הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

6.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59593

⸱

5 בספטמבר 2019

 , 
1Blood Cell Development and Function Program, Fox Chase Cancer Center

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה עבור שימוש בזרימה רב פרמטרים cy, לנסות לזהות מיני מיטוכונדריאלי מינים חמצן (ROS) ב מורטין גזע בריא המטבית ובתאי מחולל (HSPCs) ותאי לוקמיה ממודל העכבר של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מונע על ידי MLL-AF9.

תקציר

אנו מציגים את הגישה cytometric הזרימה עבור ניתוח מיטוכונדריאלי של רוס החיים שונים מח עצם (BM)-גזע נגזר ואוכלוסיות תאים מחולל שונות עכברים בריאים, כמו גם עכברים עם AML מונע על ידי MLL-AF9. באופן ספציפי, אנו מתארים תהליך מכתים של שני שלבים, לפיו תאים בריאים או לוקמיה מוכתמים הראשון עם צבע פלואורוגנטי המזהה על-ידי מיטוכונדריאלי, ואחריו כתמים עם נוגדנים monoochrome מקושרים המקושרים המשמשים כדי להבחין בין אוכלוסיות שונות בריאות וממאירות של המטפאות. כמו כן, אנו מספקים אסטרטגיה לרכישת וניתוח הדגימות על-ידי הזרמת cy, try. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע בתוך פרק זמן קצר כמו 3-4 h. אנו גם להדגיש את המשתנים מפתח לשקול, כמו גם את היתרונות ואת המגבלות של ניטור הייצור של ROS בתוך תא מיטוכונדריאלי של לחיות המטפאות לוקמיה גזע ומתת באמצעות צבעים fluorogenic על ידי הזרמת cy, . יתר על כן, אנו מציגים נתונים כי השפע מיטוכונדריאלי משתנה בין אוכלוסיות משנה בריאה HSPC בריא ו לוקמיה ושלתי ולדון ביישומים האפשריים של טכניקה זו במחקר המטקולוגי.

מבוא

מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי מאוד הנגזרות חמצן מולקולרי. המיקום הסלולארי המוגדר ביותר של הייצור של ROS הוא המיטוגיה, שם אלקטרונים העוברים דרך שרשרת התחבורה אלקטרון (וכו ') במהלך זירחון חמצוני (OXPHOS) נספגים על ידי חמצן מולקולרי המוביל היווצרות של מסוים סוג של רוס שנקרא סופרתחמוצות1. באמצעות הפעולות של סדרה של אנזימים, שנקרא סופראוקסיד dismutases או sods, סופראוקסיד מומרים לתוך מימן, אשר מנוטרלים לאחר מכן לתוך מים על ידי אנזימים כגון קטלאז או peroxidases גלוטתיון (gpx). רטבאליות במנגנונים ROS-רגולטוריות יכול להוביל לייצור עודף של ROS, המכונה לעתים קרובות לחץ חמצוני, אשר יש תוצאות מזיקות וקטלניות פוטנציאל הסלולר כגון נזק מקרומולקולה (כלומר, DNA, חלבון, שומנים). יתר על כן, לחץ חמצוני קשורה מספר פתווגיות, כגון סוכרת, מחלות דלקתיות, הזדקנות וגידולים2,3,4. כדי לשמור על הומאוסטזיס מחדש ולמנוע לחץ חמצוני, התאים בעלי מגוון של מנגנונים ROS-ויסות5.

רמות פיסיולוגיים של ROS מסוימים נחוצים עבור המטפיאה המתאימה ומבוגרים6. עם זאת, העודפים ROS קשורה עם נזק DNA, בידול הסלולר ותשישות של גזע המטפאות ובריכת מחולל קדמון. יש גם ראיות כי שינויים בביולוגיה החמצון עשוי להיות שונה בין לוקמיה ותאים בריאים. לדוגמה, רמות ROS נוטים להיות גבוהים יותר בלוקמיה של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ביחס לעמיתיהם הבריאים שלהם ומחקרים אחרים הציעו כי תאי גזע לוקמיה לשמור על רמה נמוכה יציבה המדינה של רוס להישרדות7,8. חשוב מכך, אסטרטגיות לקבלת הבדלי מחלות מבחינה רפואית בהבדלים הללו הראו הבטחה במספר הגדרות סרטןהאדם 9,10. לכן, בחני אומר כי לאפשר הערכה של רמות ROS בדגמי העכבר עשוי לשפר את ההבנה שלנו איך מינים אלה תורמים לפיזיולוגיה הסלולר מחלות פתוגנזה, כמו גם פוטנציאל לספק פלטפורמה להערכת האפקטיביות של הרומן נגד חמצון-מיקוד טיפולים נגד סרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בעלי החיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במרכז הסרטן של פוקס צ'ייס.

