מאמר שיטה

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

DOI:

10.3791/59624

⸱

25 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים גישה כדי לטהר את הריבוכמה מאוגד-mRNA מתאי כלי הדם (ECs) ישירות במוח העכבר, הריאות ורקמות הלב באמצעות התגית הגנטית ספציפית EC של חלבון פלואורסצנטית ירוק משופר (EGFP) ב ריבוזומים בשילוב עם טיהור RNA .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים רבים הוגבלה להשתמש באספלי הסלולר מבחנה ורקמות שלמות או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מבעלי חיים עבור ניתוח מבחנה של טרנס וביטוי גנטי על ידי qPCR ו-RNA רצפי. ביטוי מקיף לניתוח והבעה גנים של סוגי תאים ספציפיים ברקמות מורכבות ואיברים יהיה קריטי להבין מנגנונים סלולריים ומולקולריים שבהם גנים מוסדרים והקשר שלהם עם הומאוסטזיס רקמות ואיבר פונקציות. במאמר זה, אנו מדגימים את המתודולוגיה עבור בידוד של הריבוכמה-RNA מאוגד ישירות בvivo ב אנדותאליה כלי הדם של הריאות בעלי חיים כדוגמה. החומרים וההליכים הספציפיים לעיבוד רקמות ו-RNA טיהור יהיה מתואר, כולל הערכה של איכות RNA ותשואה כמו גם qPCR בזמן אמת עבור גן העורקים העורקי. גישה זו, המכונה תרגום ריבוכמה אהדה (מלכודת) הטכניקה, יכול להיות מנוצל לאפיון של ביטוי גנים וניתוח הטרנססקריפט של סוגי תאים מסוימים ישירות בvivo בכל סוג ספציפי ברקמות מורכבות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברקמות מורכבות כגון מוח היונקים, הלב והריאות, הרמות הגבוהות של טרוגניות הסלולר מסבכים את הניתוח של נתוני ביטוי הגנים הנגזרים מדגימות שלמות של רקמות. כדי להתבונן בפרופילי גנים ביטוי סוג תא מסוים ב vivo, מתודולוגיה חדשה פותחה לאחרונה, אשר מאפשר את החקירה של משלים mRNA המתורגם כולו של כל סוג תא מוגדר גנטית. מתודולוגיה זו ידועה בתור הריבוקכמה הזיקה לטיהור (מלכודת) בטכניקה1,2. זהו כלי שימושי לחקור ביולוגיה של תא אנדותל ואנגיוגנזה כאשר משולבים עם גנטית מניפולציה של גנים אחרים הקשורים לאנגיוגנזה בבעלי חיים.

הצגנו את העובדה ש-אנגיוגנטי pkd-1 מאותת ותמלול הCD36 של גנים מבוססי-אנגיוגנטית הם קריטיים עבור תא אנדותל (EC) בידול ואנגיוגנזה פונקציונלי3,4,5,6. כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנטי ו איתות מטבולית בתמלול הגנים ובידול EC, יצרנו מהונדסים גנטית עכברים מלכודת עם גנים שנמחקו במיוחד אנגיוגנטי על בסיס של טכניקה מלכודת1 , 2. יתר על כן, בחיות המלכודת שלנו, לא רק שיש להם pkd-1 או cd36 gene חוסר בכלי הדם אנדותאליה או מחיקה גלובלית של cd36 gene, אבל חלבון משופר ירוק פלואורסצנטית (egfp) הוא גם מתויג גנטית על . EC מתרגם ריבוזומים המלכודת מאפשרת טיהור של אהדה של הריבוכמה מאוגד-mRNA ישירות מתוך כלי הדם של רקמות ממוקדות, המאפשר ניתוח של ביטוי גנים זיהוי של הטרנססקריפט החדש הקשורים בידול EC ו אנגיוגנזה ישירות תחת התנאים vivo. בנינו בהצלחה RNA ריבוכמה מאוגד מתוך אנדותליה בבעלי חיים אלה מהונדסים גנטית. ה-RNA הטהור יכול לשמש לאפיון נוסף של גנים של אנגיוגנטי או הריוגניים בוויסות הבידול והפונקציות של EC. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי ליישם את גישת המלכודת לבידוד של mRNA ב-ECs ישירות ב-vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור ניסויים בבעלי חיים, כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש במכללה הרפואית של ויסקונסין.

