אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה להשתלה 2 '-deoxyguanosine שטופלו E 29.7 בלוטת התימוס לתוך כמוסת הכליה של עכבר ערום. שיטה זו צריכה להיות מחקר של תפקוד שני תאים אפיתל הרתי והתבגרות תאים T.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים
במאמר זה
סיכום
תקציר
התימוס הוא איבר החיסון המרכזי חשוב, אשר ממלא תפקיד חיוני בפיתוח והבידול של תאים T. השתלת התימוס היא שיטה חשובה לחקירת תפקוד התא האפיתל הרתי ו T התבגרות תאים ב vivo. כאן נתאר את השיטות הנסיוניות המשמשות בתוך המעבדה שלנו להשתלה 2 '-deoxyguanosine (כדי לרוקן לימפוציטים של התורם) שטופלו בתימוס מתחלקים לתוך קפסולת הכליה של עכבר עירום athymic. שיטה זו היא פשוטה ויעילה ואינה דורשת מיומנויות או מכשירים מיוחדים. התוצאות שהתקבלו באמצעות שיטה זו פשוטה הראה כי התימוס המושתלים יכול לתמוך ביעילות הייצור של תאי T של המטופל. בנוסף, מספר נקודות מפתח ביחס לפרוטוקול יהיה מובהר עוד יותר.
מבוא
התימוס הוא איבר החיסון המרכזי, בתוך thymocytes התימוס עוברים בחירה חיובית ושלילית, ולהיות תאים T בוגרים1,2. בחירה חיובית או שלילית לא תקין תוצאות כשל חיסוני או הפתווגיות אוטואימוניות בהתאמה3,4. לכן, השתלת איברים התימוס היא גישה חשובה ללמוד את התהליך של בחירת תאים T ב בלוטת התימוס של התורם. שיטה זו היא חיונית במיוחד כאשר ניתוח הרתי אפיתל בתיווך על ידי מוטציות גנים אשר לגרום פנוטיפים מעובריים קטלני כאשר מוטציה5.
כדי ללמוד את ההבשלה של תאים T של המטופל בתימוס המושתלים, דלדול לימפוציטים של התורם בתוך התימוס הוא הכרחי. למטרה זו, עובריים 14, 15 או 16 יום (E14, E15, E16) התימוס הוא בדרך כלל בחירה6,7. התימוס משלבים בוגרים יותר יכול להיות גם מרוקן בהצלחה של לימפוציטים של התורם על ידי טיפול עם 2 '-deoxyguanosine. עם זאת, פרוטוקול מפורט עבור לימפוציטים מכלה ושימוש של תרבות בלוטת התימוס הישנה לא תוארה קודם לכן8,9. בעוד פרוטוקולי ההשתלה הוכנסו על ידי מספר מחקרים10,11, שינוי נוסף ושיפור של פרוטוקולים אלה הוא הכרחי.
הפרוטוקול שלנו מופרד לשני חלקים: (i) המחסור של לימפוציטים T משלב התפתחותי מאוחר E 29.8 בלוטת התימוס על ידי תרבות ב 2 '-deoxyguanosine המכיל מדיה. (ii) השתלת התימוס התרבותי לתוך הנמענים. בהליך זה, פיתחנו דרך פשוטה לספק את הרקמה הגדולה (E 29.8 בלוטת התימוס) לתוך קפסולה כליות עם סיכוי מופחת של פציעה בכליות. בעוד ממוקד על בלוטת התימוס בשלב מאוחר יותר, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש גם ישירות או עם שינויים עבור השתלת בלוטת התימוס בשלבים התפתחותיים שונים או רקמות בגודל דומה אחרים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול המוצג דבק בהנחיות של ועדת האתיקה של אוניברסיטת ג'ינאן לגבי טיפול בבעלי חיים.
הערה: החומרים הנמצאים בשימוש מפורטים ברשימת החומרים.
1. בידוד של התימוס העובריים
- לחיטוי כל כלי ניתוח לפני הניסוי, ולעקר את הספסל/המכסה עם 70% אתנול.
