מאמר שיטה

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

DOI:

10.3791/59676

⸱

13 בספטמבר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מספק שיטות מפורטות לגבי בדיית ואפיון מכשיר מיקרופלואידיג בעלי דלקת ריאות לדחיסת כונדרוציט.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גירויים מכניים ידועים לווסת פונקציות ביולוגיות של תאים ורקמות. מחקרים שנעשו לאחרונה הציעו כי הלחץ בלחיצה משנה את ארכיטקטורת הסחוס לוחית הצמיחה ותוצאות אפנון גדילה של עצמות ארוכות של ילדים. כדי לקבוע את התפקיד של מתח הדוק בצמיחת העצם, יצרנו מכשיר מיקרופלואידיג המופעל על ידי הלחץ הפניאומטי, באופן דינאמי (או סטטי) לדחוס את צלחת הצמיחה כונדרוציטים מוטבע בגלילים הידרוג'ל של קילוף פלסטיצידיות. במאמר זה אנו מתארים שיטות מפורטות לבדיית ואפיון התקן זה. היתרונות של הפרוטוקול שלנו הם: 1) חמישה גניטודות שונים של לחץ מדגיש ניתן ליצור על חמש משכפל טכני בפלטפורמה אחת, 2) קל לדמיין את המבנה התא באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי, 3) תאים יכולים להיות מבודדים במהירות מהמכשיר לאחר הדחיסה כדי להקל על המטה במורד הזרם, ו -4) ניתן ליישם את הפלטפורמה על מנת ללמוד מכניאולוגיה של כל סוג תא שיכול לצמוח בהידרולים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלטפורמות מיקרו מהונדסים הם כלים יקרי ערך ללמוד את הביולוגיה מולקולרית, תאית, רקמות ברמה כי הם לאפשר שליטה דינמית הן מיקרוסביבות פיזיות וכימיות1,2,3 ,4,5,6,7,8. לפיכך, ניתן לבדוק השערות רבות באופן סימולטני בצורה מבוקרת היטב. במקרה של סחוס הצלחת הצמיחה, יש להגדיל את העדויות של תפקיד חשוב של הלחץ בלחיצה בצמיחה עצם מודליטינג באמצעות פעולה על הסחוס לוחית הצמיחה9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. עם זאת, מנגנון הפעולה של מתח ברור – בפרט, כיצד מנחה המתח את היווצרות עמודי כונדרוציטים בצלחת הצמיחה-מובן בצורה גרועה.

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור התקן מיקרופלאידיג מיקרו מבחינה כונדרולוגיה מכשיר דחיסה26 כדי להבהיר מנגנונים של מכניביולוגיה בצלחת הצמיחה כונדרוציטים (איור 1א-ג). המכשיר מורכב משני חלקים: יחידת האקטוציה הפניאומטית ובניית ג'ל האלגיאט. יחידת האקטואריה הפניאומטית של מיקרופלואידיג מפוברק בעזרת polydiמתיל siloxane (PDMS) בהתבסס על הצילום-וליתוגרפיה הרכה. יחידה זו מכילה 5 x 5 מערך של בלוני קרום PDMS דק אשר ניתן מנופח באופן שונה בהתבסס על קטרים שלהם. בניית ג'ל קילוף פלסטיצידיות מורכב כונדרוציטים מוטבע 5 x 5 מערך של בגלילים ג'ל קילוף פלסטיצידיות, ואת בנייה קילוף פלסטיצידיות כונדרוציטים מורכבים עם יחידת הגשמה. מבנים ג'ל קילוף פלסטיצידיות נדחסים על ידי בלונים pdms מנופח בדרך הריאה (איור 1b). המכשיר המיקרו-פלואידיג יכול ליצור חמש רמות שונות של לחץ הדוק בו זמנית בפלטפורמה אחת המבוססת על הבדלים בקוטר בלון PDMS. לפיכך, ניתן לבדוק את התפוקה הגבוהה של כונדרולוגיה ביולוגית בתנאי דחיסה מרובים.