1. הכן ריאגנטים

  1. הכנת מאגר לפירוק לריכוזים של 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ dtt, 100 Mg/mL cycloheximide מעכבי פרוטאז, ו רקומביננטי RNase מעכבי לריכוזים כפי שמתואר להלן.
    1. הוסף ריאגנטים הבאים כדי 500 מ ל של RNase-חופשי מים מוכי: 1.19 g של HEPES, 5.59 g של KCl, 0.24 g של MgCl2, 35 MG של dtt, 0.5 mL של cycloheximide ו naoh לפי הצורך עד pH 7.4, edta-מעכבי פרוטאז חינם (מיני לוח אחד לכל 10 mL) ו-RNase מעכבי (1 0 μL/mL).
    2. חנות במקרר של 4 ° c עד חודש אחד.
  2. להכין הרבה מלח גבוה polysome מאגר לשטוף לריכוזים של 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 350 mM KCl, 5 מ"מ MgCl2, 1% vol/vol CA-630, 0.5 MM dtt, ו 100 Mg/mL cycloheximide.
    1. הוסף ריאגנטים הבאים כדי 500 mL של RNase-חינם מים מאוהים: 1.19 g של HEPES, 13.05 g של KCl, 0.24 g של MgCl2, 5 מ ל של nonionic, ללא הסרת כביסה, 5 של 7.7 mg צינורות של dtt, ו 0.5 mL של cycloheximide ו naoh לפי הצורך עד pH 7.4
    2. חנות במקרר של 4 ° c עד חודש אחד.
  3. אגד נוגדן אנטי-GFP לחרוזים מגנטיים של חלבון G לפני תחילת הניסוי.
    1. הוסף 10 מ"ג של נוגדן anti-GFP מדולל ב 200 mL של PBS ל-G חרוזי חלבון.
    2. מודטה עם סיום הסיבוב בסוף 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הניחו את החרוזים על מתלה מגנטי והסירו את הסופרנטאנט.
    4. השהה את החרוזים ב-200 mL של PBS ואחסן במקרר של 4 ° c עד שבוע אחד.
  4. הכינו את הקרח קר PBS עם 100 mg/mL cycloheximide.
    1. להוסיף נפח 1 של פתרון cycloheximide (100 mg/mL) כדי 99 כרכים של קרח קר PBS.

2. לבודד לlyse הרקמות הרצויות

  1. המתת חסד על ידי הזרקת IP של קטמין (500 mg/ק"ג/משקל הגוף) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג/משקל הגוף) ולבודד את הרקמות הרצויות (כלומר, הלב, הריאות). המשך מיד לשלב הבא.
  2. מניחים את הרקמות הרצויות לתוך 500 mL של הקרח קר PBS עם 100 mg/mL לבין.
  3. האוהב רקמות לתוך הבולם הנייד עם מנוע מונחה מוטורי או הומוגניצר זכוכית בעלת סיווג קטן. אם באמצעות מנוע הומוגניצר ממונע, להגביל את המגון לפחות 1 דקה בתדר נמוך (< 15000 Hz) כדי למנוע את ה-RNA דנטורציה.
  4. להשעות את הגלולה תא ב 200 mL של מאגר לליזה ידי ליטוף ולצייר מחדש את המאגר מספר פעמים. עוד המגון להתאים הבולם התא עם 10 משיכות הומוגניצר זכוכית בעלת סיווג קטן או עבור 15 שניות בתדר נמוך (< 15000 Hz) ב הומוגניצר מנוע מונחה.
  5. צנטריפוגה הומוטים עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב 4 ° c כדי גרעיני גלולה ופסולת תא גדול, ולשמור על supernatant.
  6. הוסף nonionic, ללא הדדקות ניקוי כדי 1% vol/vol ו DHPC ל 30 מ"מ כדי supernatant. מודקון על הקרח עבור 5 דקות.
  7. צנטריפוגה ליפוסט עבור 10 דקות ב 16,000 x g כדי החומר גלולה מסיסים. העבר ושמור 15% של ליפוסט ברור כקלט עבור שלבים עתידיים.

