הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

29.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59683

⸱

1 ביולי 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Pennsylvania School of Veterinary Medicine, 2Division Experimental Retinal Therapies, Department of Clinical Sciences and Advanced Medicine, University of Pennsylvania School of Veterinary Medicine

במאמר זה

סיכום

דו ח זה מתאר שיטות מקיפות של הכנת העכבר הקפוא מקטעים רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC). השיטות שתוארו כוללות ניתוח של הספל האחורי העינית, קיבעון הפרפורמלדהיד, הטבעה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיה ורקמות כיוון, הסרת וכתמים חיסוני.

תקציר

הכנת סעיפים באיכות גבוהה עכבר העין עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC) הוא קריטי להערכת מבנה ותפקוד רשתית ולקביעת מנגנונים המשמשים מחלות רשתית. שמירה על השלמות המבנית לאורך הכנת הרקמה חיונית להשגת נתונים ברשתית שניתן לתחזק, אך יכול להיות מאתגר בשל שבריאת והמורכבות של האדריכלות הרשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר בצורה אופטימלית את המבנה הרשתית, הם לעתים קרובות לעכב את ניתוח ihc על ידי שיפור הרקע של זריחה ו/או הפוחתת נוגדן האינטראקציות, תהליך המכונה מיסוך אפירופה. תיקונים מתון יותר, מצד שני, כמו 4% פאראפורמלדהיד, מפחית את הרקע של זריחה ואפירופה-מיסוך, טכניקות הניתוח מוקפד חייב להיות מנוצל כדי לשמר את המבנה הרשתית. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מקיפה כדי להכין את העכבר כוסות האחורי העינית עבור IHC כי הוא מספיק כדי לשמר את האינטראקציות הנוגדן ביותר מבלי לאבד שלמות מבנית ברשתית. אנו כוללים נציג IHC עם נוגדנים שונים סוג תא סמנים ברשתית כדי להמחיש שימור רקמות וכיוון בתנאים מיטביים ותת אופטימלית. המטרה שלנו היא לייעל את מחקרי IHC של הרשתית על ידי מתן פרוטוקול מלאה מתוך ניתוח הספל האחורי העינית ל-IHC.

מבוא

אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה רבת-עוצמה לאיתור חלבונים ומבני סלולר ספציפיים ברקמות באתרו1,2,3. שיטות קיבעון בלתי הולמים והפחתה תת-אופטימלית של רקמות מורכבות יכול לשבש את מבנה הרקמה, ליצור כתמים ברקע גבוה או להפחית נוגדן-אפירופה אינטראקציות, וכתוצאה מכך מכתים חפצים והסוגר וטעה של נתוני IHC4. כמו הרשתית בעלי החוליות הוא איבר עצבי מורכב ומאורגן מאוד מורכב משכבות של פוטוטורקטורים מחוברים, הביננוירונים ותאים גנגליון, זה שברירי מאוד ניתן לשבש בקלות במהלך הניתוח והפריית. פרוטוקול מפורט, מתוקננת, ומאומת מפני הפחתת עין העכבר והתמצאות לכתמים מסייעים להפחית באופן משמעותי את הממצאים של IHC, ובכך להגדיל את האמינות של התוצאות ולאפשר נתונים השוואתיים יותר מדויקים ניתוח.

ישנם פרוטוקולים רבים עבור הכנת רקמות עבור IHC, עם זאת, לא כל מתאים לרקמות רשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר את המבנה הרשתית במהלך הניתוח והאפשרות5. למרבה הצער, תיקונים חזקים מובילים לעיתים קרובות לאור הזריחה המשופרת והמסיכה כתוצאה משינוי כימי של אפיסקופים6. מצד שני, תיקונים מתון יותר, כמו 4% פאראמפורמלדהיד (בתחתית) יכולים להקל על כמה מהחפצים האלה, אבל דורשים לעבור ניתוח קפדני והקפדה כדי לשמר את המבנה הרשתית האופטימלי. הכדורגלן חודר במהירות לרקמות, אבל מצמצמים את החלבונים מאוד לאט, ומפחיתים את הסיכון של הסוואה. מאז הדגירה התחתית זמן קצר היא קיבעון קל יחסית, רקמות לעתים קרובות דורשים קיפאון מהיר כדי לשמר אנטיגנים. חשוב להימנע היווצרות גביש הקרח במהלך הקפאת רקמות כפי שהם לעוות ולפגוע היושרה של תאים ורקמות7.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים וסטנדרטיים עבור ניתוח, קיבעון, הגנה על ההקפאה של כוסות העכבר האחורי העינית התשואה נתונים IHC עקבית ואמין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאמה קפדנית עם ההמלצות של המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה שסופקו על ידי המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש של אוניברסיטת פנסילבניה.