המכשיר microflu, המתואר בפרוטוקול זה יש יתרונות רבים על התקן הדחיסה המקובלת כגון תופסני חיצוניים14,21,23 ו התקנים דחיסה מאקרוסקופי16, מיכל בן 19 , בן 27 , 28 ללימוד כונדרוביולוגיה מכניאולוגיה: 1) המכשיר microflu, מיקרופלואידים הוא עלות אפקטיבית משום שהוא צורכת נפח קטן יותר של דגימות מאשר התקן דחיסה מאקרוסקופי, 2) המכשיר microflu, c הוא הזמן יעיל כי זה יכול לבדוק מספר תנאי דחיסה בו זמנית, 3) מכשיר המיקרו-פלואידיג יכול לשלב גירויים מכניים וכימיים על ידי יצירת מעבר ריכוז של כימיקלים המבוססים על ערבוב מוגבל במיקרוערוצים, ו-4. טכניקות מיקרוסקופ שונות (בזמן הצניחה מיקרוסקופיה ומיקרוסקופיה של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית) ניתן להחיל עם מכשיר מיקרופלואידיג מתוצרת PDMS שקופה.

אימצנו ושינו את השיטה של moraes ואח '7,29 כדי ליצור רמות מצוקה שונות של הלחץ במכשיר אחד כדי לאפשר תפוקה גבוהה לימודי מכניבביולוגיה של דחיסת כchondrocyte. הגישה שלנו מתאים לתאים (למשל, כונדרוציטים) אשר צריך תלת מימדי (3d) התרבות הסביבה עבור בחני יולוגי לאחר דחיסת תאים. למרות שחלק מהתקני הדחיסה של תא microflu, מיקרופלואידים יכולים לדחוס תאים הנמצאים בשימוש בשני מימדים (2d) ב-30,31,32, לא ניתן להשתמש בהם עבור כונדרוציטים כגון כונדרוציטים מסוג 2d להבדיל. יש פלטפורמות מיקרופלואידיג לדחיסת תאים תלת-ממדיים באמצעות הידרו-ג'ל פוטופוליזציה7,33, אבל הם מוגבלים בבידוד תאים אחרי ניסויים בדחיסה משום שבידוד תאים מפוטופוליזציה הידרוג'ל אינו קל. בנוסף, ההשפעות של אולטרה סגול (UV) חשיפה ומיזמים מרובי קישורים על התאים ייתכן שיהיה צורך להעריך. לעומת זאת, השיטה שלנו מאפשרת בידוד מהיר של תאים לאחר ניסויים הדחיסה עבור פוסט ביולוגי בחני כי קילוף פלסטיצידיות הידרוג יכול להיות מקובע במהירות על ידי מכשירי סידן. בפרוטוקול זה מתוארים השיטות המפורטות לייצור ואפיון. הליך קצר עבור בדיית כונדרופלואידיג מכשיר דחיסה מוצג באיור 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לבשו ציוד הגנה אישי (PPE) כגון כפפות ומעיל מעבדה לכל שלב בפרוטוקול זה.

1. ייצור עובש מאסטר

הערה: בצע את השלב 1.1-1.3 במכסה המנוע.

