כאן אנו מציגים פרוטוקול החלים בקלות כדי להעריך את יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות, קבוצה של חלקיקים המתרחשים באופן טבעי המיוצר על ידי תאים. שלפוחיות הם טעונים עם glucuronidase כאנזים מודל מאוחסן בתנאים שונים. לאחר האחסון, הפרמטרים הפיזיקליים שלהם והפעילות של האנזים שעברו האנקפסולציה מוערכים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
שלפוחיות שלפוחית (EVs) הם מטרות מבטיחות במחקר הנוכחי, לשמש סמים, סוחרי סמים, ו בסמנים. עבור הפיתוח הקליני שלהם, לא רק פעילות התרופות שלהם חשוב, אלא גם הייצור שלהם צריך להיות מוערך. בהקשר זה, המחקר מתמקד בבידוד של EVs, האפיון שלהם, האחסון שלהם. כתב היד הנוכחי שואפת לספק הליך נתיישב להערכת ההשפעה של תנאי אחסון שונים ב-EVs, ללא מניפולציה גנטית או assays פונקציונלי ספציפי. זה מאפשר במהירות לקבל רושם ראשוני של היציבות של EVs תחת מצב אחסון נתון, ו EVs נגזר ממקורות תאים שונים ניתן להשוות בקלות. מידת היציבות מתבססת על הפרמטרים הפיזיקליים של EVs (גודל, ריכוז חלקיקים ומורפולוגיה) ושימור פעילות המטען שלהם. האחרון הוא העריך על ידי saponin בתיווך עטיפת האנזים ביתא-glucuronidase לתוך EVs. Glucuronidase משמשת כפונדקאית ומאפשרת כימות קלה דרך המחשוף של מולקולת כתב פלורסנט. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות כלי עבור חוקרים בחיפוש אחר תנאי אחסון באופן אופטימלי לשמור על מאפייני EV כדי לקדם מחקר EV לקראת יישום קליני.
מבוא
EVs הם חלקיקים מאוגד קרום המיוצר על ידי כל סוגי התא כמעט. עבור תאים ממיונקים, EVs ניתן לחולק לשתי קבוצות עיקריות עם שבילים הפקה ברורים1,2. שלפוחיות ממברנה, עם טווח גודל של בערך 100-1000 ננומטר, מיוצרים על ידי הנצה ישירה מקרום התא. אקסוזומים, בגודל 30-200 ננומטר, נגזרות מגופים רב שנוצרו על ידי הבנה פנימה לתוך אנזומים כי לאחר מכן הפתיל עם קרום התא כדי לשחרר האקסוזומים מרובים בבת אחת. הפונקציה העיקרית של שלפוחיות אלה היא העברת מידע בין תאים3. למטרה זו, מטענים כגון RNA, DNA, ו חלבונים ממוינים באופן פעיל לתוכם. EVs יכול להעביר מגוון של אפקטים על המטרות שלהם, עם השלכות על מצב בריאות ומחלות הן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות התא והפקת מדיום ממוזג
- בדרך כלל, לטפח תאים תחת התנאים הבודדים הנדרשים לקו התא המתאים.
- לטפח את התאים עבור 24-72 h בתנאים ללא סרום או בינוני המכיל סרום העוברי EV מרוקן (FBS).
הערה: אם משתמשים ב-EV FBS, להעסיק שיטה שהווכחה ביעילות לרוקן את הנסיוב, כדי למנוע זיהום עם סרום בצורת הפרה EVs26. - לאסוף את המדיום מן הצלוחיות. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות כדי הגלולה התאים. לאסוף בקפידה את המדיום הממוזג (CCM), מבלי להפריע את התאים הפלטאד. רצוי להשתמש ב-CCM ישירות, או לאחסן אותו בין לילה ב -4 ° c.
הערה: תמיד עדיף להשתמש ב-CCM שיוצרו בטריות. אם לא ניתן להקיף את האחסון בפרקי זמן ארוכים יותר, יש להקליט את ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג את מאפייני האחסון של EVs מבודדים מ-HUVECs. EVs היו מבודדים על ידי ה-UC, glucuronidase היה אנקפסולציה, ואחרי שניות, EVs מטוהרים הוערכו על המאפיינים הפיזיקליים שלהם על ידי נ. ב. א. מדגם של שלפוחיות היה נתון לאחר מכן לטיהור AF4 ופעילות glucuronidase נמדד.
