ששונו סומו. בהתאם לתנאי הגדילה, תאים עשויים להכיל מאות או אלפי חלבונים שהשתנו עם שרשראות סומו או סומו (לסקירה ראה קרשר ואח ' 20061 ו kerscher 20162). זה מייצג קושי ניכר עבור ניתוחים פונקציונליים של חלבונים ספציפיים ששונו הסומו, במיוחד מאז רק חלק של היעד מסוים sumoylation שונה למעשה3. בנוסף לתפקידם בתהליכים סלולאריים חיוניים כגון רגולציה, הומאוסטזיס חלבון, התגובה למתח הסלולר, ושיפוץ כרומטין במהלך מיטוזיס ומיוזיס; עכשיו זה הופך מספיק ברור כי סומו, סומו שונה חלבונים, ורכיבים מסלול סומו יש גם פוטנציאל של ביואריקרס לפתווגיות כגון סרטן והפרעות ניווניות4,5,6 ,7. זה מדגיש את הצורך חזק, אמין, כלים זמינים וגישות חדשניות עבור זיהוי וניתוח פונקציונלי של חלבונים ששונו סומו במגוון של תאים ודגימות.

במערכות רבות, נוגדנים ספציפיים סומו הם ריאגנטים של בחירה עבור איתור, בידוד וניתוחים פונקציונליים של חלבונים ששונו סומו8,9. עם זאת, כמה נוגדנים מסחריים ספציפיים סומו מסוימים הם יקרים, מוגבל בכמות או זמינות, נוטה להציג משתנה בפראות משתנים ופעילות צולבת, ובמקרים מסוימים חוסר התוכנות10. גישה חלופית אחת היא הביטוי של אפירופה-מתויג סומו בתאים ואורגניזמים שעברו שינוי, אך הקישור תגי אפירופה לסומו עשוי באופן מלאכותי להקטין את הקוניוגציה למטרות חלבונים11. בנוסף, האפיסקופים אינם שימושיים כאשר מוערכים תאים או רקמות שאינם משתנים.

Ulp1 הוא פרוטאז סומו שימור מ -S. cerevisiae ס כי שני התהליכים הקודמן סומו ו desumoylates סומו מצווים חלבונים12. פיתחנו את מגיב UTAG מבוסס על התבוננות קרי כי מוטציה של ציסטיין קטליטי (C580S) ב Ulp1's הסומו עיבוד Ulp domain (עוד) לא רק מונע מחשוף סומו אלא גם מלכודות סומו-מצועם חלבונים עם גבוה ובכן12. למען הפשטות, התייחסנו לUlp1 האלה להשמנה של סומו מסופים, בדומה ל-UTAG (קיצור של UD TAG). UTAG הוא חלבון רקומביננטי פאן-סומו השמנה המייצגת חלופה שימושית לנוגדנים אנטי סומו המשמשים לבידוד ואיתור של חלבונים ששונו סומו. וחשוב מכך, הוא מזהה באופן מקורי-מקופל, סומו מצופלת ולא רק אפיסקופים אחד או מספר על סומו. כדי לשפר הן את יציבות החלבון ואת חוזק כריכת סומו של UTAG, יצרנו גרסה של UTAG מן הלחץ עמידים שמרים Kluyveromyces marxianus (ק מ). KmUTAG נקשר בחוזקה סומו-מבצוערים עם זיקה nanomolar13. בנוסף, kmUTAG עמיד בטמפרטורות גבוהות (42 ° c), הפחתת סוכנים (5 מ"מ TCEP-טריס (2-carboxyethyl) פוספלין הידרוכללוריד), denaturants (עד 2 שתנן), סוכני אוקסיגון (0.6% תחמוצת מימן), וחומרי ניקוי לא יוניים. סובלנות זו מועילה במהלך מצב טיהור קשה וזמני דגירה ממושכים, ומבטיחים את היציבות ופעילות ההשמנה של הסומו. לא באופן מפתיע, עם זאת, הפעילות לכידת סומו של KmUTAG אינו תואם את cysteine שינוי ריאגנטים, חומרי ניקוי יוניים ותמציות חלבון מלאה. האהדה והתכונות היוצאות מהכלל של KmUTAG מעידות על כך שניתן להפוך את הדבר לחלק מהרפרטואר הסטנדרטי לחקר חלבונים מסוחיים במינים מרובים.