  1. טיפול בזכוכית
    הערה: לבש מגן פנים, כפפות ומעיל מעבדה לשלב 1.1.
    1. להפוך את הפתרון פיראניה (60 mL) על ידי ערבוב חומצה גופרתית (H2SO4) ו חמצן מימן (h2O2) עם יחס נפח של 3:1.
      התראה: אין להשתמש בתמיסה ובאצטון באותו מכסה המנוע בשל סכנת הפיצוץ.
    2. מניחים צלחת זכוכית (50.8 mm × 76.2 מ"מ × 1.2 מ"מ) בפתרון פיראניה עבור 30 דקות ב 40 ° c.
    3. שטפו את צלחת הזכוכית במים מפוהים (diH2O).
    4. מניחים את צלחת הזכוכית באצטון בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.
    5. לשטוף את צלחת הזכוכית עם איזופנול ולייבש אותו עם חנקן (N2) גז.
    6. אופים את צלחת הזכוכית ב 200 ° c עבור 20 דקות על צלחת חמה. כל צעדי האפייה הבאים משתמשים בפלטה חמה.
  2. מערך שכבת זרע SU-8 על צלחת הזכוכית
    1. הפיצו SU-8 5 על צלחת הזכוכית עם פיפטה חד פעמי כדי לכסות סביב 2/3 משטח הצלחת של הלוח.
    2. ספין את צלחת הזכוכית עם SU-8 5 photoresists ב 500 rpm עבור 35 s (מחזור התחלתי מסתובב) ולאחר מכן 2,500 סל ד עבור 40 s (מחזור הסופי ספינינג) באמצעות coater ספין. כל הצעדים הבאים ציפוי ספין לכלול את אותו מחזור מסתובב הראשונית.
    3. אופים את צלחת הזכוכית מצופה SU-8 5 ב 65 ° c עבור 2 דקות ולאחר מכן ב 95 ° צ' עבור 5 דקות.
    4. לחשוף את הצלחת הזכוכית מצופה SU-8 5 לאור UV (60 mW/cm2, מרחק בין מנורת uv ו פושאול הוא 20 ס מ, כמות כוללת של אנרגיה אור uv = 60 mJ/cm2) עבור 1 s.
      הערה: זמן חשיפה UV צריך להיות מותאם על פי העוצמה של אור UV משמש.
    5. אופים את פלטת הזכוכית מצופה SU-8 5 ב-65 ° c עבור 2 דקות ו-95 ° צ' עבור 5 דקות.
    6. מניחים את צלחת הזכוכית אפוי במפתח SU-8 עבור 2 דקות.
    7. אופים את SU-8 5 זכוכית מצופה ב 180 ° צ' עבור 20 דקות.
  3. הייצור הערוץ SU-8 באמצעות פוטוגרפיה (איור 2a שלב 1-3)
    1. יוצקים SU-8 100 על הלוח הנזרע SU-8 5 כדי לכסות את ה2/3 של שטח המשטח של הלוח.
    2. ספין צלחת זכוכית עם SU-8 100 בשעה 3,000 rpm עבור 38 s (≈ 90 יקרומטר עבה).
    3. אופים את צלחת הזכוכית מצופה SU-8 100 ב 65 ° c עבור 10 דקות ולאחר מכן ב 95 ° צ' עבור 30 דקות. אם SU-8 100 עדיין דביק לאחר הליך זה, אופים את צלחת הזכוכית במשך זמן רב יותר ב 95 ° צ' עד SU-8 100 הופך לא דביק.
    4. במקום ברזולוציה גבוהה microchannel מיקרוערוץ (25,400 dpi, ראה המשלים איור 1) על הצלחת מצופה SU-8 100 הזכוכית ולחשוף את צלחת זכוכית מכוסה פושאל כדי אור UV עבור 4 s (סכום כולל של אנרגיה אור uv = 240 mJ/cm2).
      הערה: זמן חשיפה UV צריך להיות מותאם על פי העוצמה של אור UV משמש.
    5. הסירו את הפושאול מלוחית הזכוכית ואופים את צלחת הזכוכית ב-65 ° c עבור 2 דקות ולאחר מכן 95 ° c עבור 20 דקות.
    6. שמור את צלחת זכוכית אפוי במיכל, אשר עטוף ברדיד אלומיניום כדי לחסום כל אור, עבור ריפוי לילה.
    7. פיתוח הערוץ SU-8 100 על צלחת הזכוכית במפתח SU-8 במשך 15 דקות.
    8. רוחצים את הצלחת זכוכית בדוגמת SU-8 (תבנית אב) עם אלכוהול איזופרופיל ויבש אותו עם N2 גז. אם חלקיקים לבנים נשארים במהלך תהליך זה, חזור על שלב 7 עבור 5 דקות.