כל הכלים והציוד עבור השיטות מוצגים באיור 1 ומפורטים בטבלת החומרים.

1. העין העכבר enucleation, העין לנתיחה, והטבעה

  1. המתת חסד של עכברים עם פחמן דו חמצני (CO2) ואחריו עריפת ראש (עכברים לפני הלידה P0-P11) או פריקה צוואר הרחם (למבוגרים > P11 עכברים). עבור עכברים P0-P14, העיניים מכוסות בעור. הקפידו להסיר את העור לפני הצעדים הבאים.
  2. סמן את החלק הזמני של העין (איור 2 א) על ידי שריפת הקרנית מעט באמצעות הזנב צורב. הימנע בוער חור בקרנית ידי נגיעה בקרנית בקלילות מאוד וללא יותר משבריר שנייה עם הצורב.
  3. מיד עוקרים את עיני העכבר באמצעות מעוקל דומונט5/45 מלקחיים. מודרת עבור 15 דקות ב 1.5 mL שפופרת קריוצינור עם 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-פוספט מאגור מלוחים (PBS) על קרח.
  4. לאחר 15 דקות ב 4% כלגון, להעביר את העין הקבועה באמצעות מלקחיים מעוקל דומונט5/45 כדי שונה 35 מ"מ צלחת הניתוח (ראה טבלת חומרים ואיור 1c) מלא PBS ו מקום תחת מיקרוסקופ.
  5. לעשות חתך קטן על סימן הכוויה, בניצב אל וקצת מעל לימבוס (הגבול של הקרנית) באמצעות סכין מיקרו.
  6. הכנס את המספריים המעוקל לתוך החתך ולבצע חתך מעוקל של הקרנית בעקבות לימבוס (איור 2B).
  7. הסר את הקרנית ולחלץ את העדשה עם דק5 מלקחיים דומונט, (איור 2B) ולהרים אותו בעדינות הרחק מהחלק האחורי של העין. הגוף אינדקטור, ג'ל ברור הממלא את החלל בין העדשה ואת הרשתית, תצא עם העדשה (איור 2b) ואת הרשתית יהיה גלוי כמו משטח לבן המכסה את החלק הפנימי של העין האחורי של הספל. ודא כי אין נזק גלוי לעין הרשתית, כגון חורים או דמעות (איור 2C).
  8. שטוף את כוסות העיניים פעמיים ב 1 מ ל של PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הקפאה של כוסות העין על ידי השתלטות עליהם בתמיסה של 15% סוכרוז ב-PBS לילה ב-4 ° צ' עד לכיורי העיניים
  10. להעביר את כוסות העין כדי 30% סוכרוז ב-PBS עבור 2-3 h עד כיורי העין שוקעת.
  11. להטביע את כוסות העין ב OCT ב 10 x 10 מילימטר cryomolds (איור 3a). באמצעות מיקרוסקופ מבתר, כוון את העין בקריואוולד לאורך הציר הגוגולי שלה (איור 2D, איור 3a) על ידי סיבוב העין עד סימן הכוויה הוא למעלה, עצב הראייה הוא בצד שמאל, חלק לחתוך את העובש פונה ימינה ( איור 2D). שמור על עצמך להימנע בועות ליד הרקמה.
    הערה: כדי לתמרן את גביע העין, להשתמש במקדח טיטניום עשוי חוט טיטניום המצורפת לקצה הפיפטה.
  12. כדי להצמיד הקפאת רקמת הרשתית, לטבול את cryomold לפחות 5 דקות בגביע מתכת המכיל איזופנטאן ולמקם את הגביע בחנקן נוזלי או קרח יבש/100% האתנול אמבטיה (עד 1/3 של גובה גביע המתכת).
    הערה: cryomold צריך להיות שקוע איזופנטאן לגדול ממחצית הגובה שלה, אבל לא צריך להיות לגמרי שקוע.
  13. להסיר את הבלוק הקפוא לעטוף אותו רדיד אלומיניום.
  14. חנות ב-80 ° c.
  15. סמן את הבלוק הקפוא באמצעות עט או טוש כדי להקליט את כיוון הבלוק (איור 3B).

2. בנייה באמצעות קריוסטט

  1. לאחר התאמת טמפרטורת הקריוסטט (בין-20 ל-25 ° c), אפשר את התבניות המכילות את כוסות העיניים המוטבעות כדי להתאים את טמפרטורת הקריוסטט ל-1 h.
  2. התקן את הבלוק עם כיוון dorso-ventral (איור 3c) ולחתוך 10 יקרומטר מקטעים סידוריים עבים. מניחים בזהירות את החלקים הרשתית על שקופיות המיקרוסקופ ממוספרים.
  3. אחסן שקופיות בתיבות שקופיות ב-20 ° צ' או-80 ° צ' עד להליכי IHC.

