הממשל הכרוני של אלכוהול איזוטרואנרול באמצעות משאבת אוסמוטי מושתל נעשה שימוש נרחב כדי לחקות אי ספיקת לב מתקדמת בעכברים. כאן, אנו מתארים שיטות מפורטות השתלת מיני משאבה כירורגית עבור הממשל האיזופרופיל המתמשך לאורך 3 שבועות, כמו גם, הערכת האקו ליצירת מודל מוצלח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השרשה של מיני משאבה איזופרופיל כדי לגרום לאי ספיקת לב בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אלכוהול איזופרופיל (ISO), הוא האגוניסט לא סלקטיבי ביתא-אדרלירגיות, המשמש באופן נרחב כדי לגרום לפציעה בלב עכברים. בעוד מודל אקוטי מחקה מחלת שריר הלב מושרה, המודל הכרוני, מנוהל באמצעות משאבת אוסמוטי, מחקה אי ספיקת לב מתקדמת בבני אדם. מטרת הפרוטוקול המתואר היא ליצור את המודל הכרוני ISO המושרה לב בעכברים באמצעות משאבת מיני מושתל. פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לגרום אי ספיקת לב 100 + זנים של עכברים ממין. טכניקות על השתלת משאבה כירורגית מתוארים בפרוטרוט עשוי להיות רלוונטי לכל מי שמעוניין ליצור מודל אי ספיקת לב בעכברים. בנוסף, שיפוץ לב שבועי שינויים בהתבסס על פרמטרים האקוקרדיוגרפיות עבור כל זן וזמן צפוי לפיתוח מודל מוצגים. לסיכום, השיטה פשוטה ומתוכמת. ISO רציף מנוהל באמצעות משאבת מיני מושתל מעל 3 כדי 4 שבועות הוא מספיק כדי לגרום שיפוץ לב. בסופו של דבר, ההצלחה של יצירת מודל ISO עשוי להיות מוערך ב vivo על ידי בדיקת אקו-המוח מפגין היפרפרס, התרחבות חדרית, ו תפקוד.
מבוא
אי ספיקת לב עם שבר הוצאה מופחת (HFrEF) מלווה בתגובה פיצוי היטב מוכרת של מערכת העצבים הסימפתטית לשמור על הומאוסטזיס לב וכלי דם1. לחץ הומודינמי והשפעות מזיקות על הלב ועל הסירקולציה נצפו בהפעלה כרונית. אלה הפכו לאבן הפינה של הפרמקותרפיה העכשווית עבור אי ספיקת הלב ומנגנונים חשובים בהתקדמות אי ספיקת הלב והאנטוניזם הטיפולית של מערכות הורמונליות1.
כמה דגמי עכבר זמינים לחקירות בסיסיות של אי ספיקת לב. דגמים גנטיים הם אטרקטיביים לחקר טיפולים מולקולריים וחקירת מסלולים איתות. עם זאת, ייתכן שמודלים אלה לא יהיו רלוונטיים לצורות נפוצות של אי ספיקת לב. מודלים נפוצים אחרים כוללים השמאלית הקדמית שמאלית (בחור) עורק העורקים, הלוע החוצה (TAC), ו איזופנול (ISO), כל אחד מכוון לאטיולוגיה פתולוגית שונה2,3,4,5 ,6. ליטל עורק בחור גורמת אוטם שריר הלב בקיר הקדמי ובכך ליצור מודל ספציפי עבור מחלת שריר הלב. . ליצור מודל לחץ דם גבוה יותר של אי ספיקת לב למרות הלחץ הדרגתי ניתן למדוד, המאפשר ריבוד של hypertrophy, התפרצות חריפה של יתר לחץ דם חסר רלוונטיות קלינית ישירה4. שני הדגמים של LAD ו-TAC דורשים רמה גבוהה של מומחיות כירורגית לביצוע. מודל ISO אקוטי של אי ספיקת לב מחקה מחלת שריר הלב, הידוע גם בשם מחלת Takotsubo, אשר מאופיין על ידי עלייה מסומנת catecholamines ופעילות בחדר השמאלי מחקה אוטם שריר הלב חריפה7, שמונה. לעומת זאת, מודלים ISO כרוניים של אי ספיקת לב מציגים סימפטומים מאפיינים של אי ספיקת לב מתקדמת, עם רמות גבוהות באופן כרוני של catecholamines1. היתרונות של מודל ISO כרוני הם כי הוא מספק גירוי אדרארדירגיות כרונית כי מחקה אי ספיקת לב מתקדמת וכי קל יחסית ליצור. החוקר צריך לבחור מודל כי הטוב ביותר מסכם את הפתולוגיה של האינטרסים שלהם.