2. יחידת הופעה פניאומטית

  1. שכבת מיקרוערוץ (שכבה 1)
    הערה: בצע את הצעד 2.1.1-2.1.2 בתוך מכסה המנוע.
    1. ירידה 200 μL של (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-הטטרלטיל) -1-Triכלורוסילאן על כיסוי ומניחים אותו בחדר ואקום עם תבנית המאסטר.
    2. החל ואקום עבור 2 דקות בחדר ולחכות 6 h (או לילה) עבור silanization של העובש.
    3. מערבבים PDMS עם יחס משקל של 10:1 (prepolymer: ריפוי הסוכן) עבור 5 דקות.
      הערה: כל שלב הליהוק של PDMS שלאחר מכן מכיל את אותו יחס משקל טרום-פולימר וריפוי הסוכן (10:1).
    4. יוצקים PDMS על תבנית הבסיס ואת דגה PDMS בחדר ואקום עבור 30 דקות.
    5. כריך PDMS עם פיסת סרט שקיפות.
    6. הדק את ההרכבה למעלה דחוקה עם צלחת זכוכית, רפידות קצף וצלחות פלקסיגלס (איור 2a שלב 4).
    7. לרפא PDMS בתנור ב 80 ° c עבור 6 ה.
    8. בודד את שכבת PDMS (שכבה 1) עם סרט השקיפות מהמבנה שדחוקה (איור 2a שלב 5).
    9. הפעל משטחים של שכבה 1 וצלחת זכוכית נקייה (צלחת זכוכית 1; 50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 מ"מ) באמצעות מנקה פלזמה עבור 1 דקות.
      הערה: זמן ניקוי פלזמה עשוי להשתנות בהתאם לכוחו של מנקה פלזמה משומש.
    10. בונד שכבה 1 על צלחת זכוכית 1 ולמקם אותם בתנור ב 80 ° c עבור 30 דקות.
    11. הסר את סרט השקיפות משכבה 1.
  2. קרום PDMS דק (שכבה 2)
    1. ספין מעיל ללא נרפא pdms בסרט שקיפות ב 1,000 סל ד עבור 1 דקות כדי לקבל 60 יקרומטר עבה שכבה pdms.
    2. מרפא חלקי לטווח מצופה PDMS (שכבה 2) בתנור ב 80 ° c עבור 20-30 דקות.
    3. הפעל שכבה 1 על צלחת זכוכית 1 ושכבה 2 באמצעות מנקה פלזמה עבור 1 דקות.
      הערה: זמן ניקוי פלזמה עשוי להשתנות בהתאם לכוחו של מנקה פלזמה משומש.
    4. בונד 2 על שכבה 1 ומניחים אותם בתנור ב 80 ° c ללילה.
  3. מחסום אבובים
    1. מניחים צינורות מתכת אנכית על צלחת פטרי.
    2. בעדינות למזוג PDMS בצלחת להטביע על 3/4 של צינורות מתכת.
    3. לרפא PDMS בתנור ב 60 ° c עבור 6 h (או לילה).
    4. חותכים פיסת בלוק PDMS המכילה צינור מתכת אחד.
    5. אגרוף חור בשכבה 2 עבור כניסת הים.
    6. הפעל את בלוק PDMS ושכבה 2 באמצעות מנקה פלזמה עבור 1 דקות.
    7. חבר את הבלוק PDMS אל החלק השני של שכבה 2 ולמקם את יחידת האקטואריה כולה בתנור ב 80 ° c עבור לילה.