3. כתמים פלואורסצנטית באמצעות מתלה השקופיות

הערה: מערכת לארון תקשורת שקופית (למשל, סקונצה) מחזיקה את שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית עם צלחת כיסוי, יצירת פער הנימים ~ 100 μL בין השקופית לצלחת.

  1. להפשיר את מקטעי ההקפאה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h כדי 4 h כדי לאפשר להם להתייבש ולצרף לשקופיות מיקרוסקופ.
    הערה: ניתן גם לייבש אותם ב 30-37 ° c עבור 30 דקות עד 1 h.
  2. מקם שקופיות בארון תקשורת של השקופיות ושטוף את מקטעי הרשתית פעמיים ב-100-200 μL PBS עבור 2 דקות.
  3. החדירות סעיפים ברשתית על ידי מודטת אותם ב 0.25% טריטון-X/0.05% נאן3ב PBS עבור 5 דקות ב-RT.
  4. הוסף 100 μL של חסימת פתרון לשקופיות.
  5. הוסף 100 μL של הנוגדן העיקרי מדולל בפתרון חסימת לשקופיות.
  6. מודריטה סעיפים רשתית לילה ב 4 ° c.
    הערה: במהלך זמן זה, כסה את מתלה השקופיות כדי למנוע התייבשות של המקטעים.
  7. לשטוף את מקטעי הרשתית 3 פעמים, כל אחד עבור 15 דקות, באמצעות 200 μL PBS.
    הערה: התוספת של 0.001-0.002% טריטון-X100 כדי PBS (PBS-T) לאפשר שטיפה מחמירה יותר, אבל יכול לשבש כמה קרומים ומבנים סלולריים.
  8. דגירה סעיפים הרשתית בנוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט עבור 1 h ב RT. . מעתה והלאה, הגן מפני האור
  9. שטוף את מקטעי הרשתית 3 פעמים, כל אחד עבור 15 דקות.
  10. מודאת סעיפים ברשתית ב RT עבור 5 דקות עם סמן גרעיני כגון Hoechst 33342 או פתרון DAPI.
  11. לשטוף את סעיפים הרשתית 1 פעם עבור 15 דקות.
  12. הניחו שמיכות על גבי מגבת נייר על ספסל המעבדה.
  13. הוסף 2 טיפות של המדיה הרכבה אנטי נמוגה למרכז הכיסויים.
  14. הפוך את השקופית כדי שמקטע ההקפאה הרשתית פונה כלפי מטה.
  15. הבהר בזהירות את הכיסויים, בזווית של ~ 45 °, הקצה את השקופית אל המדיה הנכנסת.
    הערה: הימנעות מיצירת בועות בעת הורדת השקופית במקומה.
  16. החלת לחץ אפילו, באמצעות ספר או קטלוג כבדים (ראה להלן), לשילוב שקופית-שקופיות כדי למנוע הרכבה מדיה עודפת.
    הערה: כדי להבטיח עקביות בהכנה לדוגמה, השתמש תמיד באותו אובייקט, (כלומר, אותו ספר או קטלוג) כדי להחיל לחץ אפילו על הכיסויים במהלך הרכבת השקופיות.
  17. שמרו על שטוח והניחו את הלילה בחושך בחשיכה. אחסן מגלשות שטוחות ב -4 ° c ללא הגבלת זמן.
  18. תמונה באמצעות שדה רחב או המיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להמחיש כיצד פרוטוקולים אלה, להבטיח שימור הרשתית אופטימלית עבור ihc, אנו בדקו מקטעים ברשתית מ P28 WT עכברים (C57BL/6n) עם נוגדנים לרודוסין (הסמן תא קולט אור)8, גלוטמית חומצה decarboxylase 65 (Gad65, תא אמקרין marker)9, גלוטמין הבורסה (GS, מסמן תא מולר)10, ו calbindin (סמן תא אופקי)11 (איור 4). IHC מציינים כי הפרוטוקולים שלנו להניב בעקביות באיכות גבוהה ומשומרים ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לנתיחה הרשתית של העכבר הוא תהליך עדין בשל גודל קטן וצורה של עיניים העכבר ושבריאת הרקמות הרשתית. למרות ביצוע הניתוח באיכות גבוהה הוא עניין של תרגול, בעל פרוטוקול מפורט, מתן שיטות יעילות וטיפים הוא הכרח להשיג חלקים ברשתית ו-IHC. בנוסף לפרוטוקולים המתוארים כאן, קיימים מספר טיפים המאפשרים למקטעי רשתית באיכות גבוהה ועקבית המתאימים ל-IHC.

