Method Article

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדווחים על שליח RNA (mrna) אלקטרופורציה כשיטה המאפשרת ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים במערכת דגם העובר שליו. שיטה זו ניתן להשתמש כדי לתייג תאים במהירות ולהקליט את התנועות שלהם vivo על ידי הזמן לשגות המיקרוסקופיה זמן קצר לאחר electroporation.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדווחים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר חלבונים פלורסנט כדי לתייג תאים בעוברי שליו חיים במהירות רבה יותר ובאופן נרחב יותר אלקטרופורציה DNA. היעילות הגבוהה ביותר מאפשרת לפחות 4 mRNAs ברורים להיות שיתוף מעבר עם ~ 87% יעילות. רוב מוצרי ה-mRNAs החשמליים מפוקעים במהלך 2 השעות הראשונות של הפוסט-אלקטרופורציה, ומאפשרות ניסויים תלויי זמן להתבצע בעובר המתפתח. בסופו של דבר, אנו מתארים כיצד התמונה באופן דינאמי בשידור חי העוברים עם mRNAs כי קידוד שונים ממוקד חלבונים פלורסנט ממוקדות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקטרופורציה היא שיטת העברה פיזית המשתמשת בפולס חשמלי כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום הפלזמה, המאפשר חומרים כמו חומצות גרעין או כימיקלים לעבור לתוך ציטוסול. אלקטרופורציה משמשת רבות כדי לספק דנ א לתוך חיידקים, שמרים, צמחים, ותאים מהיונקים1,2,3. הוא משמש באופן שגרתי כדי להחדיר מדים גנטיים לתוך תאים ורקמות היעד בתוך העובר העופות המתפתח ללמוד את השליטה הגנטית של פיתוח או תווית הגירה אוכלוסיות של תאים4,5,6, 7. לאחר מכן עם זאת, מספר מגבלות נסיוניות קיימות גם עם אלקטרופורציה DNA8. למשל, אלקטרופורציה DNA מציג לעתים קרובות מספר משתנה מאוד של וקטורים ביטויים לכל תא ולאחר מכן mRNAs וחלבונים הם לקודד. השונות הזאת עלולה להוביל לטרוגניות משמעותית בתאי התא, המסבך את ניתוח התמונה ואת פרשנות הנתונים9,10. בנוסף, חלבונים מ-DNA אלקטרופורציה רק מתחילים לבטא ~ 3 h פוסט אלקטרופורציה ולא להגיע ליעילות המקסימלית של מספר התא ואת עוצמת הקרינה עד 12 h, כנראה בשל הזמן הנדרש להעביר לתוך הגרעין ולהשלים תמלול ותרגום בvivo11.

לעומת זאת, השימוש ב-mrna משמש באופן יעיל במגוון מערכות מודל, כולל xenopus זריזה oocytes על ידי מיקרוהזרקה12,13, התכנות משנה את תאי הגזע האנושי על ידי mrna lipofectamine החצייה14 , ומרדנות בתאי גזע עצביים בעכברים למבוגרים15. בדקנו את היכולת של mrna אלקטרופורציה כדי לתייג ביעילות תאים במהלך פיתוח מוקדם העופות מתחלקים באמצעות מסונתז mrna באופן מתורבת לקודד חלבונים פלורסנט ברורים (FPs). ללימודים שלנו, השתמשנו pCS2 + וקטור, וקטור ביטוי רב-תכליתי המשמש בדרך כלל להבעת חלבונים ב xenopus ו-דג זברה עוברי. ה-RNA פולימו T7 מיזמים בpCS2 + היתר את הסינתזה של mRNA וחלבון מכל גן משוכפל כאשר משתמשים ב תמלול/מערכת תרגום של מבחנה.

כאן, אנו מדגימים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים. עיצבנו ויצרנו רבים מוקטורי הביטוי בהם נעשה שימוש במחקרים אלה. לדוגמה, אנו שיכלנו משנה את הגן LifeAct-eGFP16 לתוך pCS2 + וקטור17 לבטא מן היזם CMV ו-SP6 מקדם. הגן המוסף נמצא במורד הזרם של מקדם SP6 ובמעלה הזרם של הזנב SV40 פולי (A)18. ב עוברים שיתוף electroporated עם mRNA ו-DNA, FPs מקודד מ-Mrna המועתק מחוץ לתחום שזוהו לראשונה בתוך 20 דקות של אלקטרופורציה, בעוד FPs של וקטורים ביטוי DNA אותרו רק לאחר 3 h. קידוד Mrna מרובים עבור גרעיני, Golgi, ו חלבונים קרום יכול להיות electroporated לתוך העובר בו זמנית, וכתוצאה מכך ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בתאים בודדים. בסופו של דבר, באמצעות התאוששות vivo פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) שיטת, אנו מראים כי רוב הריקבון Mrporated הדעיכה בתוך 2 h. כך, ייצור חלבון ראשוני מהיר בשילוב עם תרגום חלבון חדש מוגבל הופך את mrna אלקטרופורציה טכניקה רבת ערך כאשר השליטה הטמפורלית של הביטוי הוא הכרחי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הליכי החיות בוצעו בהתאם הנחיות מאושרות מבית החולים לילדים לוס אנג'לס ואוניברסיטת דרום קליפורניה טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות השימוש.