הערה: תהליך העבודה של הפרוטוקול מחולק ל -4 חלקים כפי שמוצג באיור 1 והריאגנטים הנדרש מפורטים בטבלת החומרים.

1. מח עצם (BM) בידוד

הערה: MLL-AF9 עכברים לוקמיה נוצרו כמתואר בעבר11.

  1. שחזור מונו-גרעיני מח עצם בתאי, כפי שמתואר בעבר12,13,14,15, מסוג פראי C57. Bl6 עכברים (אשר לבטא את התקליטור 45.2 congenic) כמו גם מ C57. עכברים Bl6-SJL (אשר מבטאים את סמן CD 45.1 congenic) כי כבר מושתלים עם MLL-AF9-ביטוי תאים לוקמיה (CD 45.2+).
    הערה: BM ניתן לשחזר מעכברים או על ידי ריסוק12,13 או על ידישטיפה עצמות 14,15. עבור הניסויים המוצגים כאן, BM התאושש משני עכברים בריאים ולוקמיה דרך השטיפה.

2. מיטוכונדריאלי רוס Fluorogenic צביעת כתמים

  1. ברגע מונו-גרעיני מוח העצם התאים התגלו מעכברים בריאים ו/או לוקמיה, כתם סדרת מחלקים של תאים עם טריקון כחול ולספור באמצעות הומוציטוטומטר כדי לקבוע את המספר ההתחלתי של התאים BM סך.
  2. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. ומריף את הסופרנטאנט ולהשעות את הגלולה ב-F-PBS (PBS בתוספת 2% סרום העוברי העובר ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין קוקטייל) לריכוז של 2 x 106 תאים/mL.
  3. Aliquot 200 μL של השעיית תא לצינור לתוך 9 בודד צינורות בקרת צבע המסומנים כדלקמן:
    אין כתם, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (עבור HSPCs בריא בלבד), תקליטור 45.2-APC (עבור תאים לוקמיה בלבד), CD34-FITC, לצבוע מיטוכונדריאלי ולחיות/תא המתים כתם.
    הערה: אופציונלי שליטה חיובית אינדוקציה ROS מיטוכונדריאלי יכול להיות מוכן על ידי טיפול 2 x 105 תאים ב 200 μl עם 20 Μm של נתרן ביסולפיט (msb) עבור 1 h ב 37 ° צ' ב 5% CO2 חממה. פקד שני כדי להפוך את האינדוקציה MSB-בתיווך של מיטוכונדריאלי יכול להיות מוכן על ידי בטיפול 2 x 105 תאים ב 200 μl עם 20 ΜM של msb פלוס 100 Μm N-מרחקסיל-L-cysteine (nac) עבור 1 h ב 37 ° c ב 5% שיתוף2 אינקובטור.
  4. מחבר את התאים הנותרים בצינור (צינור ניסיוני) ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
  5. השהה מחדש את התאים ב-F-PBS עם כתם חי/מת בהתאם להוראות היצרן. מודקון על הקרח 30 דקות. הקפד להוסיף כתם חי/מת לצינור הבקרה בצבע יחיד.
  6. הוסף 1.0 mL של טמפרטורת החדר (RT) F-PBS לצינורות בצבע יחיד וניסיוני מוכתם עם צבע חי/מת. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
  7. השהה מחדש 50 μg של הצבע המודריאלי של רוס ב -13 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לקבל פתרון מניות של 5 מ"מ.
  8. לדלל את הצבע מיטוכונדריאלי לריכוז הסופי של 5 μM ב RT F-PBS עם או בלי Verapamil (50 μM).
  9. מוריד את הכתמים. מכתם התא החי/מת הוסף 200 μL של כתם מיטוכונדריאלי של צבע רוס המכיל Verapamil לכל שפופרת ניסיוני, כמו גם את הצינור מיטוכונדריאלי צבע יחיד בקרת שליטה.
  10. מערבולת לערבב ו הדגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c בחושך.
  11. הוסף 1.0 מ ל של RT F-PBS כדי מיטוכונדריאלי רוס המוכתמת שליטה בצבע יחיד ושפופרות ניסיוני. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
  12. ושטוף את התאים עם 1.0 מ ל של RT F-PBS. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.