כאן אנו מספקים שיטה פשוטה כדי לזהות חלבונים ששונו הסומו בתאי היונקים והנטודות באמצעות רקומביננטי פלורסנט mCherry-KmUTAG פיוז'ן חלבון (kmUTAG-fl).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איתור סומו בתאי תרבות קבועה ברקמה באמצעות רקומביננטי KmUTAG-FL חלבון השמנה להשמנה

  1. הגדל תאים התרבות הרקמה של בחירה על 22 מילימטר עגול לכסות מחליק 6-היטב לוחות TC עד 70% – 80% confluent. בצע את שלבים 1.2 – 1.8 בצלחת 6-באר.
  2. לשטוף את התאים בקצרה עם 1 מ ל של DPBS (מלוחים פוספט באגירה של דולבקו)
  3. עבור קיבעון, להכין פתרון טרי של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) פתרון (מדולל ב-DPBS). כדי לתקן תאים, להוסיף 2 מ"ל 4% בכיוון השני של DPBS לכל טוב. דגירה את התאים 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: יש לבצע את כל השלבים הבאים באמצעות השימוש בה, במכסה של בטיחות מעבדה ולעשות זאת כראוי.
  4. לשטוף את התאים קבוע 3x ב 1 mL DPBS בזמן הצלחת, 5 דקות כל כביסה.
  5. כדי לחלחל תאים, מודטת עבור 15 דקות עם 0.1% טריטון X-100 ב DPBS
  6. לשטוף את התאים 3x ב 1 mL DPBS בזמן לשאת את הצלחת, 5 דקות כל לשטוף
  7. דגירה את התאים עם 500 μL של 0.1 M גליצין-HCL (pH 2.0) עבור 10 s, ולאחר מכן לנטרל pH מיד עם 500 μL של 10x מאגר פרוטאז הסומו (SPB).
  8. לשטוף את התאים 3x ב 1 mL DPBS בזמן להפלטה, 5 דקות כל שטיפת
  9. הסר את הכיסויים מבאר ומניחים אותם בתא לחות. ואז להמשיך עם incubations על שמיכות כדלקמן:
    1. עבור UTAG-fl כתמים בלבד: מערבבים 1 μg UTAG-fl עם 100 μL של 1x SPB המכיל 5 מ"מ TCEP בצינור, פיפטה את התערובת על התאים על הכיסויים, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h בחדר הלחות.
    2. באופן אופציונלי, עבור UTAG-FL ו anti SUMO1 נוגדן שיתוף כתמים, להמשיך עם הבאים:
      1. מערבבים בצינור 1 μg UTAG-FL ו 0.5 μL SUMO2/3 8A2 (שהתקבל למחקרים התפתחותיים יפידים Bank9) עם 100 μl של חסימת מאגר, פיפטה את התערובת על הכיסויים, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h.
      2. לשטוף את התאים על שמיכות 3 פעמים עם 200 μL DPBS, 5 דקות כל כביסה.
      3. מערבבים צינור 0.5 μL נגד העכבר אלקסה Fluor 488 נוגדן מצובית עם 100 μL חסימת מאגר, פיפטה את התערובת על הכיסויים, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h.
  10. כדי לשטוף כיסוי, פיפטה 200 μL DPBS על כל שמיכות ולעזוב במקום 10 דקות. חזור על השטיפה עוד פעמיים.
  11. הסר שקופית מתוך השטיפה האחרונה והפוך אותה לשקופית מיקרוסקופ מוקדמת עם טיפה של הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים).
  12. חנות לילה במקפיא של 20 ° c לפני הצפייה מתחת למיקרוסקופ. המחש באמצעות ערכות הסינון המתאימות ל-DAPI (DNA), טקסס רד (kmUTAG-fl), ואלקסה Fluor 488 (אם מבוצעת SUMO2/3 כתמים אופציונליים).