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לגרום אי ספיקת לב בעכברים באמצעות משאבת מיני מושתל המשחרר ISO ברציפות לחקות הפעלה אוהדת כרונית שנמצאו בחולים אי ספיקת לב1. השיטה פשוטה ומתוכמת. למרות שיש וריאציה ברורה בין זני העכבר, ISO מנוהל על פני 3 עד 4 שבועות 30 מ"ג/ק"ג/יום מספיק כדי לגרום שיפוץ לב ברוב העכברים. במיוחד, ISO מוביל לשלב pro-יפרטרופית הפיצוי במהלך השבוע 1 ואחריו הקיר דליל, התרחבות חדרית וירידה בתפקוד סיסטולי ידי שבוע 2 ו-32. הצלחה עבור יצירת מודל ISO יכול להיות מוערך ב vivo על ידי אקו-קרדיוגרם הוכחת hypertrophy, התרחבות, ותפקוד חדרית, כמו גם לשעבר vivo באמצעות הערכה היסטולוגית ומולקולרית של רקמת לב שנקטפו עבור שריר הלב הצטברות השומנים, פיברוזיס, המתח ER, אפופטוזיס, ו ביטוי גנים9,10,11,12.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה דבק בהנחיות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (פרוטוקול ARC #2010-075). מומלץ לקוראים לדבוק בפרוטוקול IACUC שאושרו בעצמם, כגון טיפול בעכבר פרי-הליך וניהול כאבים עשויים להיות ספציפיים למוסדות.
1. הכנת משאבת איזופנול אוסמוטי
הערה: הליך זה הוחל בהצלחה על 9 + שבוע עכברים נקבה במשקל 18 + g ממעל 100 זנים העכבר הטבעי, כמו גם, בעכברים זכר בקבוצת משנה של זנים. אין מגבלת משקל הגוף המרבי עבור הליך זה. כלול תמיד פקדים התואמים לגיל, מאחר שהוא אינו ידוע אם גיל הטיפול משפיע על הרגישות להתפתחות אי-היכולת האיזוגופרתית.
- שוקלים ומקליטים את משקל הגוף לכל עכבר.
- חשב את הכמות והריכוז המתאימים של איזופנול עבור כל אחד מהעכברים (ראו טבלה 1 ; קובץ משלים).
הערה: משאבות אוסמוטי המשמשות בניסוי זה (טבלה של חומרים) יש נפח מאגר של 100 μl ו נועדו לספק סמים בקצב זרימה רציפה של עד 28 ימים. הכינו תוספת של 20 μL של פתרון איזופרופיל לכל משאבה לצורך הפסד אמצעי האחסון בצינור המילוי במהלך טעינת המשאבה. - שוקלים את הכמות המתאימה של האיזופנול (טבלה 1) באמצעות איזון אנליטי ומתמוסס אותו ב-120 μl של פתרון סטרילי 0.9%. פיפטה במרץ או מערבולת עבור 1 דקות כדי לחלוטין מסיסות איזופרופיל.
הערה: הכינו את משאבות האוסמוטי בארון מעבדה ביולוגי. יש לטפל במשאבות עם כפפות ניתוח. טכניקה סטרילית מומלצת לאורך כל הכנת משאבות אוסמוטי ובמהלך תהליך השרשה כירורגית. - שקול ותעד את משאבת האוסמוטי הריקה יחד עם מנחה הזרימה שלו ולאחר מכן הסר את מנחה הזרימה.
- מזמת 120 μL של פתרון איזופרופיל לתוך מזרק 1.0 mL ולצרף את הצינור 27 מספק בוטה מילוי מסופק עם משאבות אוסמוטי.
הערה: ודא שהמזרק ומילוי הצינור הינם ללא בועות אוויר. - בעוד החזקת המשאבה בתנוחה זקופה, הכנס את צינור המילוי דרך פתח המשאבה בראש עד קצה צינור המילוי יושב ליד החלק התחתון של מאגר המשאבה.