- באמצעות פחמן דו חמצני, מורדם והמתת חסד העכבר הנשי ההרה (18.5 ימים פוסט ההזדווגות מוצלחת). ואז לנגב את אזור הבטן עם 70% אתנול.
הערה: כאן הזדווג Insm1+/lacz נקבות ו Insm1+/lacz זכרים. הזרקה תוך-לפנטוברביטל בוצעו לפני בידוד של עוברים מהרחם ועריפת ראש בוצעו עבור כל עובר. - באמצעות מספריים, להפוך "V" בצורת לחתוך על הבטן החל שלפוחית השתן ופועל עד כל קרן של הרחם.
- באמצעות המספריים, לחתוך את meסומי trium ואת צוואר הרחם/הנרתיק, ולאסוף את הרחם. הניחו את הרחם בצלחת פטרי המכילה תמיסת מלח באגירה קרה (PBS) על הקרח. לאחר מכן, חשפו את העוברים שנמצאים בתוך האדם העוטף, על ידי חיתוך קיר הרחם הקדמי מקרן רחם אחת לשנייה. תוך שימוש בפינצטה משובחת, קלף לאחור את הרקמות העטופים וחתך את חבל הטבור כדי לשחרר את העוברים. הניחו את כל העוברים בצלחת פטרי חדשה על הקרח עד לבידוד התימוס.
- נגב עובר עם 70% אלכוהול ומניחים אותו בצלחת פטרי חדשה. משלב זה, ודא שנשמרים תנאים סטריליים.
- על ידי חיתוך קרוב הלסת התחתונה עם מספריים, להסיר את ראשו של העובר ולנקז את הדם עם מגבת נייר. הבא, לתקן את העובר על אותה צלחת פטרי במצב פרקדן.
הערה: אנחנו חותכים פיסת זנב של כל עובר עבור Insm1 ו לקטהקלדה. - באמצעות מספריים, חותכים את קיר החזה לרוחב אופקית לאורך החזית בדלת השחי, ולאחר מכן לחתוך את הסרעפת כדי לפתוח את החזה. התימוס צריך עכשיו להיות גלוי כמו שתי אונות לבנות הממוקם מול קנה הנשימה ובצמוד ללב.
- להניח מלקחיים מכופף עצה מאחורי התימוס ולאחר מכן למשוך את התימוס בעדינות. הקפידו לבדוק את שלמות התימוס כדי לאשר שהיא מכילה שתי אונות מתנוקת.
- לשטוף את התימוס עם 1x PBS ולקצץ את רקמות החיבור ואת כלי הדם תחת stereomicroscope.
2. תרבות של התימוס העובריים המבודדת
- הוסף 500 μL של התרבות בינונית (RPMI1640 + 15% סרום בפרה העובר (FBS) + 100 U/mL פניצילין ו 100 μg/mL סטרפטומיצין) לכל טוב של צלחת 24 הבאר. להעביר את הרתי נקי לתוך הבארות עם אחד בלוטת התימוס בכל. איור 1 מציג את התימוס המבודד במדיית התרבות.
- לכל בלוטת התימוס מכיל גם להוסיף 2 '-deoxygranosine לריכוז הסופי של 1.25 מ"מ.
- תרבות התימוס המבודד במשך שמונה ימים, מרעננת הן את מדיית התרבות והן את 2 '-deoxygranosine כל יומיים.
3. הקמת המרחב הsubcapsular בקפסולת הכליות
- כדי להכין את המחט ואת צינור האינפוזיה חתוכים (איור 2), לחתוך את המחט וריד הקרקפת על החלק הצינור בזווית 45 מעלות באמצעות מספריים.
- שוקלים את העכבר הערום ולאחר מכן מורדם אותו עם פנטוברביטל (1.5%) הזרקה (75 μg/g משקל הגוף).
- כאשר לא לצבוט רפלקס לאחר הבוהן הוא נצפתה, למקם את העכבר על שולחן ההפעלה במיקום לרוחב ימין.
- עם 0.5% povidone בספוגית יוד, לחטא את העור פעמיים באזור כירורגי מבפנים אל מחוץ לגוף.