2. זיהוי סומו בגונדות מנותדה קבוע באמצעות UTAG-fl

  1. העבר המאלף מבוגרים ל-droplet של 8 μL של מאגר ביצים14 בשקופית שטעונה בתוספת שהיתה מצופה בפולי-ל-ליזין. שחררו גונדות מן התולעים באמצעות 27.5 G מחטים. המשיכו עם תיוג או הדבקת נוגדן או תיוג UTAG-fl.
  2. עבור דגימות נוגדנים לתיוג, המשך כדלקמן:
    1. הקפאת הקראק דגימות בחנקן נוזלי ולאחר מכן לתקן לילה ב-20 ° c מתנול בצנצנת Coplin.
    2. גם בצנצנות Coplin, לשטוף שקופיות 3 פעמים ב-1x PBS, ואז לחסום עבור 20 דקות ב-PBS המכיל 0.5% BSA ו 0.1% רצף 20.
    3. הוסף 30 μL של נוגדן 6F2 אנטי סומו (1:10) לכל שקופית המכסה את הדגימות. המלון משלב בין לילה בחדר לחות ב -4 ° c.
      הערה: סומו 6F2 התקבל ממחקרים התפתחותיים יפידים בנק15.
    4. בצנצנות Coplin, לשטוף שקופיות עבור 2 דקות ב-1x PBS, לאחר מכן לכסות דגימות מודלחות עם 30 μL של DyLight 488 עז אנטי עכבר משני נוגדן (1:200) עבור 1.5 שעות בתא לחות בטמפרטורת החדר.
    5. בצנצנות של Coplin, לשטוף שקופיות עבור 2 דקות ב-1x PBS, לבצע טבילה מהירה ב-dH20 ולאחר מכן לטעון את השקופיות עם הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים).
  3. עבור תיוג KmUTAG-fl, המשך עם הפרטים הבאים:
    1. כדי לתקן תאים, להוסיף נפח 1 של 8% PF לדגימות עבור ריכוז סופי של 4% PF. תקן עבור 10 דקות בחדר לחות ולאחר מכן להרוות את התגובה על ידי העברת שקופיות צנצנת Coplin המכילה 1x PBS עם 0.1 M גליצין לפחות 5 דקות.
    2. בצנצנות Coplin, לשטוף את התאים 5 דקות ב-1x PBS, ולאחר מכן לחלחל את הדגימות ב-1x PBS המכיל 0.1% טריטון-X עבור 10 דקות.
    3. לשטוף בצנצנת Coplin עבור לפחות 5 דקות ב-1x PBS, ואז להוסיף 200 μL של 0.1 M גליצין-HCl (pH = 2.0) לדגימות על השקופית במשך 10 שניות. מיד להוסיף 200 μL של 10x SPB לנטרל את ה-pH.
    4. שטוף את השקופית ב-1x PBS בצנצנת של Coplin עבור 5 דקות.
    5. הסרת שקופית מכביסה ופיפטה 100 μl של 1x spb + 5mm tcep המכיל 2 μg של utag-fl ל-נמטודות על השקופיות, ו-דגירה בחדר לחות עבור 1 h ללא נדנדה.
    6. החזר את השקופית לצנצנת הקופלין ושטוף 15 דקות ב-1x PBS
    7. הסר את השקופית מהשטיפה, השתמש בניגוב מעבדה כדי להתייבש מסביב למדגם, ולאחר מכן הבהר את השקופיות עם 5 μL של הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים). אחסן את השקופיות ב-4 ° c. להמחיש באמצעות ערכות מסנן המתאים DAPI (DNA), טקסס אדום (kmUTAG-fl), ו DyLight 488 (SUMO2/3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KmUTAG-fl הוא רקומביננטי, החלבון מתויג להשמנה סומו. כדי לייצר kmUTAG-fl, שירמנו מיטוב codon ממוטבת-kmUTAG לתוך הpSPOT1 בקטריאלי בקטריות ביטואמצע (איור 1). לאחר האינדוקציה, החלבון kmUTAG-fl היה מטוהר במלכודת ספוט, שהוקפא והוקפא עד לשימוש נוסף. כדי להבטיח את הפעילות לכידת סומו של KmUTAG-fl, אנו אישר את הכריכה ל SUMO1-מצושל חרוזים ומשקעים של חלבון היתוך החתול סומו (נתונים לא מוצגים, אבל לראות את העבודה הקודמת13).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים את השימוש של kmutag-fl, חלבון רקומביננטי, למחקרים פונקציונליים של סומו בתאי יונקים קבועים ובעל בלוטות המין נמטודות. KmUTAG-fl הוא מאוד עמידים ללחץ הפאן-סומו מגיב ספציפי מזהה ומלכודות מקורי סומו מצועם ושרשראות סומו. מאז המבנה השלישוני של סומו הוא שימור מאוד זה סביר מאוד כי משתנים סומו ממודל נוסף מערכות שאינן מודל ניתן לנתח עם מגיב kmUTAG-fl. בתור שכזה, KmUTAG-fl עשוי לייצג חלופה שימושית או משנית עבור פרוטוקולי נוגדנים מסורתיים מכתים.