- טען את המשאבה האוסמוטי על-ידי דחיפת המזרק באיטיות עד שהפתרון האיזוטרולי מתמלא עד לפתיחת המשאבה.
- הסר בזהירות את צינור המילוי ונגב את התמיסה העודפת.
- הכנס חזרה את מנחה הזרימה כדי לסגור את המשאבה ולמחוק כל פתרון עודף.
- ודא כי מעל 90% של נפח המאגר כבר מילא על ידי שקילה מחדש את המשאבה אוסמוטי.
הערה: משאבות שליטה מוכנות באותו אופן על ידי מילוי מאגר המשאבה עם סטרילי 0.9% פתרון.
2. הכנת כלי ניתוח
- נקה את כל כלי הניתוח, כולל סיבים אופטיים O-ring מיקרוסקופ אור, 2 מלקחיים, מחזיק מחט, מטהרי חרוז חם, חרוזי זכוכית ומספריים (טבלת חומרים).
- מכשירים כירורגיים אוטוקלב ב 121 ° C עבור 30 דקות כדי לעקר מכשירים לפני הניתוח.
3. אלכוהול איזופרופיל אוסמוטי השתלת כירורגי
- לגרום הרדמה על ידי הצבת העכבר בחדר אינדוקציה עם 3% isofלוריאן ב 95% O2 ו-5% CO2. שמור על הרדמה. עם 2% באמצעות מעדר
- מנהל 5 מ"ג/ק"ג carprofen ספורטינג ראגה לעורף הצוואר בין להבי הכתפיים לחוסר כאבים.
- הניחו משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע התייבשות הקרניות.
- בדוק את עומק ההרדמה על ידי ניטור קצב הנשימה, הבוהן צביטה רפלקס, וצבע של קרום רירי.
- למקם את העכבר במצב פרקדן על משטח מחומם. הסר את השיער מהבטן התחתונה וחטא את העור בבטאדין או בכלהקאיצין.
הערה: כדי למזער זיהום שלאחר הניתוח, ודא כי השדה הכירורגי הוא ללא שיער במקרה. - השתמש זוג מספריים כירורגי כדי לחתוך חתך העור באורך של 1 ס מ. השתמש בזוג מספריים בוטים כדי לנתח בזהירות את העור מתוך קירות הצפק שבבסיס.
הערה: משלוח פנימי בצפק עדיף להתאים את גודל המשאבה. - משוך את קירות הצפק הרחק המעי הבסיסי עם מלקחיים וחותכים חור 0.8 ס מ בקירות הצפק באמצעות מספריים כירורגי משובח.
- הכנס את המשאבה האוסמוטי לתוך חלל הצפק עם מנחה הזרימה הראשון.
- סגרו את החסימה בקירות הצפק תוך שימוש בתפרים נספגים 5.0 בצורה מופרעת. השתמש ב-6.0 בתפרים לא נספגים כדי לסגור את חתך העור בצורה מופרעת.
- למקם את העכבר בחממה ייעודי כדי לשמור אותו חם ויבש במהלך ההתאוששות. הערכת ההתאוששות מהרדמה על ידי ניטור העכבר כל 30 דקות בשעתיים הראשונות להחזרת נשימה נורמלית ותנועה.
- ברגע שהעכבר התאושש לחלוטין מן ההרדמה, להחזיר אותו לדיור שגרתי. המשיכו לעקוב אחר החיה לסיבוכים ביום עד שלושה ימים, ואז כל 2-3 ימים לאחר מכן עד סוף הניסוי.
הערה: בעלי חיים צריכים להיות מנוטרים על ראיות של כאב שלאחר הניתוח או זיהום, סימנים של ירידה במשקל, חוסר ניידות, יציבה לא נורמלית, כישלון החתן, מוגזם ליקוק או נשיכות של אזור החתך. - ניהול carprofen 5mg/ק"ג ספורטינג ראגה כל 24 h עד 48 h ולאחר מכן לפי הצורך.
- ניהול 0.25 mg/mL אמוקסיצילין ב שתיית מים 5 ימים כדי למנוע זיהומים באתר כירורגי.
- הסירו תפרים שאינם נספגים לאחר 7 עד 10 ימים.