3. אלגיאט-כונדרוציט (או חרוז) בנייה

  1. צלחת זכוכית silanized אמינית
    1. חותכים צלחת זכוכית (50.8 מ"מ × 76.2 מ"מ × 1.2 מ"מ) לשתי צלחות זכוכית חצי בגודל (50.8 mm × 38.1 mm × 1.2 mm) באמצעות שובר יהלום.
    2. מניחים את צלחות זכוכית 0.2 M מימן כלוריד (HCl) ולנער בעדינות (למשל, 55 rpm) אותם בלילה.
    3. לשטוף את צלחות זכוכית עם diH2O.
    4. לנער את צלחות זכוכית 0.1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH) עבור 1 h ב 55 סל ד ולשטוף אותם עם diH2O.
    5. לנער את צלחות זכוכית ב 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) עבור 1 h ב 55 rpm ולשטוף אותם עם diH2O.
    6. מייבשים את צלחות הזכוכית הsilanized של האמינו בתוך כיפה לילה.
  2. כייר ג'ל לצמח אלגיאט ג'ל
    1. מערבבים 5% (w/v) agarose ו 200 מ"מ סידן כלוריד (CaCl2) ב dih2O.
    2. מרתיחים את התמיסה האגנה עם תנור מיקרוגל (או צלחת חמה). זמן הרתיחה משתנה בהתאם לעוצמת התמיסה של הצמח ולעוצמת המיקרוגל (או הטמפרטורה של הפלטה החמה).
    3. יוצקים את הפתרון ג'ל מבושל על גבי עובש אלומיניום (ראה המשלים S2), וכריך אותו עם צלחת זכוכית.
    4. המתן 5 דקות והסרת העובש ג'ל התחזק מעובש האלומיניום.
  3. לוחית צמיחה כונדרוציט הקציר
    1. בידוד לוחות הצמיחה מן הגפיים האחוריות של עכברים ה,.
    2. מניחים את לוחיות הצמיחה ב 1 מ ל של 0.25% הקולגן במשך 3 שעות בחממה ב 37 ° צ' ו 8% פחמן דו חמצני (CO2), כדי להסיר מטריצה החילוץ (ecm).
    3. צנטריפוגה את המדגם מתעכל עבור 5 דקות ב 125 x g כדי ליצור גלולה כchondrocyte ולהסיר supernatant מן המדגם. כאן, 1 x g היא האצת הכבידה.
    4. להשעות מחדש את הגלולה כchondrocyte ב 1 מ ל של מדיום הנשר של דולבקה שונה (DMEM).
    5. לספור את מספר כונדרוציטים ב-DMEM באמצעות מונה התא.
    6. צנטריפוגה את כונדרוציטים ב DMEM עבור 5 דקות ב 125 x g כדי לעשות גלולה כchondrocyte שוב ולהסיר supernatant מן המדגם.
    7. באופן אופציונלי, להשעות מחדש את הגלולה כchondrocyte במדיה התרבותית כונדרוציטוט (CCM)34 המכיל 2 μm calcein AM, ו מודיית את המדגם ב 37 ° c עבור 30 דקות. חזור על שלב 3.3.6 ולעבור לשלב 3.3.8.
    8. להשעות את הגלולה כchondrocyte בנפח הרצוי של CCM ולשמור אותם בחממה ב 37 ° צ' ו 8% CO2 לפני השימוש.
  4. Alginate-כונדרוציט (או חרוז) בונה (איור 2 ג)
    1. לערבב 1.5% (w/v) קילוף פלסטיצידיות מלוחים באגירה פוספט (PBS) עם 5 מ"ג/mL של sulfo-כיום, 10 מ"ג/ml של 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד הידרוכלוריד (edc).
    2. הוסף 8 x 106 כונדרוציטים לתוך 1 מ ל של קילוף פלסטיצידיות ג'ל הפתרון [או להוסיף 3 μl של 1 מחרוזות פלורסנט בקוטר μm (542/612 nm) ב 1 mL של הפתרון ג'ל קילוף פלסטיצידיות (0.3% (v/v)]].
    3. מקום 150 μL של alginate-כונדרוסיטה (או חרוז) פתרון על צלחת זכוכית אמינית-silanized מפוברק בשלב 3.1.
    4. לכסות את הפתרון ג'ל קילוף פלסטיצידיות עם עובש ג'ל agarose עבור 3 דקות.
    5. להסיר את הפתרון ג'ל מוגזם קילוף פלסטיצידיות מוצפת בתבנית agarose ג'ל עם להב תער ולהסיר את העובש ג'ל agarose. אז, מבנים גלילי alginate-כchondrocyte (או חרוז) בנייה מתקבלים על צלחת זכוכית silanized אמינית.
    6. מניחים את מבנים alginate-כונדרוציטים בפתרון חוצה קישור (50 mM CaCl2 /140 MM הנאל ב-dih2O) עבור 1 דקות עבור פילמור.