3. בודד מכלולי ריבוחלק/mRNA

  1. הוסף 50 mL של חרוזים מאוגד נוגדן לתא-ליפוסט supernatant ו-דגירה התערובת ב 4 ° צ' עם סיבוב מעבר לקצה עבור 30 דקות. זה המקום שבו נוגדנים anti-GFP יהיה לאגד את הריבוזומים GFP מתויג, המאפשר לנו לבודד את ה-RNA מן הריבוזומים אלה.
  2. לאסוף חרוזים על מתלה מגנטי ולשטוף 5 פעמים עם רב מלח polysome מאגר לשטוף.
    1. לצייר ולמחוק נוזל פעם חרוזים נאספו בצד של הצינור. ואז לנקות את הצנרת 200 מ ל של מאגר כביסה של המלח גבוהה מספר פעמים. חזור על שלב זה 5 פעמים והשמט את כל המאגר לאחר החזרה הסופית. המשך מיד לשלב הבא.

4. לבודד את mRNA

  1. מניחים חרוזים במאגר RLT. השלבים הבאים נלקחים ישירות מפרוטוקול מיני ערכת RNeasy ולא הורחב בכל דרך.
    התראה: RLT מאגר מכיל מלחי גואנידין; אין לערבב עם אקונומיקה.
  2. צנטריפוגה למטה עבור 3 דקות במהירות מלאה 13,000 rpm או 16,000 g ב 4 ° c. הסר בזהירות את סופרנטאנט של 350 mL על ידי ליטוף ולהעביר אותו צינור microfuge חדש. השתמש רק על הסופרנט (ליפוסט) בשלבים הבאים.
  3. הוסף נפח שווה של 70% אתנול לתוך צינור microfuge.
  4. העבר עד 700 mL של המדגם, כולל מזרז שעשוי להיווצר, לטור ספין הממוקם בצינור אוסף של 2 מ ל. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. התעלם מהזרימה.
  5. הוסף 350 mL של מאגר RW1 לעמודת הספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. השמט את הזרימה והשתמש שוב בשפופרת האוסף בשלב הבא.
    התראה: מאגר RW1 מכיל מלחי גואנידין; אין לערבב עם אקונומיקה.
  6. הוסף 350 mL של מאגר RW1 לעמודת הספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g. התעלם מהזרימה.
  7. הוסף 500 mL של מאגר RPE לעמודת הטווח. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. התעלם מהזרימה.
  8. הוסף 500 mL של מאגר RPE לעמודת הטווח. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 2 דקות ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. לאחר מכן הסר בזהירות את עמודת הספין מצינור האיסוף, וודא שהעמודה אינה מפנה לזרימה.
  9. מקם את עמודת הספין בצינור אוסף חדש של 2 מ ל והשמט את השפופרת הישנה עם הזרימה. סגור את המכסה בעדינות וצנטריפוגה במהירות מלאה עבור 1 דקות כדי להסיר מאגר שיורית.
  10. מקם את עמודת הספין בשפופרת אוסף חדשה של 1.5 mL. הוסף 30-50 מ ל של RNase-מים חינם ישירות קרום טור ספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 1 דקות ב ≥ 8,000 x g כדי ELUTE RNA.
  11. אם צפוי תשואה RNA הוא > 30 מ"ג, חזור על שלב 4.10 עם עוד 30-50 mL של מים חינם RNase, או באמצעות elute משלב 4.10 (אם הוא גבוה [RNA] נדרש). שימוש חוזר בצינור הגבייה משלב 4.10.
  12. השתמש ב-RNA מטוהרים עבור ניתוח במורד הזרם כולל RNA-רצפי או בזמן אמת כמותי PCR או לאחסן RNA מומס RNase-H ללא תשלום2O ב-80 ° c עבור עד 1 שנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקרים הקודמים שלנו4,7 מראים כי CD36 עשוי לתפקד כבורר עבור arteriolar הבדלה והעורקי נימי באמצעות lpa/pkd-1 מסלול איתות. כדי ללמוד אם הציר LPA/PKD-1-CD36 איתות חיוני עבור הריוגנזה ב vivo, הקמנו את הספר שורות המלכודת כי לא רק מחסור בCD36 הכללית או אנדותל ספציפי, CD36 או pkd-1-מחסור, אלא גם לאפשר בידוד סלקטיבי של רנ א מאוגד-RNA מן היצור-מסומן בתאי תאים באמצעות GFP, ושימושיים ככתבת פלורסנט מופעלת-יצורים2.