3. נוגדן השושלת כתמים

  1. הכינו את משקאות הנוגדן המפורטים בטבלה 1.
    הערה: אלה קוקטיילים נוגדנים כבר אופטימיזציה בעבר14,15,16.
  2. מטפי את supernatant מן האחרון מיטוכונדריאלי לשטוף לצבוע של צינורות ניסיוני המכיל BM בריא ולהוסיף 200 μL של קוקטייל הנוגדן #1 לכל צינור. . מערבולת לערבב גם להכין את צינורות בקרת צבע אחד. דגירה של 60 דקות על קרח בחושך.
  3. מטפי את supernatant משטיפת מיטוכונדריאלי הסופי של הצינורות הניסיוניים המכילים לוקמיה BM ולהוסיף 200 μL של קוקטייל הנוגדן #2 לכל צינור. . מערבולת לערבב דגירה של 60 דקות על קרח בחושך.
  4. לשטוף עם 1.0 mL של קר F-PBS ו צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
  5. להשעות את התאים ב500 μl של קר F-PBS ולסנן את התאים בצינור cytometer זרימה באמצעות מסנן 40 יקרומטר כדי לכלול את האגרגטים.

4. הזרמת הרכש והניתוח

הערה: מספר מערכות המשנה של גזע ומין המטפאות הן נדירות, כגון תאי גזע המטפאות לטווח ארוך. כך, באופן אידיאלי 3-5 מיליון אירועים יש לאסוף עבור כל צינור ניסיוני במהלך הרכישה cy, לנסות ניתוח מספיק של רוס מיטוכונדריאלי בקבוצות משנה HSPC שונים.

  1. השתמש בצינור הבקרה ללא כתם כדי להגדיר את מחלקות הפיזור הפורוורד (FSC-A) והצד (האס-אס), המבוססות על הגודל והמורכבות של אוכלוסיית התאים שנותחה.
  2. השתמש בצינורות בקרת הכתמים והצבע היחיד כדי לפצות על הזרימה של cytometer.
  3. שער החוצה שרידים זרים מתוך החלקה קדימה ופיזור בצד (איור 2A, B, הפאנל הראשון משמאל).
  4. השער החוצה כפולה באמצעות מבדיל כפול כגון מבדיל קדימה (איור 2א, ב, הפאנל השני משמאל).
  5. בצע את אסטרטגיית השידור המוצעת באיור 2A,B כדי לבחור תאים חיים, השושלת הנמוכה תאים וערכות המשנה hspc ולוקמיה שונים.
  6. עבור כל אוכלוסיית עניין, לנתח את עוצמת הקרינה החציוני (MFI) של ערוץ TRPE (x-ציר) בעלילה היסטוגרמה כדי להעריך את ההבדלים באות רוס מיטוכונדריאלי (איור 3a-C, שמאל חלוניות). רמות של מיטוכונדריאני יכול להיות מוערך ברמה תא יחיד על ידי השוואת כתמים ROS מיטוכונדריאלי לעומת סמנים ספציפיים השושלת בעלילה פיזור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הציג הוא שיטה לניתוח ROS ב המיטו, בריאות מרובות ו-MLL-AF9-ביטוי של אוכלוסיות לוקמיה. איור 1 מציג תצוגה סכמטית של זרימת העבודה של הפרוטוקול, המורכבת מ-4 שלבים עיקריים: 1) בידוד מעכברים; 2) צביעת תאי מוניטור עם צבע פלואורוגנטי המזהה ROS מיטוכונדריאלי, במיוחד סופרתחמוצות; 3) לסמן את הנוגדן כתמים כדי להתוות אוכלוסיות שונות בריאות ולוקמיה המטפאות; ו -4) הזרימה הציקיפית לרכישת וניתוח.