1. הדור ביטוי מבוסס pCS2 וקטורים

  1. לשכפול pCS2. Lifeact-eGFP, להכין את עמוד השדרה וקטור על ידי עיכול 2 μg של pCS2. CycB1-GFP (בונה המכיל הוספה אחרת) עם BamHI (10 U) ו BsrGI (10 U) במאגר העיכול המתאים (ראה טבלת חומרים) מדולל 1 x בתגובה סה כ נפח של 50 μL עבור 1 h ב 37 ° צ' (ראה איור 1 עבור שרטוט של הליך השכפול).
    1. Deזרחנות בחינם 3 ' הו סוף השדרה הווקטורית מן תגובת האנזים ההגבלה על ידי הוספת שרימפס בסיסי פוספספטאז (1 U). דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
    2. הפעל את כל התערובת ב 1% agarose ג'ל/1x טריס מאגר EDTA (טה) ב-90 V עבור ~ 50 min ולאחר מכן כתם את ג'ל בתמיסה משנת ה0.5 μg/mL של אתידיום ברומיד ב 1 x טה מאגר עבור 15 דקות עם נדנדה עדינה. כמו כן, הקפד לטעון סמני משקל מולקולרי במסלול חופשי כדי לעזור לקבוע את גודלי ה-DNA.
    3. באמצעות DNA בטוח הטרנסמאטור UV כדי להימנע מפני קיצוץ, לגזור את עמוד השדרה הווקטורית (בגודל הלהקה צפוי של 4kb) מן הג agarose במהירות לבודד את קטע ה-DNA מן החלק ג'ל באמצעות ערכת טיהור ג'ל באמצעות הוראות היצרן.
  2. במקביל עם שלב 1.1, להכין את הכנס על ידי עיכול 2 μg של pEGFP-N1-Lifeact עם BglII (10 U) ו Bglii (10 U) במאגר העיכול המתאים מדולל ל 1x בנפח התגובה הכולל של 50 μL עבור 1 h ב 37 ° c. הפעל את התערובת כולה 1% agarose ג'ל כדי לבודד את הלהקה 800 bp כפי שהוסבר בעבר בשלב 1.1.2-1.1.3.
  3. לאחר הן וקטור ולהוסיף מטוהרים וכימות על ספקטרוסקופיה, לשלב 50 ng של וקטור 38 ng של הכנס (1:3 היחס הטוחנת של וקטור להוסיף) במאגר של ה-dna לליגאז t4 לפני הוספת t4 dna ליגאז כדי לזרז את תגובת החיבור. בנוסף, הגדר בקרת דנ א, בקרה וקטורית בלבד, והוספת שליטה בלבד. דגירה כל התגובות בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
    1. שינוי הצורה 1 μL של התערובת הDH10 לתוך E. coli המוסמכת. כמו כן, להפוך את המים רק שליטה שלילית 20 pg של pUC19 חיוביים בקרה. התפשטות חיידקים על לוריא ציר (LB) אגר לוחות המכילים 50 μg/mL אמפיצילין ו דגירה לילה ב 37 ° c.
    2. בבוקר שלמחרת, ספור את. המושבות על כל צלחת
      הערה: באופן אידיאלי, לא צריך להיות מושבות על לוחות הבקרה השלילית, > 100 מושבות על וקטור + להוסיף לוחיות לחות, ופחות מושבות על הצלחת וקטור בלבד.
    3. בחר לפחות 8 מושבות חיידקי מן הצלחת אגר השתנה עם וקטור + להוסיף תערובת הקשר והאיחסן אותם באמצעות קיסמים סטרילית או טיפים pipet לתוך 2 מ ל של המרק LB נוזלי המכיל 50 μg/mL אמפיצילין.
    4. לחלץ דנ א מכל אחד שיבוטים באמצעות מסחרי פלמאמיהכן ערכות miniprep.
    5. הפעל תקציר הגבלת אבחון באמצעות 500 ng של ה-DNA מכל שיבוט באמצעות NotI (10 U) ו BamHI (10 U) במאגר העיכול המתאים מדולל ל 1x עבור 1 h ב 37 ° צ' ולהפעיל את ה-DNA מתעכל על 1% agarose ג'ל במאגר 1 x טאה. גדלי הלהקה צפויים עבור pCS2. Lifeact-eGFP שיבוטים חיוביים הם 3.9 kb ו 978 bp.
    6. המרה 1 pg-100 ng של דנ א מן השיבוט החיובי לתוך E. coli DH10, ולהכין 3-4 miniprep התגובות כמפורט בשלבים הקודמים כדי להשיג כמות מספקת של DNA עבור התגובה שעתוק מבחנה (10 μg מינימום).

