מאמר שיטה

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

DOI:

10.3791/59695

⸱

21 במאי 2019

 ,  , 
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נועד ביעילות לכמת אוביקוויב-פרוטאסדום מערכת (UPS) פעילות בתאים סלולריים שונים של המוח מכרסם. משתמשים יכולים לבחון את התפקוד UPS בתוך שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית באותו בעל חיים, הפחתת כמות הזמן ומספר בעלי החיים הדרושים כדי לבצע ניתוחים אלה מורכבים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין היא מווסת מפתח של השפלה חלבון ומגוון של תהליכים סלולריים אחרים eukaryotes. במוח, מגביר את הפעילות אוביקוויב-פרוטאספראט הם קריטיים לפלסטיות הסינפטית והיווצרות הזיכרון והשינויים החריגה במערכת זו משויכים למגוון של הפרעות נוירולוגיות, ניווניות ופסיכיאטריות. אחד הנושאים ללמוד אוביקוויב-פרוטאסאט התפקוד במוח הוא שהוא קיים בכל התאים הסלולריים, שבו מטרות החלבון, התפקיד הפונקציונלי ומנגנונים של רגולציה יכול להשתנות באופן נרחב. כתוצאה מכך, היכולת להשוות במישרין את המוח אוביקוויב חלבון מיקוד ופעילות מיקרוביאלית בתאי משנה שונים בתוך אותה חיה היא קריטית להבנה מלאה כיצד UPS תורמת לפלסטיות הסינפטית, זיכרון ומחלות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת איסוף של גרעיני, cytoplasmic ושברים סינפטית גולמיים מן מכרסם אותו (עכברוש) המוח, ואחריו כימות בו של פעילות מיקרוביאלית של הפרוטאסאט (בעקיפין, מתן פעילות של הליבה פרוטאסדום בלבד) ותיוג חלבונים אוביקוויב ספציפי לקישור. כך, ניתן להשתמש בשיטה כדי להשוות ישירות שינויים משניים בפעילות אוביקוויב-פרוטאסאין באזורי מוח שונים באותה חיה במהלך הפלסטיות הסינפטית, היווצרות הזיכרון ומצבי מחלה שונים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך את ההתפלגות והתפקוד התת-תאית של חלבונים אחרים בתוך אותה חיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין (UPS) היא רשת מורכבת של מבני חלבון מחוברים וליגסים השולטים בהשפלה של רוב החלבונים הקצרי-החיים בתאים1. במערכת זו, חלבונים מסומנים עבור השפלה או תהליכים סלולריים אחרים/גורלות על ידי משנה קטן אוביקוויב. חלבון היעד יכול לרכוש 1-7 אוביקוויב שינויים, אשר יכול לקשר יחד באחד 7 ליזין (K) אתרים (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ו-K63) או מתיונין N-טרמינל (M1; הידוע בשם ליניארי) ב אוביקווילין הקודם2. חלק מתגי polyubiquitin אלה הם ספציפיים להשפלה (K48)3, בעוד אחרים הם עצמאיים במידה רבה של תהליך השפלה חלבון (M1)4,5,6. כך, תהליך החלבון אוביקווינציה מורכב מאוד ואת היכולת לכמת שינויים תג polyubiquitin מסוים הוא קריטי בסופו של דבר להבין את התפקיד של שינוי נתון בתפקוד הסלולר. עוד מסבך את המחקר של מערכת זו, פרוטאסדום, שהוא מבנה קטליטי של UPS7, שניהם מואפים חלבונים אבל יכול גם להיות מעורב בתהליכים אחרים שאינם נגד הפרוטחרדה8,9. לא באופן מפתיע אז, מאז התגלית הראשונית שלה, הפעילות הרגילה אוביקוויב-פרוטאסאין מעורבים היווצרות זיכרון ארוך טווח ומגוון של מצבי מחלה, כולל הרבה נוירולוגי, נוירוניווניות ופסיכיאטרי הפרעות10,11. כתוצאה מכך, שיטות שיכולות ביעילות וביעילות לכמת UPS פעילות במוח הם קריטיים להבנת בסופו של דבר כיצד מערכת זו אינה מוסדרת במצבי מחלה ופיתוח בסופו של דבר אפשרויות טיפול מיקוד אוביקוויב ו/או . התפקוד הפרוטאלי