4. הערכת אקוקרדיוגרפית בהרדמה
הערה: ניתן לבצע הערכת אקו-קרדיוגרפית שוב ושוב כדי לפקח על שיפוץ לב סדרתי במשך מספר שבועות. בוצעו מדידות אקו-קרדיוגרפיות במרווחי זמן שבועיים במשך שלושה שבועות.
- לגרום הרדמה בחדר אינדוקציה ב 1.25% ל 1.5% של isofלוריאן. פעם מסומם כראוי, לאבטח את העכבר על פלטפורמת אקו לב עם קלטת המאפשר לעכבר להמשיך לקבל הרדמה דרך קונוס האף.
- הפחת את isof, למינון תחזוקה של 1% כדי למזער השפעות chronotropic שליליות ואינוטרופיות של הרגעה יתר. הינכם מתבקשים לשים לב לשיעורי הנשימה והלב במהלך הלימודים ולהתאים את המינון הנדרש.
- להסיר את השיער בחזה עם תחליב להסרת ולנגב את החזה ללא שיער.
- מניחים את ג'ל אולטרסאונד על החזה ומיקום בדיקה אולטרסאונד לדימוי הלב.
- במצב B, התמונה שמאל החדר (LV) בתצוגה הציר הארוך הparasternal. להתאים את פלטפורמת אקו לב כדי ליישר את שסתום אבי העורקים ואת הפיסגה LV במישור של קרן אולטרסאונד.
- להטות את פלטפורמת אקו לב כדי למקם את הציר הארוך LV ב 90 מעלות לקרן אולטרסאונד ואת הקוטר LV מקסימום במרכז התמונה.
- תמונה של הציר הקצר LV על ידי הפיכת בדיקה אולטרסאונד 90 מעלות.
- במצב M למדוד את עובי הקיר LV וממדים פנימיים.
- מניחים את העכבר בחזרה לכלוב. לפקח על שיבה של נשימה נורמלית תנועות גוף ספונטנית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר שפורסם בעבר, יש לנו מינון ISO של 30 מ"ג/ק"ג/d מעל 21 ימים באמצעות משאבת אוסמוטי על פני 105 היברידית עכבר מגוון הפאנל (hmdp) זנים2,13. העריכו את התוצאות באמצעות האקו-הד שבוצעה בתוכנית הבסיסית, שבוע 1, 2 ו-3 של טיפול ISO (איור 1). בדומה למחקר קודם שבו המחברים למדו את ההשפעה של אלכוהול איזוטראנרול בין 23 זנים העכבר14, הבחנו וריאציה בין-מאמץ בין הפרמטרים של אקו-קרדיוגרפיות. סיכום שינויים שבועיים המבוססים על ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יש לנו להחיל את השיטה הזאת על 100 + זנים של עכברים משני כדי להעריך תוצאות לב בשל גירוי ביתא-אדרררגיותכרונית 2,13. הבדלים משמעותיים ברגישות לאיזופנול ידועים להתקיים בין זנים העכבר יכול להיות מותאם אישית את המתח של עניין כנדרש16. זה יכול להיות בגלל וריאציה בפונקציית הקולטן ביתא-אדרלירגיות בין זני העכבר17, הבדלים תלויי הזנים בפעילות מערכת העצבים האוטונומית16, ביתא-אדרארדירגיות קולטן (beta-AR) צפ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מכירים את NIH K08 HL133491 לתמיכה במימון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת משאבה מיקרו-אוסמוטית עם מנחה זרימה במקום | Alzet | דגם 1004 | כולל צינור מילוי, מנחה זרימה וגוף משאבה |
| (-)-Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 16504-1G | (-)-Isoproterenol hydrochloride היא אבקה שצריך לאחסן בטמפרטורה של -20°C. |
| מזרק סטרילי 1 מ"ל | VWR | BD309602 | |
| 30 W LED סיבים אופטיים תאורת מיקרוסקופ אור טבעת O AmScope | מק"ט: LED-30WR | ||
| 5-0 מצופה VICRYL (פוליגלקטין 910) תפר | Ethicon | J303H | 5-0, מספריים עדינים נספגים |
| - Sharp | FST | 14060-09 | |
| חרוזי זכוכית | FST | 18000-46 | |
| חרוז חם מעקרים | FST | 18000-50 | |
| מלקחיים לקשתית | WPI | 15915 | |
| Look Sharpoint 6-0, תפר מונופילמנט ניילון שחור 18 אינץ' | LOOK | AA-2176 | 6-0, מחזיק מחט שאינו נספג |
| WPI | 15926 | ||
| מי מלח רגילים, 0.9% NaCl | Fisher | 89167-772 |
מקורות
- Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Review Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
- Wang, J. J., et al. Genetic Dissection of Cardiac Remodeling in an Isoproterenol-Induced Heart Failure Mouse Model. PLoS Genetics. 12 (7), 1006038(2016).