לפני תחילת הניתוח, חשוב להיות נוח, רגוע ולהגדיר את תאורת החדר לראייה אופטימלית במהלך ניתוח מיקרו העכבר עין. כדי לשמור על צורת העיניים של העכבר בזמן מבתר את העין, א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין הגילויים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מ-NIH (RO1-GMO97327) והקרן לחקר האוניברסיטה (UPenn). אנו מודים במיוחד לסווטלנה סאוינה על עזרתה בפיתוח פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה, גורדון רותל (אונ' פנסילבניה) וליבת ההדמיה של פן וטרינר לסיוע במיקרוסקופיה ולסלי קינג, Ph.D. לקריאה קריטית של כתב היד .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6qt. נירוסטה (185 x 218 מ"מ)גילסון #MA-48לחנקן נוזלי (איור 1E)
רדיד אלומיניום 
צריבה  Bovie#AA01לסימון כיוון העין (איור 1A)
מלקחיים מעוקלים, פינצטה Dumont #5/45, כפוף 45 מעלות מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית#72703-Dלהוצאה ותחזוקה של עין העכבר (איור 1A)
מספריים מעוקלים, מספריים קפיציים של Vannas - קצה חיתוך 2.5 מ"מ כלים מדעיים #15002-08לחיתוך היקפי של הקרנית (איור 1B)
דיסקציה מצופה שעווה 35 מ"מלדיסקציה של העין (איור 1C)
מיקרוסקופ חיתוך לייקה, יוסטון, ארה"ב MZ12.5 מיקרו סכיני מיקרו סטריאומיקרוסקופ
גבוהים - ידית פלסטיק כלים מדעיים #10315-12לבצע חתך קטן בסימן הכוויה (איור 1A)
שעווה דנטלית ורודה מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית #72660לציפוי צלחת חיתוך
מתלה שקופיות וכיסויטד פלה#36107ל-IHC רשתית (איור 1G)
נירוסטה (89 x 114 מ"מ)גילסון #MA-40לאמבט איזופנטן (איור 1E)
קופסתלצידנית מבודדת
מלקחיים דקים Dumont #5   כלים מדעיים #11254-20כדי להסיר את הקרנית ולחלץ את העדשה (איור 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ)מדעי מיסקרוסקופיה אלקטרונית #62534-10עובש להטמעת OCT
<חזק>בופרים וריאגנטים<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
תמיסת2% סרום סוס רגיל, 1.5% ג'לטין עור דג קר (ב-40-50% ב-H2O, חתול #G7765), 5% אלבומין בסרום בקר (חתול #AK1391-0100) במאגר פרמיביליזציה.   
Gelvatol (אמצעי הרכבה נגד דהייה)מתחת למכסה האדים, ממיסים 0.337 גרם DABCO (Sigma cat #D2522-25G) ב-10 מ"ל Fluoromount G (חתול פישר #OB100-01).  התאימו ל-pH 8-8.5 עם 12N HCl (~ 5 טיפות).  יש לאחסן בבקבוק טיפה ענבר בטמפרטורה של 4&00 מעלות; C  (8). 
Hoechst 33342 1000x מלאיThermo Scientific#622491 מ"ג/מ"ל ב-PBS (פי 1000). Aliquot ואחסן בחושך, ב-4° C עד שנה או ב-20° C לאחסון לטווח ארוך. הכן טרי  ב-1 ug/mL (1x) 
איזופנטן, 99% GFS כימיקלים#2961
חנקן
נוזלי פרפורמלדהיד (PFA) במדעימיקרוסקופיה אלקטרונית PBS #15710מוכן טרי 4% PFA מ-16% מלאי PFA. אחסן את 16% ה-PFA הנותרים ב-4° C בחושך. 
פרמיביליזציהPBS + 0.25% טריטון-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  הכן טרי.
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Bioworld #41620015-200.02 גרם/ליטר KCl, 0.02 גרם/ליטר KH2PO4, 0.8 גרם/ליטר NaCl, 0.216 גרם/ליטר Na2HPO4, pH 7.4.  מוכן ממלאי 10x 
פתרונות סוכרוזפישר סיינטיפיק   #S-5-500יש להמיס את הכמות המתאימה של סוכרוז ב-37&00 מעלות; C PBS (לוקח ~15 דקות להתמוסס). ניתן לאחסן מספר ימים בטמפרטורה של 4&מעלות צלזיוס.
תרכובת OCT של Tissue-Tek Sakura #4583
נוגדניםCompanyCatalog NumberComments
anti-calbindinSigma-AldrichC8666לתיוג תאים הורינזוטליים 
anti-GAD65ChemiconAB5082לתיוג תאי אמקרין GABAergic
נגדGS BD Transduction610517לתייג Mü תאי ller
אנטי רודופסיןMilliporeMAB5316לתיוג מוטות
צלחת בעלי ביצועים קלקר חסימה תמיסת

מקורות

  1. Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
  2. Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
  3. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  4. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
  5. Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113(1945).
  6. Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).
  7. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
  8. Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
  9. Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
  10. Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).
  11. Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
  12. Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

OCT
הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.