ישנם מספר סוגיות בתחום הפעילות אוביקוויטים-פרוטאסאין ברקמת המוח מחולדות ועכברים, שהם מערכות המודל הנפוצות ביותר המשמשות לחקר הפונקציה UPS, כולל 1) המגוון של אוביקוויטים שינויים, ו 2) הפצה ו הוויסות הדיפרנציאלי של UPS מתפקד על פני תאים תת-סלולריים12,13,14. למשל, רבים של ההפגנות המוקדמות של הפונקציה אוביקוויב-פרוטאסאט במוח במהלך היווצרות הזיכרון השתמשו לוחות תא שלם והצביעו עליות הזמן התלויות הן אוביקוויציה חלבונים ופעילות פרוטסאין15, מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , 20. עם זאת, מצאנו לאחרונה כי פעילות אוביקוויב-פרוטאסאין מגוונת באופן נרחב על פני תאים subcellular בתגובה ללמידה, עם עליות בו באזורים מסוימים ופוחתת באחרים, דפוס שונה באופן משמעותי ממה שדווח בעבר בתא שלם21. זה תואם את המגבלה של גישה שלמה התא, כפי שהוא אינו יכול לנתק את התרומה של שינויים בפעילות ה-UPS על פני תאים משניים שונים. למרות מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו בפרוטוקולים השבר הסינפטית כדי לחקור את UPS במיוחד על הסינפסות בתגובה ללמידה22,23,24, השיטות בשימוש סגר את היכולת למדוד . שינויים באותה החיה התוצאה היא צורך מיותר לחזור על ניסויים מספר פעמים, איסוף שבר שונה הסלולר בכל אחד. לא רק תוצאה זו היא הפסד גדול יותר של חיי בעלי חיים, אבל זה מבטל את היכולת להשוות במישרין את פעילות ה-UPS על פני תאים תת תאיים שונים בתגובה לאירוע נתון או במהלך מצב מחלה מסוים. בהתחשב בכך מטרות החלבון של אוביקוויב ו-פרוטאסאט משתנים באופן נרחב ברחבי התא, הבנה כיצד אוביקוויב-פרוטאסאט איתות שונה בתאי subcellular נפרדים הוא קריטי לזיהוי התפקיד הפונקציונלי של ה-UPS ב מוח בזמן היווצרות הזיכרון והפרעות נוירולוגיות, ניווניות ופסיכיאטריות.

כדי לטפל בצורך זה, פיתחנו לאחרונה הליך שבו ניתן היה לאסוף שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית עבור אזור מוחי נתון מאותה חיה21. בנוסף, כדי להסביר את כמות החלבון המוגבלת שניתן להשיג מאיסוף שברים תת-תאיים מרובים מאותה דוגמית, אנו ממוטבים פרוטוקולים שהוקמו בעבר לצורך שיטת הפעולה של מחוץ לפעילות והצמדה בתאי חלבון שנאספו מרקמת מוח מכרסמים. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לאסוף ולהשוות ישירות שינויים תלויי למידה בפעילות פרוטאספראט, K48, K63, M1 והכולל חלבון polyubiquitination רמות בגרעין הציטופלסמה ו ב הסינפסות באמיגדלה לרוחב של חולדות. כאן, אנו מתארים בפירוט ההליך שלנו (איור 1), אשר יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה שלנו כיצד UPS מעורב ביצירת זיכרון ארוך טווח ומצבים מחלות שונות. עם זאת, יש לציין כי בפעילות החוץ בלתי מתורבת הנדונה בפרוטוקול שלנו, תוך שימוש נרחב, לא ישירות למדוד את הפעילות של השלם מתחמים 26 של המלא. ליתר דיוק, שיטת הפעולה הזו מודדת את הפעילות של הליבה של 20, כלומר היא יכולה לשמש רק כפרוקסי כדי להבין את הפעילות של הליבה עצמה בניגוד למכלול כולו 26 של מורכבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים, כולל נושאי בעלי חיים אושרו על ידי המכון הפוליטכני של וירג והמדינה אוניברסיטת מוסדיים טיפול בעלי חיים והשתמש הוועדה (IACUC).

1. איסוף וחיתוך של רקמת המוח מכרסם

הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של מוחות המוח בשימוש עם הליכים שונים אוסף הרקמה. להלן ההליך המשמש במעבדה שלנו עבור תת הסלולר של רקמת המוח חולדה, באמצעות שבוע 8-9 הזקן הגברי של הגברים ספראג. על מנת לעבד את כל התאים הסלולריים באותה חיה, סעיף 1.3. חייב להיות בעקבותיו ללא קשר לתהליך איסוף רקמה בשימוש.