איור 2 A, B מתאר את התוכנית הנציגה לעבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

צבעים fluorogenic כי פותחו לאיתור של ROS מוערכים לעתים קרובות בתאים קבועים על ידי מיקרוסקופ או בתאים חיים על ידי הזרימה cy, try22. הערכת הערכה לזרימה של רוס מיטוכונדריאלי בתאי BM באמצעות צבעי fluorogenic מיטוכונדריאלי יש שני יתרונות עיקריים: 1) זוהי טכניקה מהירה ופשוטה המתאימה לניתוח תאים חיים 2) זה מאפשר להבחין וניתוח נדיר אוכלוסיות ברמת התא היחיד ב-BM באמצעות כתמים של סמן פני השטח. הפרוטוקול צעד אחר צעד הציג כאן פותחה כדי ללמוד את הסטטוס vivo חמצון-חיזור לשעבר של גזע המטבית ואוכלוסיות מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו היתה נתמכת על ידי הדירקטוריון פוקס מרדף מרכז מנהלים (DDM), האגודה האמריקנית להמטולוגיה פרס המלומד (SMS), האגודה האמריקנית לסרטן RSG (SMS) ומשרד ההגנה (הפרס: W81XWH-18-1-0472).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
FBS VWRSeradigm מושבת בחום מדעי החיים97068-085מדיה
פניצילין סטרפטומיציןקורנינג30-002-CIמדיה
PBSפישר סיינטיפיקBP399-20מאגר
15 מ"ל צינור חרוטיBD בז352096אספקת תרבית רקמות
50 מ"ל צינור חרוטיBD בז352098רקמה אספקת תרבות
40 μ m מסנני תאיםפישר סיינטיפיק22-363-547אספקת תרבית רקמות
RBC מאגר ליזהפישר סיינטיפיק50-112-9751אספקת תרבית רקמות
מנדיון נתרן ביסולפיטסיגמא אולדריץ'M5750פרו-אוקסידנט
NACסיגמא אולדריץ'A7250אנטי-אוקסידנט
CD3 PE-Cy5 שיבוט 145-2c11Biolegend100310נוגדן
שיבוט CD4 PE-Cy5 RM4-5eBioscience15-0041-81נוגדן
CD8 שיבוט PE-Cy5 53-6.7eBioscience15-0081-81נוגדן
CD19 שיבוט PE-Cy5 6D5Biolegend115510נוגדן
B220 שיבוט PE-Cy5 RA3-6B2Biolegend103210נוגדן
Gr1 PE-Cy5 שיבוט RB6-8C5Biolegend108410נוגדן
שיבוט Ter119 PE-Cy5 Ter-119Biolegend116210נוגדן
CD48 שיבוט PE-Cy5 HM48-1Biolegend103420נוגדן
CD117  שיבוט APC-Cy7 2B8Biolegend105825נוגדן
Sca1 שיבוט כחול D7Biolegend108120נוגדן
CD150 שיבוט APC TC15-12F12.2נוגדן Biolegend115909שיבוט
FITC RAM34BD Bioscience553733נוגדן
CD45.2 שיבוט APC 104Biolegend1098313נוגדן
MitoSOX אדוםThermoFisher ScientificM36008צבע
Mitotracker ירוקThermoFisher ScientificM7514צבע
חי/מת צהובצבע ThermoFisher ScientificL34967צבע

מקורות

  1. Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
  2. Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
  3. Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
  4. Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
  5. Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).
  6. Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
  7. Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
  8. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
  9. Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
  10. Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
  11. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  12. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  13. Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
  14. Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
  15. Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
  16. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776(2008).
  17. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  18. Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  19. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  20. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  21. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
  22. Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
  23. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  24. Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
  25. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  26. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  27. Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
  28. Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ROS
הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.