השלפוחיות אוחסנו לאחר מכן ל -7 מעלות ב -4 ° צ' או-80 ° c ו-4 ° c בצורת ליאופפיהן, במקרה האחרון עם תוספת של 4% trehalose. לאחר האחסון, שלפוחיות היתר נמדדו שוב על ידי נ. ת. ע, ולאחר AF4, פעילות הglucuronidase שנותרה לכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף לחקר יציבותה של EVs תחת תנאי אחסון שונים. עם שילוב של glucuronidase כדורית כבדיקה תפקודית והערכה של הפרמטרים הפיסיוכימיים של EVs, הפרוטוקול מאפשר הערכה ברורה של יציבות האחסון של EVs והשוואה של EVs מתא שונים קווים. SEM ו-TEM כשיטות משלימות מאפשרים תובנה לשינויים של EVs על רמת חלקיק יחיד. התוצאות המוצגות כאן הראו נטייה של EVs וליפוזומים לצבור עקב הליאופליזציה ללא כימיות (איור 6). עם זאת, זה נצפה רק בניסויים SEM. בעוד הדמיה EM לא נערך עם דגימות שנשמרו עם trehalose, הספרו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
תוכנית מחקר זוטר של ננו מהמשרד הפדרלי של החינוך והמחקר, גרמניה (גרנט מספר 13XP5029A) תמך בעבודה זו. מקסימיליאן ריכטר נתמך על ידי סטודיו דה Deutschen Volkes (קרן המלגות האקדמית הגרמנית) באמצעות מלגת דוקטורט.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 ס"מ&2; צלוחיות תרבית תאים | Corning | 431082 | בשימוש עם 25 מ"ל של |
| קרום תאית מחודש בינוני 30 kDa | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 ומיקרו; m spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| אספן שברים אוטומטי | תרמו פישר מדעי | ||
| בטא-גלוקורונידאז | סיגמא-אולדריץ' | G7646-100KU | |
| כלורופורם | פישר מדעי | C/4966/17 | |
| תנור עמודים | היטאצ'י טכנולוגיות גבוהות אירופה | ||
| D-(+)-טרהלוז דיהידראט | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, גלאי פיזור אור רב זווית | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore ממברנה מסנן, PVDF, 0,1 ומיקרו; מ', 47 מ"מ | Merck | VVLP04700 | משמש להכנת חוצצים עבור AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | מדיום בסיסי לגידול תאי אנדותל, המשמש לתרבית חופשית בסרום של תאי HUVEC |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | מדיום גידול תאי אנדותל, המשמש לתרבית רגילה של תאי HUVEC |
| ELISA Plate Sealers | R& D Systems | DY992 | משמש לאיטום צלחות 96 בארות לבדיקת גלוקורונידאז |
| אתנול | פישר מדעי | E/0665DF/17 | |
| סט מכבש עם מחזיק/בלוק חימום | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| תמיכת מסנן | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | המשמש להכנת ליפוזום |
| פלואורסצאין di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | משמש לכדורי תאים ב-300 גרם | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | משמש לכדורי פסולת גדולה יותר ב-3000 גרם | |
| תאי HUVEC | Lonza Verviers, ס.פ.ר. | C2517A | |
| קימבל FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, פוליפרופילן | VWR international | 525-0255 | הצינורות המשמשים לכל טיפול ב-EV, נמצאו נוחים יותר ממוצרים דומים מספקים אחרים לגבי שחזור חלקיקים |
| Nanosight LM14 מצויד בלייזר ירוק | Malvern Pananalytical | ||
| תוכנת Nanosight גרסה 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 ננומטר מסלול תחריט ממברנות פוליקרבונט | Whatman/GE Healthcare | 110406 | המשמשת להכנת ליפוזום |
| מחזיק מסנן מוטבע PEEK | Wyatt Technology Europe | ||
| הידרט חומצה פוספוטונגסטית | סיגמא-אולדריץ' | 79690-25G | |
| בקבוקי פוליקרבונט לאולטרה-צנטריפוגה | בקמן קולטר | 355622 | |
| ערכת בדיקת BCA QuantiPro | סיגמא-אולדריץ' | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים סורק Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM נחושת רשתות עם סרט פחמן | Plano | S160-4 | |
| ערוץ AF4 קטן | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| מיקרוסקופ אלקטרונים שידור JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti רוטור אולטרה-צנטריפוגה | בקמן קולטר | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex איזוקרטי משאבה | תרמו פישר מדעי | ||
| אולטימטיבי 3000 Dionex מסיר גזים ואקום מקוון | תרמו פישר מדעי | ||
| אולטרה צנטריפוגה אופטימהTM L-90 K | בקמן קולטר | ||
| גלאי UV | תרמו פישר מדעי | ||
| Whatman 0.2 ומיקרו; מסנן תאית מעורב בגודל נקבוביות m | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | משמש לסינון כל המאגרים המשמשים עם הרכבים החשמליים וב-SEC |
מקורות
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug t....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