  1. לחלץ את מוח העכברוש ומקום לתוך ספל קריוגני מראש על קרח יבש. הקפא את המוח על קרח יבש, או השתמש בחנקן נוזלי אם הוא זמין, והעבר ל-80 מקפיא ° c. אפשר לגזור את המוח באותו. היום או במועד מאוחר יותר
  2. להסיר את המוח הקפוא מן הספל הקריוגני ומקום לתוך מטריצה המוח חולדה מקורר עם קרח יבש. כל חריץ במטריצה מקביל ל-0.5 מ"מ, שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את המיקום המשוער של אזור הריבית (ROI).
    1. באמצעות עכברוש מוח אטלס, להכניס סכין גילוח לתוך המטריצה מיד מול (קדמי) של ההתחלה החזוי של ROI. לאחר מכן, הכנס סכין גילוח מיד בקצה החזוי (אחורי) של ROI.
    2. להסיר את הפרוסה בין סכיני גילוח באמצעות אזמל ומקום על שקופית מיקרוסקופ מקורר על קרח יבש. בדרך כלל, סעיפים הם 2-3 מ"מ עבה אך זה משתנה בהתאם ל-ROI.
  3. משתמש באזמל, מנתח את ההחזר. של כל חצי-הכדור בכל פעם מניחים כל האונה לתוך שונים 1.5 mL צינורות מיקרוצנטריפוגה לפני מקורר על קרח יבש. ניתן להשתמש ברקמה קפואה באופן מיידי עבור משבר הסלולר או מעובד במועד מאוחר יותר אם מאוחסן ב-80 ° c.

2. הוצאת גרעיני וcytoplasmic

הערה: פרוטוקול זה משתמש בפתרונות מלאי מראש של כימיקלים מעבדה משותפים, כולל 0.1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 m Dithioitol (dtt), 0.5 M אתיליאדידהחומצה (edta), 5 m הנאל, 10% NP-40 (IGEPAL) ו 50% גליצרול. אם נקודת הקצה נעשה שימוש asasome פעילות מוסר, גליצרול ו-ATP ניתן להוסיף לכל המאגרים כדי לסייע למנוע פירוק של מכלולי פרוטאסדום במהלך הליזה.