על-ידי בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנגיוגנזה הוא תהליך רב-שלבים מורכב, בו תמלול וביטוי של גנים בעלי מפרט EC-אנגיוגנטי ממלאים תפקיד חיוני ב-EC בידול ו-אנגיוגנטי מתכנות3,4. כדי להתגבר על המחסומים מן הגיוון הסלולר והמורכבות האדריכלית להבנת טוב יותר את התפקוד של מערכת כלי הדם של היונקים ברמה המולקולרית ב-vivo, יצרנו את העכברים הספציפיים ל-EC, המלווים בcd36-EC ספציפי , EC-ספציפי pkd-1 מחסור או הכללית cd36 מחסור באמצעות מודל רב תכליתי מלכודת העכבר או egfp-השמנה שנוצר במעבדה פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודתו של ד ר רן נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (13SDG14800019; BR), קרן התקווה של אן (FP00011709; BR), האגודה האמריקנית לסרטן (86-004-26; מרכז הסרטן MCW ל BR), ואת המכון הלאומי לבריאות (HL136423; BR); ירדן פאלמר נתמך על ידי 2018 MCW CTSI 500 תוכנית ההתמחות כוכבים; פ. מורן נתמך על ידי מענק להכשרת מחקר מוסדיים מ-NHLBI (5T35 HL072483-34).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2100 אלקטרופורזה ביואנלייזר עם ננו-שבבים ופיקו-צ'יפסAgilentG2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
מגרדי תאיםSarstedt83.1832
הומוגנייזריםמגנט K8855100020
(Dynamag-2)Invitrogen123-21Dיהיה תלוי בסולם הטיהור; ניתן לרכז דגימות בצינורות של 1.5 מ"ל DynaMag-2
מיניצנטריפוגהפישר סיינטיפיק05-090-100
NanoDrop 2000C ספקטרופוטומטרתרמו סיינטיפיק ND-2000C
Eppendorf5430Rעם רוטור לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל
מיקרוצנטריפוגה ללא RNase 1.5 מ"לApplied Biosystems 
צינורות חרוטיים נטולי Rnase בנפח 50 מ"לApplied Biosystems 
1000-&mu ללא RNase; l טיפים מסנניםRaininRT-1000F
ללא RNase 200-μ l טיפים לסנןRainin RT-200F
נטול RNase 20-μ l טיפים לסנןRainin RT-20F
להומוגניזטוריםYamato מסובב צינור LT-400D
, מותג LabquakeThermo Fisher13-687-12Q
מדעי פישרצנטריפוגה מקוררת צינורות AM12450AM12501רוטור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNAIn VivoTRAPRNAGFPAnti GFPRNAqPCR

מאמרים קשורים