- באמצעות מספריים, לעשות חיתוך עור של 5 – 9 מ"מ במקביל לעמוד השדרה באזור הכליה השמאלי (בין הצלע האחרונה ואת הציצה כסל). הבא, לפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך דרך הרקמה התת עורית ואת השריר לחשוף את הכליה.
- עם חשיפת הכליה, השתמשו בזוג מלקחיים ביד אחת כדי להרים את השריר ואת רקמת השומן מקצה החתך בצד השדרה. עם זאת, לסחוט בעדינות את הכליה החוצה (לחילופין, את הכליה ניתן לסחוט החוצה באמצעות אצבעות של שתי ידיים).
- כדי להבטיח כי קפסולה כליות לח במהלך הניתוח, להרטיב את פני השטח של הכליה עם תמיסת מלח (0.9% הנאל).
- ליצור ניק בקפסולה כליה, ובעדינות לשרוט את קפסולת הכליה בצד ימין התחתון באמצעות קצה מחט הכין בשלב 3.1. הגודל של הניק צריך להיות 1/2 – 2/3 רוחב של הכליה; . אל תשרוט את הכליה
- החלק את צינור האינפוזיה שהוכן בשלב 3.1 לתוך הניק על כמוסת הכליה. בעדינות הנתק את קפסולת הכליה עם הכליה לאורך הצד הארוך של הכליה עד שהגיע 3 – 4 מ"מ בתוך קפסולת הכליה. משוך לאחור את צינור העירוי; שטח subcapsular הכליה נוצר.
4. להשתלות התימוס מורטין העובריים
- לשטוף את התימוס תרבותי בשלב 2.3 פעמיים בתמיסת מלח כדי לרוקן את התקשורת התרבותית.
- חבר את צינור העירוי החתוך שהוכן בשלב 3.1 למזרק בממשק המחבר המזרק שלו. מעלים את התימוס המוכן. לתוך צינור האינפוזיה לאט
- הכנס בעדינות את צינור העירוי החתוך לתוך כמוסת הכליות והגיע לעמוד העליון. להעביר את התימוס לתוך קפסולת הכליה; למשוך את הצינור לאט ובמקביל דוחף את הבוכנה של המזרק בעדינות.
- באמצעות מנורת אלכוהול, מעט חום המחט הכין בשלב 3.1. לאחר להבטיח כי התימוס כולו נמצא בתוך החלל הsubcapsular, להשתמש במחט מחוממת לצרוב את הניק.
- לאחר הצרוב, לשחזר את הכליה בחלל הבטן. . תפר את הצפק והשריר
- שימוש שונה הופסק תפר אנכי המזרן, לסגור את חתך העור (לקשור לפחות שלושה קשרים ולחתוך כל חוט עודף).
- , בשימוש בספוגית יוד. חטא את החתך כדי להקל על הכאב, הזרקה תת עורית של flunixin (2 μg/g של משקל הגוף) בוצעה במהלך הניתוח ולאחר מכן עבור 3 ימים לאחר הניתוח.
- עד התאוששות מלאה מהרדמה, לשמור על העכבר חם תחת מנורת אינפרא אדום.
- לשמור על התימוס בקפסולה הכליה של המטופל במשך 8 שבועות לפני שהוא מבתר את התימוס המושתלים וביצוע ניתוח פנוטימית כמתואר בעבר5,8,9.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן אנו מראים את מבודד E 29.8 בלוטת התימוס המכיל שתי אונות מלאה (איור 1). בנוסף, אנו מראים את המחט וריד הקרקפת כי היה מעוגל לטופס שיקוע על צינור אינפוזיה (איור 2). הבא, אנחנו גם מראים דמות ייצוגית של המיקום של התימוס כי היה מושתלים קפסולת הכליה (איור 3A) ואת התימוס לאחר 8 שבועות של צמיחה בתוך עכברי הנמען (איור 3a). כדי לקבוע אם התאים T יוצרו בעכברים עירום מושתלים עם בלוטת התימוס, הן בלוטת התימוס המושתלי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Subcapsular הכליות השתלת בלוטת התימוס העוברית היא שיטה חשובה ללמוד את התאים אפיתל הרתי בתפקוד ואת תהליך ההבשלה של תאים T ב vivo. למרות שיש מחקרים ניסיוניים מספר על תרבות הגוף מעובריים התימוס השתלת6,7, הפרוטוקול שלנו מספק הליך חלופי פשוט על תרבות התימוס מורנין עובריים subcapsular השתלת רקמת בלוטת התימוס הישנה.