  1. הכינו את מאגר הליזה. הוסף 8.63 mL של מים באולטרה-סאונד (מזוקקים ומזוקק) לצינור מעוקר של 15 מ"ל.
    1. לצינור החרוט, להוסיף 1,000 μL של 0.1 M HEPES, 15 μL של 1 M MgCl, 100 μL של 1 M DTT ו 50 μL של 10% NP-40.
    2. הוסף 100 μL של קוקטייל פרוטאז מעכבי ו 100 μL של קוקטייל מעכב פוספספטאז. בקצרה מערבולת הפתרון כדי לערבב ולמקם על קרח רטוב להתקרר. שים לב כי הפתרון עשוי להיות צבע צהוב מעכב פוספספטאז.
      הערה: השימוש במעכבי הפרוטאז חיוני כדי לשמר את החלבון ולהבטיח את הספציפיות של הפעילות של מחוץ לגופית בתוך מבחנה. עם זאת, מעכבי אלה עשויים גם לגרום לירידה קלה בפעילות פרוטאסדום, כלומר הפעילות הנמדדת על שיטת החוץ הגופית עשוי להיות בלתי מזלזל של רמות הפעילות בפועל.
  2. . הכן את מאגר החילוץ הוסף 5.925 mL של מים באולטרה-סאונד (מזוקקים ומזוקק) לצינור מעוקר של 15 מ"ל.
    1. לצינור החרוט, להוסיף 2,000 μL של 0.1 M HEPES, 1250 μL של 50% גליצרול, 15 μL של 1 M MgCl2, 5 μl של 1 m dtt, 5 μl של 0.5 m edta ו 600 μl של 5 m הנאל.
    2. הוסף 100 μL של קוקטייל פרוטאז מעכבי ו 100 μL של קוקטייל מעכב פוספספטאז. בקצרה מערבולת הפתרון כדי לערבב ולמקם על קרח רטוב להתקרר. שים לב כי הפתרון עשוי להיות צבע צהוב מעכב פוספספטאז.
  3. להסיר את 1.5 mL צנטריפוגה מיקרוצינורית המכילה את האונה האחת של התשואה מ-80 ° c מקפיא. ודא שהאונה שבשימוש מאוזנת בתנאי החילוץ בכל קבוצה ניסיונית. לדוגמה, בניסוי של שתי קבוצות, השתמש באונה השמאלית של שתי החיות הראשונות בכל קבוצה ובאונה הימנית של שתי הדגימות הבאות, וכו '.
  4. באמצעות אזמל, להעביר את רקמת המוח קפוא ל 2 מ ל טפלון זכוכית ההומובית. הוסף 500 μL של מאגר ליזה לצינור טפלון.
    1. באמצעות כתש B, המגון לסדר את הרקמה באמצעות 15 משיכות עד שלא ניתן לראות כמות מוצקה של חומר מוצק. השתמש בתנועה מפנה (בכיוון השעון או נגד כיוון השעון) במהלך כל שבץ.
  5. באמצעות הפיפטה 1,000 μL, העבר את דגימת המגון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL. מניחים את הצינור על קרח רטוב ו דגירה עבור 30 דקות.
  6. מניחים צינור במיקרוצנטריפוגה ו ספין עבור 10 דקות ב 845 x ו 4 ° c. לאחר סיום, להסיר בזהירות את supernatant על ידי ליטוף ומקום לתוך צינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה; זהו שבר Cytoplasmic, אשר ניתן לאחסן בקרח או בשעה 4 ° צ' עד סעיף 2.9.
  7. הוסף 50 μL של מאגר החילוץ לגלולה המתקבלת ולהשעות מחדש על ידי ליטוף. . אל תעשה מערבולת על הגלולה מניחים את הצינור המכיל את הגלולה מחדש על הקרח ו דגירה עבור 30 דקות.
  8. מניחים את הצינור ב microcentrifuge ו ספין עבור 20 דקות ב 21,456 x g, 4 ° c. לאחר סיום, להסיר בזהירות את supernatant על ידי ליטוף ומקום לתוך צינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה; . זה השבר הגרעיני הגלולה יכולה עכשיו להיות מושלך.
  9. מדידת ריכוז החלבון של Cytoplasmic ואת החילוץ הגרעיני באמצעות שיטת חלבון Dc (על פי הוראות היצרן), או כל שווי שווה לדגימות שנאספו באמצעות חומרי ניקוי לא יוניים. המשך באופן מיידי לתוך שיטת הפעילות הפרוטסטנטית (סעיף 4) או הכתמים המערביים (סעיף 5). לחילופין, ניתן לאחסן דגימות ב-80 ° צ' עד לצורך.

3. אוסף של שבר סינפטית

הערה: פרוטוקול זה משתמש בפתרונות מלאי שנעשו מראש של כימיקלים מעבדה נפוצים, כולל 1 M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA, 5 M הנאקל ו 10% SDS. אם נקודת הקצה משמש asasome פעילות מוסר, גליצרול ו-ATP ניתן להוסיף לכל המאגרים כדי לסייע במניעת פירוק של מכלולי פרוטאסיום במהלך הליזה

