התפתחותם של התרבויות החיידקי רדיויניום בצלחות microtiter מאפשר דגימת תפוקה גבוהה המאפשרת שכפול טכני וביולוגי מרובים מספר השפע של הבריכה נוקלאוטיד, כולל זה של (p) ppGpp. ההשפעות של מעברים צמיחה שעוררה מקורות של לחץ פיזיולוגי, כמו גם התאוששות מהלחץ ניתן לפקח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה
במאמר זה
סיכום
תקציר
(P) הנוקלאוטיד ppGpp מתפקד כווסת גלובלי בחיידקים בתגובה למגוון רחב של מתח פיזי ותזונתי. יש לו התחלה מהירה, בשניות, אשר מוביל להצטברות של רמות הגישה או לחרוג אלה של בריכות GTP. היפוך מתח מקרים היעלמות מהירה של (p) ppGpp, לעתים קרובות עם מחצית חיים של פחות מדקה. הנוכחות של (p) ppGpp תוצאות שינויים של ביטוי גנים סלולריים ומטבוליזם המונה את ההשפעות המזיקות של מתח. גראם שליליים וחיידקים גראם חיוביים יש מנגנוני תגובה שונים, אבל שניהם תלויים (p) הריכוז ppGpp. בכל מקרה, יש צורך לנטר בו הרבה תרבויות בקטריאלי רדיויניום במרווחי זמן שעשויים להשתנות מ 10 שניות לשעות במהלך תקופות מעבר הלחץ הקריטי. פרוטוקול זה מטפל באתגר הטכני הזה. השיטה מנצלת חממות מבוקרת טמפרטורה ושייקר מבוקרים המאפשרים ניטור מקבילי של הצמיחה (ספיגה) ודגימה מהירה של תרבויות הפוספט האחיד והחד כדי לפתור ולכמת בריכות נוקלאוטיד כרומטוגרפיה בעלת שכבה דקה. בפיי-תאית כמויות קטנות של דגימה נחוצות עבור שכפול טכני וביולוגי מרובים של ניתוחים. מעברים צמיחה מורכבים, כגון הצמיחה diauxic ו מהירה (p) שיעורי המחזור ppGpp ניתן לכמת המוערך על ידי שיטה זו.
מבוא
השליח (p) ppgpp השני הוא מווסת גלובלי המודוללי את הביטוי של מספר רב של גנים, כולל גנים עבור סינתזה הריבוזומים וחומצות אמינו1,2. למרות שהתגלו בתחילה בשנת החיידק הקולי3, (p) ppgpp ניתן למצוא הן בקטריה גראם חיוביים גראם שליליים, כמו גם במפעל כלורפור4,5. עבור E. coli וחיידקים גראם שליליים אחרים, (p) ppgpp אינטראקציה ישירה עם RNA פולימראז בשני אתרים שונים6,7,8. ב גראם חיוביים, (p) ppgpp מעכב gtp שפע, אשר חש על ידי קודי, מחי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מדיה
-
עבור מגבים (3-(N-שורגואולנו) החומצה propanesulfonic) מדיה25, השתמש 1/10 נפח של מלחי 10 x מלחים, 1/100 נפח של 100x מיקרורונקורט הפתרון, 3 mM נתרן פוספט עבור תרבויות לילה או 0.2 מילימטר נתרן פוספט לתיוג אחיד עם 32P, 0.2% גלוקוז ו-1 μg/mL תיאמין (ויטמין B1). הוסף חומצות אמינו ב-40 μg/mL במידת הצורך.
- עבור מלחי מלחים, להשתמש 400 mM מגבים, 40 mM Tricine, 0.1 mM FeSO4, 95 mm NH4Cl, 2.6 mm K2כך4, 5 Μm Cacl2, 10.56 Mm mgcl2, ו 500 מ"מ הנאקל. הוסף את הרכיבים השונים בסדר שנכתב כדי למנוע משקעים. להתאים ל-pH 7.4 עם KOH ולעקר על ידי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ב -E. coli K-12 זנים, תוספת ולין מעוררת הרעב אנדוגניים של isoleucine, אשר התוצאות עלייה של רמות ppgpp לאחר 5 דקות3. תאים שגדלו בתוך מגבים המכילים את כל חומצות אמינו למעט ILV היו תוויות עם 32P כפי שצוין באיור 1. פעם אחת, 6 μl של 10 מ"ג/מ"ל l-valine (100 μg/ml ריכוז סופי) נוספה כדי לייצר רעב איזולאוצין. דגימות נלקחו 0 ו 5 דקות לאחר הוספת valine. לאחר 5 דקות (איור 3A), עלייה 2 ו-2.5 מקפלים ברמות של ppgpp ו pppGpp התרחשה. כשליטה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השגת התווית האחידה של התאים היא צעד קריטי עבור פרוטוקול זה. לפיכך, השימוש במדיה מוגדרת, כגון מדיה מסוג מגבים או טריס, הינו חיוני כדי לאפשר וריאציה של ריכוזי פוספט לנושא ופעילות מסוימת. אין אפשרות להשתמש באמצעי מדיה מואגור פוספט, כגון M9 או מדיה A. רוב המדיה הלא מוגדרת מכילה כמויות משתנים של פוספט, כגון LB, טריטונים וחומצות קאמידיות. איזוטופ פוספט 33p הוא פולט חלשה יותר שניתן להחליף עבור 32P. היתרונות של ההחלפה הם שהוא בטוח יותר ויש לו מחצית חיים של 25 ימים במקום 14 ימים עבור 32P. עם זאת, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
מחקר זה היה נתמך בתוכנית מחקר הפנים, יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, NIH.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| חומצה פורמית | פישר ביוטק | BP1215-500 | |
| גלוקוז | מקרון | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | סיגמא | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| קורא מיקרופלייט Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 רדיונוקליד, חומצה אורתופוספורית ב-1 מ"ל מים (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage מסך זרחן | קודאק | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| תיאמין | סיגמא | T-4625 | |
| TLC PEI תאית F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| טייפון 9400 מצלמת | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
מקורות
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