4. הרכבת התקן (איור 2d)

הערה: מפרידי PDMS ומלחציים מודפסים תלת-ממדיים צריכים להיות מוכנים בנפרד.

  1. אתר ארבעה מרווחים מסוג PDMS בעובי 1 מ"מ בארבע הפינות של השכבה 2 של יחידת האקטורות.
  2. מקום 700 μL של CCM כדי לכסות את תאי האוויר של שכבה 2.
  3. מניחים את alginate-כchondrocyte (או חרוז) מבנים על שכבה 2 תוך בזהירות יישור המבנים עם תאי האוויר.
  4. הדק את ההתקן בעזרת תפסים מודפסים תלת-ממדיים (איור 1c).

5. הגשמה של המכשיר

  1. לחבר את השקע של משאבת אוויר (ראה טבלת חומרים) עם כניסת שסתום חשמלי עם אבובים סיליקון.
  2. לחבר את השקע של שסתום חשמלי עם הפרץ של המכשיר התאספו עם אבובים סיליקון.
  3. חבר את שסתום החשמלי עם גנרטור פונקציה.
  4. מניפולציה עם שסתום חשמלי עם גל מרובע (למשל, 1 Hz) שנוצר על ידי גנרטור פונקציה.
  5. הפעל את משאבת האוויר כדי להפעיל את המכשיר בריאות.

6. הדמיה של כונדרוציטים במכשיר

הערה: כדי לקבל איכות תמונה טובה, כונדרוציטים תמונה (או חרוזי פלורסנט) ב קילוף פלסטיצידיות ג'ל באמצעות צלחת זכוכית 2 משום מורחבת בלוני pdms ותאי האוויר יכול לעוות תמונות אופטיות. אם מיקרוסקופ הפוך משמש לדימות, המכשיר צריך להיות מוגדר כך צלחת זכוכית 2 פונה כלפי מטה.

  1. הכן את המכשיר עם כונדרוציטים (או חרוזי פלורסנט) כפי שמוצג בסעיפים קודמים.
  2. קח את התמונות zמחסנית של כונדרוציטים (או חרוזי פלורסנט) עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לפני ותחת דחיסה, בהתאמה. בחר גודל z-step המבוסס על עומק השדה של מערכת דימות מיקוד משומשים.
  3. הגובה של כונדרוציטים (או לבנות חרוזים alginate-חרוז) יכול להיות נמדד עם שיטת עיבוד תמונה אוטומטית המוצגת בספרות הקודמות של26,35.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שלבים מפורטים של התקן הדחיסה של המיקרופלואידיג (איור 2). המכשיר מכיל 5 x 5 מערכים של גליל alginate מבנים כונדרוציטים, ובנייה אלה ניתן לדחוס עם חמישה גניטודות שונים של דחיסה (איור 1, איור 3 ואיור 4). הגובה של המיקרוערוץ הפנאומטי הוא סביב 90 μm, ואת קטרים בלון PDMS הם 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 ו-2.0 מ"מ, בהתאמה. הביצועים של המכשיר היתה כמותית עם מיקרוסקופ קונפוקלית עם תנאי דחיסה סטטי עיבוד תמונה. דח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לבדוק את ההשפעות של לחץ מדגיש על לוחית הצמיחה כונדרוציטים, פיתחנו את מכשיר הדחיסה microflu, כונדרוציטים (איור 1) כדי להחיל רמות שונות של מתח בלחץ על כונדרוcytes בפיגום הידרו-ג'ל לתלת-ממד תרבות בדרכים של תפוקה גבוהה. כדי לסייע לחוקרים אחרים לאמץ את המכשיר שלנו או לפתח מכשירים דומים, סיפקנו את הפרטים של השלבים בייצור המכשיר במאמר זה פרוטוקול.