  1. הכן את מאגר ה-TEVP עם סוכרוז 320 מ"מ. הוסף 60 mL של מים באולטרטהור (מזוקק ומזוקקים) לגביע נקי 100 mL.
    1. אל הגביע, להוסיף 1,300 μL של 1 M טריס (pH 7.5), 260 μL של 0.5 M EDTA, 100 μL של קוקטייל פרוטאז מעכבי, 100 μL של קוקטייל מעכבי פוספספטאז ו-10 גרם של סוכרוז. ערבבו עם בר מהומה עד שסוכרוז התפרקה לחלוטין.
    2. הביאי ל-pH ~ 7.4 על ידי הוספת חומצה הידרוכלורית (HCl) dropwise לפתרון באמצעות פיפטה.
    3. העבר את הפתרון לבקבוקון נפחי 100 mL. הביאו נפח ל 100 mL על ידי הוספת מים באולטרטהורים. לצנן את הפתרון הסופי על הקרח עד הצורך.
  2. . הכן את מאגר המגון הוסף 60 mL של מים באולטרטהור (מזוקק ומזוקקים) לגביע נקי 100 mL.
    1. אל הגביע, להוסיף 5,000 μL של 1 מ ' טריס (pH 7.5), 3,000 μL של 5 M הנאל, 100 μL של קוקטייל מעכב פרוטאז, 100 μL של קוקטייל מעכבי פוספאטאז ו 2,000 μL של 10% SDS. מערבבים עם בר מהומה.
      הערה: חומרי ניקוי יוניים יכולים להפריע לפעילות פרוטאסדום מוסר על ידי התוצאה של הרפתקאות המתחם פרוטאסדום. הנפח של SDS יכול להיות הוריד כדי לסייע לשמר את הפונקציה פרוטאסדום אם תרצה.
    2. להביא את ה-pH כדי ~ 7.4 על ידי הוספת הדראט HCl לפתרון באמצעות פיפטה.
    3. העבר את הפתרון לבקבוקון נפחי 100 mL. הביאו את עוצמת הקול ל 100 mL על ידי הוספת מים באולטרטהורים. אחסן את הפתרון הסופי בטמפרטורת החדר; לא להתקרר כמו SDS יהיה לזרז את הפתרון.
  3. הסר את הצנטריפוגה 1.5 mL המכילה את האונה האחת של התשואה מ-80 ° c מקפיא. ודא שהאונה שבשימוש מאוזנת בתנאי החילוץ בכל קבוצה ניסיונית. לדוגמה, בניסוי של שתי קבוצות, השתמש באונה השמאלית של שתי החיות הראשונות בכל קבוצה ובאונה הימנית של שתי הדגימות הבאות, וכו '.
  4. באמצעות אזמל, להעביר את רקמת המוח קפוא ל 2 מ ל טפלון זכוכית ההומובית. הוסף 500 μL של TEVP מאגר לצינור טפלון.
    1. באמצעות כתש B, המגון לשאת את הרקמה באמצעות 15 משיכות עד שלא ניתן לראות העברות של חומר מוצק. השתמש בתנועה מפנה (בכיוון השעון או נגד כיוון השעון) במהלך כל שבץ.
  5. באמצעות הפיפטה 1,000 μL, העבר את דגימת המגון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL. צנטריפוגה את המדגם ב 1,000 x g עבור 10 דקות, 4 ° c.
  6. לאסוף את supernatant ולהעביר לצינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה באמצעות ה1,000 μL הצינורות. צנטריפוגה את המדגם ב 10,000 x g עבור 10 דקות, 4 ° c. הגלולה המקורית (P1) מכילה גרעינים ופסולת גדולה ניתן להיפטר.
  7. העבר את הסופרנטאנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש 1.5 mL. . זה שבר ציטוסולסי הוסף 50 μL של מאגר המגון אל הגלולה (P2) והשהה מחדש באמצעות ליטוף עד שלא יוצג חומר מוצק.
  8. צנטריפוגה את המדגם ב 20,000 x g עבור 10 דקות, 4 ° c. העבר את הסופרנטאנט לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה 1.5 mL; זהו קרום Synaptosomal גסה (סינפטית) שבר. . הגלולה יכולה להיות מושלך
  9. למדוד את ריכוז החלבון של שבר סינפטית באמצעות שיטת החלבון Dc (על פי הוראות היצרן), או כל שווי שווה לדגימות שנאספו באמצעות חומרי ניקוי יוניים. המשך באופן מיידי לתוך שיטת הפעילות הפרוטסטנטית (סעיף 4) או הכתמים המערביים (סעיף 5). לחילופין, ניתן לאחסן דגימות ב-80 ° צ' עד לצורך.

4. שיטת הפעילות הפרוטאספלי

הערה: פעילות proteasome ניתן למדוד ברקמת המוח הומוגניים באמצעות גרסה שונה מעט של ערכת פעילות Proteasome 20 s. שיטת הפעולה אינה מודדת באופן ישיר את הפעילות של מתחמים מלאים של 26 שנות המשך. ליתר דיוק, זה מודד את הפעילות של הליבה של 20, כלומר זה יכול לשמש רק פרוקסי כדי להבין את הפעילות של הליבה עצמה בניגוד למכלול 26 s פרוטאסדום. הצלחת ההתמדה הזאת יורדת עם מחזורי הקפאת ההקפאה חוזרים ו/או הגדלת רמות חומרי הניקוי, במיוחד יונית, ודורשת שימוש בקורא לוחית עם מסנני מסננים 360/460 (עירור/פליטה) ויכולות הסקה של עד 37 ° c.