2. הכנת mRNA על ידי תמלול חוץ גופית

  1. Linearize 10 μg של pCS2. LifeAct-eGFP על 3 ' סוף של הכנס עם NotI (10 U) במאגר העיכול המתאים מדולל 1 x בנפח התגובה הכולל של 50 μL ב 37 ° c לילה.
    הערה: כדי למנוע זיהום RNase ולהפחית את השפלה mRNA, ללבוש כפפות תוך כדי טיפול בדגימות mRNA.
  2. לטהר את ה-DNA באמצעות תערובת של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1, v/v).
    1. הוסף 150 μL של מים ללא RNase-כדי להפוך את הנפח הכולל של תגובת העיכול שווה 200 μL. לאחר מכן, הוסף 200 μL של פנול: כלורופורם, אלכוהול isoamyl ומערבולת התערובת עבור 20 s.
    2. צנטריפוגה ב microfuge במהירות מקסימלית (18,400 x g) עבור 2 דקות. בזהירות להסיר את השלב העליון מימית המכיל את ה-DNA לינתית. חזור על שלב זה כדי להסיר זיהומים נוספים ולהיזהר שלא לשבש את הזרז הלבן שעשוי להיווצר בין השלבים התחתונים לעליונים.
  3. מזרז DNA לינינאנס על ידי הוספת 1/10 נפח 3M אצטט נתרן (RNase-חינם) ו 2.5 כרכים של 100% אתנול. להשאיר את התערובת ב-20 ° c עבור > 30 דקות, ואז הגלולה ה-DNA על ידי תפרידו במהירות מקסימלית (18,400 x g).
    1. לשטוף את הגלולה DNA עם 70% אתנול, ולאחר מכן האוויר יבש את הגלולה עבור > 5 דקות.
    2. לפזר את הגלולה DNA ב 5 μL of RNase-מים ללא תשלום. . לכמת את הדנ א על ידי ספקטרוסקופיה
      הערה: ריכוז ה-DNA הצפוי הוא ~ 0.5-1 μg/μL עם יחס A260/A280 בין 1.7-2.0.
  4. השתמש 1 μg של pCS2. LifeAct-eGFP ל-DNA שעתוק מבחנה (IVT). בצע את הוראות היצרן בערכה המסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לכלול 10 μL של אנלוגי כובע (הריכוז הסופי 0.8 mM) ו NTPs (הריכוז הסופי 1 מ"מ עבור ATP, CTP, ו-טרומבוזית; 0.2 mM עבור GTP), 2 μL של מאגר התגובה 10x (ריכוז סופי 1x), 2 μL של SP6 RNA פולימראז ו-RNase-מים ללא תשלום עד 20 μL.
    1. מודב את תערובת ה-IVT במשך כ 2 שעות או יותר, בהתאם לגודל התעתיק.
      הערה: הדגירה 2 h עובד היטב עבור תעתיק 3 kb, אבל הדגירה לילה עובד טוב יותר עבור תעתיקים הגדולים מ 5 kb.
    2. כדי להסיר בחינם נוקלאוטידים מן תגובת תמלול, להוסיף 30 μL של ליקיל RNA פתרון משקעים (7.5 M ליתיום כלוריד, 50 mM EDTA) כדי לזרז את mRNA. מערבולת התערובת לזמן קצר ולאחסן ב-20 ° c עבור 30 דקות לסובב את mRNA למטה עבור 15 דקות ב microfuge במהירות max (18,400 x g) ולשטוף עם 70% אתנול (RNase-חינם).
  5. לפזר את mRNA מסונתז ב 15 μL of RNase-מים ללא תשלום. לוותר על mRNA מסונתז ב 5 μL/tube (3 צינורות בסך הכל) ומקום ב-80 ° c עבור אחסון לטווח ארוך. בדיקת מבנה ה-mRNA. בעזרת ספקטרוסקופיה
    הערה: התשואה הצפויה היא 15-20 μg של mRNA (~ 1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) מספיקה עבור ניסוי עם ~ 10 עוברים, בהנחה כי mRNA הוא מדולל מ-1 μg/μL כדי 500 ng/μL ושכל עובר מוזרק עם ~ 200 nL. כל צינור צריך, לפיכך, להכיל מספיק mRNA עבור ניסויים ~ 5.
  6. הפעל ~ 300 ng של mRNA על 1% agarose ג'ל במאגר 1 x טה לאחר ניקוי כל ציוד ג'ל עם פתרון הטיהור RNase (g., RNase משם) ולהבטיח כי mRNA מופיע כלהקה אחת (להקות מרובות יכול להיות נוכח אם המבנה המשני טופס) וכי אין למרוח ppears בנתיב ג'ל, אשר מצביע על השפלה RNA.