יש תקדים מספיק לשימוש בחלופות שאינן נוגדנים, כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקומביננטי kmUTAG ריאגנטים מסופקים לקהילת המחקר דרך Kerafast.com.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות לכל חברי מעבדת קרשר על תמיכתם, נטלי נגוין לקריאה קריטית של כתב היד, ו Lidia Epp לרצף. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המיסחור מחקר של חבר העמים MF16-034-LS כדי OK. הסיוע במחקר לתלמידי W & M סופק על ידי קרן ביילי-יוסטון למחקר, ושארל סנטר כבוד מלגות ל-RY ו-CH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% פרפורמלדהיד (פורמלדהיד) תמיסה מימיתמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית30525-89-4
צלחות תרבית תאים 6 בארותGenesee Scientific/Olympus Plastics25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-545-003משמש כנוגדנים משניים לנוגדנים חד-שבטיים של עכבר
DPBS, ללא סידן, לא מגנזיוםפישר סיינטיפיקGibco 14190144
Dylight 488 מצומד AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-485-146משמש כנוגדנים משניים לנוגדנים חד שבטיים של עכבר
Fisherbrand Coverglass למשקפיים לכיסוי צמיחהFisherbrand12545101
FLUORO-GEL II עם DAPI ElectronMicroscopy Sciences50-246-93)מדיית הרכבה בשלב 1.11
FLUORO-GEL עם DABCOElectron Microscopy Sciences17985-02עם DAPI נוסף ל-1 ומיקרו; גרם/מ"ל; מדיית הרכבה בשלב 2.2.5
Glycine-HClFisher BioReagentsBP3815
Glycine-HClACROS Organics6000-43-7
KmUTAG-flריאגנטים KerafastKmUTAG זמינים ב-Kerafast.com
Oneblock Western-CL חוסם מאגרפרומתאוס20-313
PBS, מי מלח חוצץ פוספט, 10X SolutionFisher BioReagentsBP3994
PNT2 קו תאיםSigma-Aldrich95012613אפיתל ערמונית רגיל אימורטליזציה עם SV40.
pSPOT1(ChromoTek GmbH)ev-1https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2DSHBSUMO 6F2 SUMO6F2 הופקד ל- DSHB על ידי Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
מאגר פרוטאז SUMO [10x]500 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 נוגדן 8A2DSHBSUMO-2 8A2SUMO-2 8A2 הופקד ב-DSHB על ידי Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCLGoldBio51805-45-9משמש כחומר הפחתה בריכוז של 5mM
Triton X-100Fisher BioReagents9002-93-1משמש לחדירה ב-0.1% ב-DPBS/PBS (לתולעים)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
  2. Kerscher, O. SUMOylation. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).
  3. Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
  4. Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
  5. Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
  6. Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
  7. Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477(2017).
  8. Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
  9. Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
  10. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
  11. Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
  12. Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
  13. Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391(2018).
  14. Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  15. Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769(2014).
  16. Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
  17. Ruckman, J., et al. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
  18. Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005(2017).
  19. Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572(2018).
  20. Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
  21. Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SUMO trapping ProteinFluorescent UTAGSUMO DetectionMammalian CellsNematode OocytesAntibody free MethodSUMO ConjugatesNuclear LocalizationParaformaldehyde FixationMicroscopy Visualization

Related Articles