הצעדים הקריטיים בפרוטוקול זה הם 1) בדיית שכבת PDMS עם מיקרוערוצים פנאומטיים (שכבה 1) ללא כל בועות אוויר מאז בועות האוויר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר כריסטופר מוראיס וסטיבן א. מורין על תמיכתם בעיצוב ובייצור המכשירים. מחקר זה היה נתמך על ידי Bioהנדסאים למענק בריאות האדם מאוניברסיטת נברסקה-לינקולן (UNL) ו אוניברסיטת נברסקה המרכז הרפואי (UNL), ולהעניק AR070242 מ NIH/NIAMS. אנו מודים לג א. טיילור ו ג'יימס ר. Talaska של המתקן המיקרוסקופיה המתקדמת במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה למתן סיוע במיקרוסקופיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(3-אמינופרופיל)טריאתוקסילאן (ATPES)סיגמא-אולדריץ'741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-TrichlorosilaneUnited Chemical TechnologiesT2492-KG
יריעת אקריליקMcMaster-Carr8560K354
משאבת אווירSchwarzer PrecisionSP 500 EC-LC4.5V DCהשתמשנו בדגם שנרכש בשנת 2015. העיצוב הפנימי והביצועים של משאבת האוויר (SP 500 EC-LC) השתנו בתחילת 2016. כמו כן, ביצועי משאבת האוויר השתנו במהלך הזמן. לפיכך, יש לכייל את לחץ האוויר שנוצר על ידי משאבת אוויר SP 500 EC-LC לפני השימוש.
אבקת אלגינטFMC CorporationPronova UP MVG
Barb מחברים ישרים (צינור מתכת)PneumadyneEB40-250
Calcein AMInvitrogenC3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
חלקיקי פלורסנט מימיים צבועים באדוםThermo Fisher ScientificR0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)Thermo Fisher Scientific22980
כרית קצףGRAINGERפריט # 5GCE8
פונקציה / מחולל צורות גל שרירותיKeysight Technologies33210A
חומצה הידרוכלוריתפישר כימיA144-500
מי חמצןפישר BioReagentsBP2633500
איזופרופיל אלכוהולBDH1174-4LPVWR
מיקרוסקופ שקופיותתרמו פישר מדעי22-267-013
מנקה פלזמההאריק פלזמהPDC-001
פולידימתילסילוקסן (PDMS)דאו קורנינג184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג
ספק כוחKeysight טכנולוגיותE3630A
SeaKem LE AgaroseLonza50004
נתרן הידרוקסידפישר כימיS318-1
סעפת סולנואידPneumadyneMSV10-1
שסתום סולנואידPneumadyneS10MM-30-12-3
ציפוי ספיןLaurell TechnologiesWS-650Mz-23NPPB
SU8 מפתחMicroChem Corp.Y020100 4000L1PE
SU8-100MicroChem Corp.Y131273 0500L1GL
SU8-5MicroChem Corp.Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Thermo Fisher Scientific24510
חומצה גופרתיתEMD MilliporeMSX12445

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
  3. Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
  4. García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
  7. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  8. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
  9. Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71(2008).
  10. Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
  11. Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
  12. Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
  13. Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
  14. Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
  15. Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
  16. Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
  17. Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
  18. Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
  19. Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
  20. Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
  21. Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
  22. Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
  23. Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
  24. Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
  25. Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
  26. Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
  27. Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
  28. Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
  29. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224(2010).
  30. Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  31. Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
  32. Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
  33. Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
  34. Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
  35. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  36. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Microfluidic DeviceChondrocyte CompressionDynamic CompressionPDMS FabricationAlginate HydrogelGrowth PlateMechanobiologyPneumatic ActuationCell IsolationFluorescence Microscopy

מאמרים קשורים