3. הכנת שילוב של mRNA אלקטרופורציה

  1. להפשיר ולדלל mRNA על הריכוז הרצוי (250-500 ng/μL ב-RNase מים חינם עובד היטב עבור כל Mrna נבדק בעבודה זו). הוסף 1/10 נפח של צבע צבעוני (ראה טבלת חומרים, RNAse-חינם, 0.1% הריכוז הסופי) כדי לעזור להמחיש את האתר הזרקת mRNA וכיצד למקם כראוי את האלקטרודות.
    הערה:     אם ה-dna ו-RNA משולבים כדי לבצע שיתוף אלקטרופורציה, ודא כי ה-dna הוא חופשי מזיהום RNases באמצעות החילוץ פנול-כלורופורם משקעים אתנול לפני mRNA ו-DNA תערובת.
    1. הקפד להכין שליטה שלילית באמצעות מדמה (לא הוסיף RNA) פתרון אלקטרופורציה. במידת האפשר, הכן פקד חיובי באמצעות mRNA המאומת מראש (mRNA אשר הוכח לייצר FP בהצלחה בניסויים קודמים).
      הערה: השליטה השלילית חיונית לכל ניסויי ההדמיה כדי ליצור רמות של זריחה ברקע לנרמול נתונים. השליטה החיובית חשובה במיוחד כאשר עובדים עם mRNA החדש שהוצמדה על-ידי כך שהיא מסייעת לאשר שהגדרות האלקטרופורציה עבדו.
  2. אחסן את פתרון ה-mrna אלקטרופורציה על שאיפה קרח כדי למנוע השפלה עד שהוא מוכן להמשיך באמצעות אלקטרופורציה.