- Balakumar, P., Singh, A. P., Singh, M. Rodent models of heart failure. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 56 (1), 1-10 (2007).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circulation: Heart Failure. 2 (2), 138-144 (2009).
- Huang, W. Y., Aramburu, J., Douglas, P. S., Izumo, S. Transgenic expression of green fluorescence protein can cause dilated cardiomyopathy. Nature Medicine. 6 (5), 482-483 (2000).
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Disease Model and Mechanism. 3 (3-4), 138-143 (2010).
- Wittstein, I. S., et al. Neurohumoral features of myocardial stunning due to sudden emotional stress. New England Journal of Medicine. 352 (6), 539-548 (2005).
- Templin, C., et al. Clinical Features and Outcomes of Takotsubo (Stress) Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 373 (10), 929-938 (2015).
- Shao, Y., et al. A mouse model reveals an important role for catecholamine-induced lipotoxicity in the pathogenesis of stress-induced cardiomyopathy. European Journal of Heart Failure. 15 (1), 9-22 (2013).
- Kudej, R. K., et al. Effects of chronic beta-adrenergic receptor stimulation in mice. Journal of Molecular Cell Cardiology. 29 (10), 2735-2746 (1997).
- Zhuo, X. Z., et al. Isoproterenol instigates cardiomyocyte apoptosis and heart failure via AMPK inactivation-mediated endoplasmic reticulum stress. Apoptosis. 18 (7), 800-810 (2013).
- El-Demerdash, E., Awad, A. S., Taha, R. M., El-Hady, A. M., Sayed-Ahmed, M. M. Probucol attenuates oxidative stress and energy decline in isoproterenol-induced heart failure in rat. Pharmacology Research. 51 (4), 311-318 (2005).
- Rau, C. D., et al. Mapping genetic contributions to cardiac pathology induced by Beta-adrenergic stimulation in mice. Circulation Cardiovascular Genetics. 8 (1), 40-49 (2015).
- Berthonneche, C., et al. Cardiovascular response to beta-adrenergic blockade or activation in 23 inbred mouse strains. PLoS One. 4 (8), 6610(2009).
- Chang, S. C., Ren, S., Rau, C. D., Wang, J. J. Isoproterenol-Induced Heart Failure Mouse Model Using Osmotic Pump Implantation. Methods Molecular Biology. 1816, 207-220 (2018).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology-Heart Circulation Physiology. 282 (6), 2076-2083 (2002).
- Faulx, M. D., et al. Strain-dependent beta-adrenergic receptor function influences myocardial responses to isoproterenol stimulation in mice. American Journal of Physiology-Heart Circulation Physiology. 289 (1), 30-36 (2005).
- Zhang, G. X., et al. Cardiac oxidative stress in acute and chronic isoproterenol-infused rats. Cardiovascular Research. 65 (1), 230-238 (2005).
- Boluyt, M. O., et al. Isoproterenol infusion induces alterations in expression of hypertrophy-associated genes in rat heart. American Journal of Physiology. 269 (2), Pt 2 638-647 (1995).
- Hohimer, A. R., Davis, L. E., Hatton, D. C. Repeated daily injections and osmotic pump infusion of isoproterenol cause similar increases in cardiac mass but have different effects on blood pressure. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 83 (2), 191-197 (2005).
- Cross, H. R., Murphy, E., Koch, W. J., Steenbergen, C. Male and female mice overexpressing the beta(2)-adrenergic receptor exhibit differences in ischemia/reperfusion injury: role of nitric oxide. Cardiovascular Research. 53 (2), 662-671 (2002).
- Klingman, G. I., McKay, G., Ward, A., Morse, L. Chronic isoproterenol treatment of mice: effects on catecholamines and rectal temperature. Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 798-801 (1973).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