הפרוטוקול שלנו משתפר בפרוטוקולים הקודמים על ידי שילוב מספר שינויים שונים 6,...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין קונפליקטים של עניין מוצהר.
תודות
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי חבילת ההתחלה של אוניברסיטת ג'ינאן כדי S.J. ועל ידי המדע והטכנולוגיה תוכנית של סין גואנגג'ואו (גרנט No. 201704020209 כדי S.J.). אנו מודים לאמי בוטה (מחלקת הביולוגיה, אוניברסיטת יורק, טורונטו, על M3J 1P3, קנדה) להגהה ועריכה של כתב היד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.5% פובידון יוד | שנחאי Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% הזרקת נתרן כלורי | שאנדונג Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 מ"ל מזרק סטרילי | Solarbio | YA1090 | |
| 2'-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M ב-DMSO, 1:800 באמצעות (סופי 1.25 מ"מ) |
| 24 צלחת באר | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 מחטי תפר כירורגיות עם חוט | NingBo Cheng-He מכשירים מיקרוכירורגיים במפעל סין | YY0166-2002 | |
| צלחת תרבית תאים 60 מ"מ | קורנינג משולבת | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC נוגדנים CD8a נגד עכבר | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| מלקחיים עדינים בקצה כפוף, JZ 10 ס"מ | שנחאי מכשור רפואי קבוצה ושות', בע"מ | JD1060 | כדי לעקר לפני השימוש |
| Cefmetazole נתרן להזרקה | סצ'ואן Hexin פרמצבטיקה ושות', בע"מ | 17062111 079 | 6 מ"ג בתמיסת NaCl 0.5 מ"ל 0.9%, 7.5ul / גרם משקל גוף |
| מספריים לניתוח, JZ 10 ס"מ | שנחאי מכשירים רפואיים קבוצה ושות', בע"מ | JC2303 | לעיקור לפני השימוש |
| סרום בקר עוברי (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| מלקחיים עדינים, JZ 10 ס"מ | שנחאי מכשור רפואי קבוצה ושות', בע"מ | JD1050 | לעיקור לפני השימוש |
| זרימה ציטומטריה | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 1 מ"ג בתמיסת NaCl של 1 מ"ל 0.9%, מלקחיים של משקל גוף 2ul/g | |
| , Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | לעיקור לפני השימוש |
| מנורת אינפרא אדום | OTLAN | MT-810 | |
| מחזיק מחט, JZ 14 ס"מ | שנחאי מכשור רפואי קבוצה ושות', בע"מ | J32010 | לעיקור לפני השימוש |
| PE נגד עכבר CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| תערובת פניצילין-סטרפטומיצין | GIBCO | 15140122 1:100 | |
| מלח נתרן פנטוברביטל | Sigma | P3761 | תמיסה 1.5% ב-PBS, 75ug/g משקל גוף |
| RPMI1640 בינוני | GIBCO | C14-11875-093 | |
| מחט | ורידים בקרקפתשנחאי חביב מכשירים רפואיים ושות', בע"מ | XC001 | |
| מספריים אביב | VANNAS | S11014-12 | לעיקור לפני השימוש |
| סטריאומיקרוסקופ | OLYMPUS | SZ61 | |
| סטרילי 15 ס"מ צמר גפן | גואנגג'ואו Haozheng | 20150014 | |
| גזה סטרילית 5 ס"מ x 7 ס"מ-8P | גואנגג'ואו Haozheng | 20172640868 | |
| סטרילי PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| מלקחיים לרקמות, JZ 12.5 ס"מ | שנחאי מכשור רפואי קבוצה ושות', בע"מ | J41010 | לעיקור לפני השימוש |
מקורות
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709(2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