4. האלקטרופוראט mRNAs לתוך עוברי שליו חיים

  1. לאסוף טרי ביצים שלווים הופרות מדי יום ולאחסן 13 ° c במקרר מחולל לחות עבור לא יותר משבוע 1. הביצה השליו ב-38 ° c עד לשלב ההתפתחותי המבוקש19,20,21.
    הערה: HH3 to HH5 שימשו במחקר זה עבור דימות סטטי ודינאמי. עבור עוברים HH3, להשאיר את הביצים בטמפרטורת החדר עבור 2 h לפני הקציר עושה את תהליך הבידוד הרבה יותר קל כמו העוברים הם בדרך כלל עמידים יותר למניפולציות פיזית כאשר התקרר.
  2. בידוד והכנת עוברים לפי מערכת התרבות של EC22. לאסוף לפחות 5 עוברים בכל תנאי, כולל אחד לפחות לשמש שליטה שלילית (לא אלקטרופורבטים).
    1. בעדינות לשבור ויוצקים את הביצה לתוך 10 ס מ צלחת פטרי. להסיר את רוב אלבומין עבה עם פיפטה העברה ולהסיר את האלבומין עבה הנותרים סביב העובר על ידי ניגוב בעדינות את פני השטח של החלמון עם מחיקה רקמות כדי להבטיח כי העובר מנדבק הדוק לטבעת נייר.
    2. שכבה נייר סינון חתוכים (ראה טבלת חומרים) על העובר ולהשתמש במספריים לחתוך בצורה חלקה סביב היקף העובר.
    3. השתמש בפיפטה פסטר כדי לשכב עם העובר עם PBS, תוך שימוש בזרמים עדינים כדי לפנות את כל החלמון הנדבק לעובר.
      הערה: שלב זה הוא קריטי כאשר עובדים עם העוברים הצעירים (< HH3) בגלל העוברים האלה נוטים להיצמד יותר לחלמון ולעיתים קרובות להתנתק מקרום ויטלין במהלך השטיפה העוקבת.
    4. משוך באיטיות את העובר/נייר בזווית אלכסונית מעלה ומחוץ לחלמון לצלחת פטרי המלאה ב-PBS לניקוי נוסף. ברגע שרוב החלמון הוסר, מניחים את הצד השני של העובר על צלחת פטרי 35 מ"מ מכוסה בתערובת חצי מוצקה של אגר/אלבומין.
  3. הכינו 6 עד 8 10 ס מ מיקרונימים זכוכית ארוכים (מנת יתר = 1.2 מ"מ) באמצעות מכשיר מיקרופיפטה זכוכית פולר.
  4. מניחים את העובר בצד השני. בחדר החשמל מלא בערוץ החלל באמצעות מיקרוקפילר זכוכית, להזריק את המנת של 200 nL של mrna או DNA/mrna אלקטרופורציה לערבב לתוך החלל בין הקרום epielline ויטאלין המכסה את האזור הרצוי.
    הערה: השטח הקדמי כולו עבור pelלבדה וכמה אזור עבור opaca היה אלקטרופורated ברוב הניסויים המוצגים בכתב היד הזה.
  5. מניחים את האלקטרודות חיובי ושלילי (פלטינה כיכר אלקטרודה שטוחה; אורך של 5 מ"מ) על העליון והתחתון של העובר בהתאמה אלקטרופוראט באמצעות רצף הדופק הבא: חמישה פולסים חשמליים רבועים של 5 V, 50 ms משך עם 100 ms מרווחי זמן באמצעות vivo electroporator. ודא כי המרחק בין האלקטרודות הוא ~ 5 מ"מ.
    הערה: אופטימיזציה של הפרמטרים האלקטרופורציה חיונית כדי למנוע תנאים שיכולים להרוג את התאים העובריים שבריריים. פרמטרים של מתח, אורך הדופק, מרווחי הדופק, ואת מספר פולסים ל-DNA ו-mRNA צריך להיחשב עבור מכשירי אלקטרופורציה שונים.
  6. מודחלת העוברים אלקטרופורביים ב 38 ° צ' לשלב ההתפתחותי המבוקש.
    הערה: הפלורסנט מבתר את סטריאוסקופ (ראה טבלת חומרים) מסייע למסך עוברים מזוהמים לעומת עוברי מעבר לא-מעבר.
  7. אם העוברים הם להיות בתמונה סטטית, לתקן אותם ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS עבור 1 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c.
    1. להסיר את העוברים מן הקרום vitelline על ידי חיתוך חלק סביב היקף נייר מסנן עם מספריים לקלף את קרום מבריק על פני השטח עם מלקחיים חדים בעדינות.
    2. לשטוף את העוברים קבוע ב PBS/טריטון (0.1%) 2x עבור 5 דקות ולהמשיך עם היברידיזציה באתרו או החיסוני במידת הצורך.
    3. לבסוף, כתם העובר ב 0.5 μg/μL DAPI ב PBS/טריטון (0.1%) לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את העוברים ב PBS/טריטון 2x עבור 5 דקות ולנקות את העובר בקנה מידה-U2 פתרון23 לילה.
  8. כדי לנתח את היעילות של אלקטרופורציה (ראה איור 2), השתמש בכלי ניתוח בינארי וחלקיקים ובערוץ dapi ב-imagej לקבלת קווי מתאר גרעיניים מכל התאים בתמונה.
    1. כדי להשתמש בכלי הבינארי ב-ImageJ, השתמש בפרוסת z אחת בערוץ DAPI המכיל את רוב התאים ולחץ על תהליך > בינארי > הפוך לבינארי. כדי להפריד תאים סמוכים, לחץ על תהליך > בינארי ≫ פרשתהדרך. השג קווי מתאר של תאים על-ידי לחיצה על ניתוח ≫ נתח חלקיקים, הגודל מוגדר ל 100-500 (μm2).
    2. ודא שרוב התאים מתוארים בערוץ DAPI ושמור את קווי המתאר של התא על-ידי לחיצה על יותר > שמור בחלון המוקפץ של מנהל הROI.
    3. השתמש בקווי מתאר אלה כדי לקבל ערכי עוצמה של אור השמש עבור הערוץ mRNA ו-DNA על ידי פתיחת הקובץ שנשמר בעבר על z-פרוסה אחת ב-mRNA או בערוץ ה-DNA ולאחר מכן לחץ על מדידה במנהל הROI.
    4. לבסוף, לסנן את ערכי העוצמה האלה, לספור תאים עם < 6000 עוצמה פלואורסצנטית כמו מנוכר ותאים עם > 6000 עוצמה פלואורסצנטית כמו מזוהמים.

5. FPs תמונה מקודד על ידי מוצרי mRNAs

  1. בחר את העובר electroporated בריא והטוב ביותר עבור ניסויים הדמיה דינמית לאחר הסתכלות על כל העוברים electroporated תחת הפלורסנט מבתר סטריאוסקופ.
    1. המשיכו לטחון את העוברים האלקטרו-חשמליים האחרים ואת העובר שאינו אלקטרופורף (השליטה השלילית) בחממה נפרדת תוך הדמיה של העובר הנבחר במקרה שעובר זה מת במהלך הניסוי.
  2. עבור ההדמיה הדינמית, השתמש בתרבות העובר כולו של לאקס בקובו, כפי שמתואר בעבר24,25,26 עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי הפוך.
    הערה:     המיקרוסקופ מצויד בחממה לבמה (ראו טבלת חומרים) השומרת על הטמפרטורה ב-36 ° c במהלך ההדמיה. זה נצפתה במהלך הגדרת מיקרוסקופ שעוברים מודלים ב 36 ° c לשרוד יותר מאשר בטמפרטורות גבוהות יותר, אולי בגלל הלייזר עלול לגרום לחימום המקומי על העובר. על הקוראים לקבוע את טמפרטורת הדגירה האופטימלית על הבמה לצורך הגדרת המיקרוסקופ שלהם.
    1. באופן דינמי תמונה ולהמחיש embryogenesis, לנקות את העובר electroporated בקצרה עם PBS כדי להסיר כל בועות שעשוי להיווצר בצד השני של העובר במהלך תהליך אלקטרופורציה על ידי הזזת העובר סביב באמצעות מלקחיים ב-PBS נקי פתרון.
    2. מניחים את העובר נקי ישירות על צלחת הדמיה המכילה שכבה דקה של אלבומין-אגר (~ 150 μL) לוודא שלא לייצר בועות על פני השטח של העובר22.
    3. כדי להבטיח הישרדות לטווח ארוך הדמיה, להוסיף פיסת התגלגל לחות קטנה של נייר טישו בקצוות הפנימיים של צלחת ההדמיה לאטום את התבשיל באמצעות סרט פרפין כדי למזער אידוי במהלך הדמיה ודגירה.
    4. הזיזו את התבשיל הזה במהירות לשלב הטרום-שחומם של מיקרוסקופ ממוקד ואתרו את הצבע הצבעוני בעובר באמצעות ערוץ ברייטפילד (לייזר PMT 20%), המזהה את האזור המוזרק והאלקטרו-מבוקר.
  3. הגדרת תוכנת הדמיה למטרה הרצויה (10 או 20x), דיקרואיק שיקוף (488 nm for GFP nm, 561 עבור RFP), ספקטרום פליטה (499-562 nm עבור GFP, 570-695 nm עבור RFP), ולהפעיל לייזר המתאים (488 nm עבור GFP, 561 nm עבור RFP).
    הערה:     מחשב mRNA החשמלי תורגם לחלבונים שנראו בתוך 20 דקות (ראה איור 3). המטא-נתונים של ההדמיה המשמשים את רוב התמונות בנייר זה היו: מיקרוסקופ קונקטאני הפוך עם מטרה 20x (ראה טבלת חומרים); פיקסל לשכון זמן, ~ 1.5 μs; מתכוון. לסריקות של 4 שורות
    1. לחץ על Live בתוכנת הדימות והתאם את כוח הלייזר להגדרה המתאימה לעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית, בהתאם לעוצמת הלייזר של כל המיקרוסקופ. התחל על ידי הדמיה של העובר באמצעות 1% כוח לייזר, 800 לצבור, ולהגדיל את כוח הלייזר לאט על ידי 1% במרווחים עד הפיקסלים רווי נראים.
    2. בצע זאת על-ידי הפחתת עוצמת הלייזר מעט עד שלא ייראו פיקסלים רוויים יותר.
      הערה: כוח הלייזר שנבחר לתחילת הפעלת הדמיה של העובר יכול להיות טוב נקודות זמן מוקדם יותר, אבל לא אידיאלי בזמן מאוחר יותר נקודות אם הזריחה של התאים הופך הרבה יותר בהיר או עמעם לאורך זמן. כדי להתייחס לכך, התמונה העובר במעט הגדרות צריכת החשמל נמוך בתחילה מאז התאים electroporated בדרך כלל לקבל בהיר יותר 6 שעות לאחר האלקטרופורציה (ראה איור 3A-E לכמת את העלייה באות). אם התמונות המאוחרות רוויות, המשיכו לצלם עם הגדרות ההדמיה המקוריות, אך קחו תמונה נוספת מיד אחרי הגדרות הדמיה חלשות יותר (מנקב קטן יותר או כוח לייזר חלש יותר).
    3. התמונה העובר כל 3-5 דקות כדי לעקוב אחר הגירה תא בודדים על פני נקודות זמן שונות. עבור עבודה זו, התמונות היו z-ערימות (~ 50 יקרומטר עבה) של אזור electroporated כולו, ועוד כמה חדר נוסף לקראת החלק התחתון של מחסנית z במקרה העובר שוקע לתוך המיטה agarose לאורך המפגש הדמיה.
    4. שים לב באיזו מהירות התאים מתקדמים באמצעות בדיקת נקודות הזמן הראשונות של הסרט הראשון. אם התאים זזים בקצב מהיר (כלומר, הם יוצאים מהאזור של אזור הדימות בתוך עוד כמה נקודות זמן), שקול להרחיב את הזום של אזור התמונה (1x à 0.8 x) או להדמיה באזור אחר.
      הערה: אזורים עובריים באזור pellucida לנוע הרבה יותר מהר מאשר אלה באזור opaca. בנוסף, עוברים צעירים (HH3, HH5) מכילים לעתים קרובות תאים העוברים תנועה מהירה יותר בהשוואה לעוברים מבוגרים (> HH7).
    5. לאחר הדמיה של האזור electroporated של העובר, התמונה אזור בלתי אלקטרואלקטרו של העובר אותו כדי לקבוע רמות של קרינה אוטומטית (צריך להיות מינימלי אם כוח לייזר נמוך < 10% משמש לדמות העובר).

6. התאוששות פלואורסצנטית לאחר Photobleaching לבנה (FRAP) לדרישות mRNA שלמות

הערה: A ב vivo התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) ניתן להשתמש כדי לקבוע כיצד mRNA מנוכר ארוך יכול להיות מתורגם FPs. הפרוטוקול הבא מתאר ניסוי FRAP כדי לזהות את מחצית החיים של H2B. . מבנה הסיטרין, בעובר אלקטרופורנטי

  1. בצע ניסויים frap על המיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך באמצעות מטרה 0.8 לגמרי NA לפתוח לחלוטין.
    1. לאחר אישור אלקטרופורציה של H2B-סיטרין על הstereomicroscope והצבת העובר על הבמה מחומם מראש על מיקרוסקופ קונפוקלית הפוך (ראה שלב 5.2.4), פוטואקונומיקה רוב הקרינה התאית מH2B-סיטרין במגוון זמן נקודות (45 דקות, 2 h, ו 5 שלאחר אלקטרופורציה) באמצעות 405 לייזר nm עם 70% כוח לייזר, 100 חזרות, מהירות סריקה 4, אשר משאיר רק 5% של זריחה שנותרה.
      הערה: תהליך זה אמור להימשך מספר דקות.
    2. המשך להמשיך בדגירה של העוברים על הבמה ב 36 ° c לאחר הלבנת התמונות.
  2. הקפידו לשים לב לחלק באופן פעיל את התאים באזור הצילום, אשר מצביעים על כך שתאי הצילום לא מתו לגמרי לאחר הטיפול.
  3. לרכוש תמונות שלאחר אקונומיקה (מערימות z של האזור electroporated) עבור עד 30 דקות במרווחי זמן קבועים (3 או 5 דקות) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
    הערה: אם הוא זמין, השתמש בשורה H2B-XFP בתור פקד חיובי להבטחת הישרדות התא באזור התמונות. שיעור של התאוששות פלואורסצנטית עבור FP מקודד על ידי mRNA electroporated צריך להקטין, אבל זה עבור FP מקודד באמצעות transgene צריך להישאר עקבי לאורך כל הסרט כולו.
  4. כדי להבטיח כי תנאי ההדמיה אינם משפיעים על הישרדות העובר, במקביל העוברים הדמיה של מסגרות אלקטרופורמיות שאינן מפוטנות, שעשויות לשמש כשליטה להדמיה.
  5. כדי לכמת את התוצאות של הלבנה עבור הריקבון mrna אחרי האלקטרופורציה, לעקוב אחר הזריחה של התא לאורך זמן (3 או 5 דקות) על ידי מדידת עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של המרכז (a 7.5 יקרומטר מעגל) של כל תא באמצעות imagej. למדוד את זה עבור כל התאים בתוך האזור photobleached ולבן כי הם לא עוברים מיטוזה והיה לחלוטין photobleached ולבן.
    הערה: שקול להשמיט את התאים הmitotic מן הקוונפיקציה מאז הגרעין mitotic יש קרינה חזקה יותר מאשר גרעיני בין הפאזה עקב עיבוי כרומטין.
  6. להתוות את עוצמת הקרינה לאורך זמן לאחר אקונומיקה במגוון של נקודות זמן (45 דקות, 2 h, ו 5 h).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA אלקטרופורציה יעילה יותר מאלקטרופורציה של DNA

השתמשנו pCS2 +. H2B-סיטרין כדי להכין ב-mRNA העתק מבחנה. מאז ה-DNA אלקטרופורציה מבוצע בדרך כלל ב 1-2 μg/μl, השתמשנו ריכוז שווה ערך של mrna (מחושב להיות סביב 0.25-0.5 μg/μl עבור H2B-סיטרין) עבור mrna אלקטרופורציה. בדקנו לראשונה את יעילות האלקטרופורציה של pCS2 +. H2B-DNA הסיטרין בהשוואה ל H2B-סיטרין (בתוך מבחנה מחוץ לתכנון SP6 של pCS2 +. H2B-סיטרין) על ידי ה-DNA או ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, סיפקנו צעד אחר צעד הוראות על איך בדיוק מיקרו הזרקת ו אלקטרופורטה mRNA לתוך התאים של עוברי שליו הגאוגעיים. הדגמנו כי בתוך מתורבת מסונתז mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים (איור 2 ו -3). קרינה פלואורסצנטית H2B-צהוב מתורגם מ-mRNAs באמצעות מיקרוסקופ conporated בתוך ~ 20 דקות וגדל בזריחה FP במשך שעות (איור 3, משלים סרט 1). זה מהיר באופן מפתיע וקרוב לזמן ההבשלה ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים של עניין להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לדוד הוס על תובנות מועילות בעבודה זו. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מלגת מחקר הקיץ של קרן רוז הילס (2016-2018) ומלגת מחקר של אוניברסיטת דרום קליפורניה ל-ת, מכון מחקר סבן במסגרת הכשרת טרום-דוקטורט לרפואה, ואוניברסיטת דרום קליפורניה מחקר הסמכה עמיתים התוכנית פרס ר

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFניו אינגלנד BiolabsR3136L
BglIIניו אינגלנד BiolabsR0144S
BsrG1-HFניו אינגלנד BiolabsR3575S
NotI-HFניו אינגלנד BiolabsR3189L
SalI-HFניו אינגלנד BiolabsR3138L
פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהולתרמו פישר
SP6 mMessage מכונת ערכת תמלול במבחנהThermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)פניל-פוליאתילן גליקול, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, פוליאתילן גליקול tert-octylphenyl ether
DAPIסיגמא אולדריץ'D95422-(4-אמידינופניל)-6-אינדולקרבמידין דיהידרוכלוריד, 4&פריים;,6-דיאמידינו-2-פנילינדול דיהידרוכלוריד, נייר סינון DAPI דיהידרוכלוריד
ווטמן מס' 1 סיגמאאולדריץ'WHA1001125
גליצרולסיגמא אולדריץ'G9012
אוריאהסיגמא אולדריץ'51457
pmTurquoise2-GolgiAddgene36205pmTurquoise2-Golgi הייתה מתנה מדורוס גדלה (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methods 2008;5:605-7. מזהה PubMed: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneמאמר זה
pCS.H2B-citrineAddgene53752pCS-H2B-citrine היה מתנה משון מגאסון (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry היה מתנה משון מגאסון (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 מיקרוסקופ הפוךCarl Zeiss Microscopy GmbHה-LSM-780 הוא מיקרוסקופ קונפוקלי ורב-פוטוני המציע את הרגישות הנדרשת לעבודות הדמיה חיוניות. מצויד בבמה ממונעת, מכשיר פוקוס אוטומטי וחממת האפלה מלאה על הבמה, ה-780 הוא מיקרוסקופ מצוין להדמיית תאים חיים/עוברים מתקדמים. גלאי הקוואזר בעל 32 הערוצים בעל הרגישות הגבוהה מאפשר הדמיה ספקטרלית, ניתוק ליניארי וספירת צבעים גבוהה (>4) רכישת תמונה. עירור יכול להתבצע עם לייזר פוטון בודד של 6 שורות (405, 458, 488, 514, 564 ו-633 ננומטר), לייזר זיקית (קוהרנטי) 2 פוטונים (טווח בין 690 ננומטר ל-1000 ננומטר), ולהפעיל עם תוכנת מערכת ZEN 2011 SP7 (שחור).
CUY-21 EDIT in vivo electroporatorBex Co., Ltd.
אלקטרודה מרובעת שטוחה פלטינה, אורך צד 5 מ"מBex Co., Ltd.
Olympus MVX10 FL מיקרוסקופ סטריאוOlympus LifeScience
XM10 מצלמה מונוכרוםOlympus LifeScience
Phosphate-Buffered Sa (PBS) עבור HCR (10&, pH 7.4) להכנת 1 ליטר של תמיסת 10& מלאי, שלב 80 גרם NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 גרם KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 גרם Na2HPO4 (נטול מים; Sigma-Aldrich S3264), ו-2.7 גרם של KH2PO4 (נטול מים; סיגמא-אולדריץ' עמ' 9791). התאימו את ה-pH ל-7.4 עם HCl, והביאו את הנפח הסופי ל-1 ליטר עם H2O טהור במיוחד. הימנע משימוש ב-CaCl2 ו-MgCl2 ב-PBS עבור HCR. חשוב שה-PBS עבור HCR יוכן כתמיסה נטולת RNase (למשל, באמצעות טיפול בדיאתילפירוקרבונט [DEPC]).
1.37 מ' NaCl
27 מ"מ KCl
80 מ"מ Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Tritonהוסף 1 מ"ל של Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) ו-100 מ"ל של 10& PBS עד 890 מ"ל של H2O מזוקק אולטרה-טהור סנן את התמיסה דרך 0.2 μ מסנן מ 'ואחסן אותו ב -4? C עד השימוש.
1& פעמים; תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) (מטופל ב-DEPC; pH 7.4)
0.1% טריטון X-100
15593031LF701P5E

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894(2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674(2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918(2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

mRNA ElectroporationAvian EmbryosFluorescent ProteinsProtein ExpressionConfocal MicroscopyPhotobleaching AssayTransfection EfficiencyEmbryo ImagingQuail EmbryosDynamic Imaging

Related Articles