  1. הגדרות קורא הצלחות: לפני שתחמם עד 37 ° c והחזק את הריצה.
    1. הגדר עירור על 360 ו פליטה כדי 460. אם 96 צלחת הבאר בשימוש ברור, להגדיר את מיקום האופטיקה למטה. אם משתמשים בצלחת הבאר 96 כהה/שחור, להגדיר מיקום אופטיקה למעלה.
    2. הגדר מודלים של קורא צלחות בוגרים לרווח אוטומטי תחת אפשרויות קריאת הפלורסנט; דגמים חדשים יותר מוגדרים מראש עבור זה. תוכנית קינטי לרוץ עם זמן של 2 h, סריקה (קריאה) כל 30 דקות.
  2. מהווים מחדש את מאגר הספק 10x המסופק בערכה עם 13.5 mL של מים אלקטרופורזה. הוסף 14 μL של 100 mM ATP למאגר עכשיו 1x; הדבר מגביר באופן משמעותי את הפעילות בדגימות ומשפר את אמינות היכולת. ניתן לאחסן את המאגר הסופי של 20 שבועות בקרח או בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך והוא יציב למשך מספר חודשים.
  3. מרכיבים מחדש את תקן AMC המסופק בערכה עם 100 μL של DMSO. בצע שלב זה בחשיכה או בתנאי תאורה חלשה, כאשר התקן רגיש לאור.
  4. צור עקומת מעמד של AMC באמצעות תקן מחדש, בחושך או בתנאי תאורה נמוכה.
    1. בנפרד 0.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות, להוסיף 16, 8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 ו -0 μL של תקן AMC, אשר מתאים 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0.5 ו -0 μM AMC הריכוז.
    2. לצינורות אלה, באותו סדר, להוסיף 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 ו-100 μL של מאגר שינוי בשנות ה -20. זה יוצר סדרה של ריכוז גבוה עד נמוך AMC, אשר ישמשו עבור כיול קורא לוחית ניתוח של פעילות פרוטאסדום בדגימות הומוגניים.
    3. אחסן את כל התקנים מדולל על קרח בחשכה עד הצורך.
  5. מהווים מחדש את המצע פרוטאסאט (Suc-LLVY-AMC) סיפק בערכה עם 65 μL של DMSO. בצע שלב זה בחושך או בתנאי תאורה נמוכה, כמו המצע הוא רגיש באור. צור 1:20 דילול של המצע פרוטאסדום ב חדש 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה באמצעות מאגר שימוש 20 s. אחסן את המצע מדולל על קרח בחשכה עד הצורך.
    הערה: לדוגמה, אם הצלחת יהיו 10 דגימות ו 1 ריק, תצטרך המצע מדולל מספיק עבור 22 בארות (עם כפילויות) ב 10 μL לכל טוב. זה משווה ל 220 μL צריך + 30 μL עבור שגיאות ליטוף, דרישת 12.5 μL של מצע ו 237.5 μL של מאגר שימוש בשנות ה -20.
  6. הפשרת דגימות רצויות (אם קפואות) והוסף סכום מנורמל ל-96 צלחת טובה. הפעל כל דוגמה בכפילויות. כמות המדגם הדרוש משתנה על בסיס הכנת רקמות. באופן כללי, 10-20 μg מספיקה עבור כל שבר הסלולר.
  7. הביאו את נפח הדגימה היטב ל-80 μL עם מים באולטרטהורים. הסכום שנוסף תלוי בעוצמת הדגימה שנוספה. לדוגמה, אם מדגם 1 היה 4.5 μL של חלבון ומדגם 2 היה 8.7 μL, אז כמות המים הדרושים יהיה 75.5 μL ו 71.3 μL, בהתאמה. בשתי בארות נפרדות, להוסיף 80 μL של מים בלבד; אלה יהיו התאים הריקים.
    הערה: כדי להגביל את השינויים בנפח החלבון עקב שגיאות מצטברות, ריכוזי חלבונים יכולים להיות מנורמל למדגם הפחות מרוכז. פעולה זו תאפשר שימוש באותו נפח דגימה בכל התנאים.
  8. הוסף 10 μL של מאגר שיטת המשך 20S לכל היותר, כולל שיטת ' כדורי סרק '. מומלץ להגיע לכאן כדי להבטיח נפח שינון עקבי לאורך הבארות.
  9. אופציונלי: בשלב זה, הציגו מניפולציות חוץ גופית אם תרצו; הדבר ידרוש שכל דגימה תהיה בעלת 2 בארות נוספות לכל טיפול, כולל הרכב. אם כן, להוסיף 5-10 μL של סמים/תרכובת של עניין 2 של בארות לדוגמה וכמות שווה ערך של שליטה/רכב על 2 בארות אחרות. מניחים את הצלחת על פני הקורא לוחית מחומם מראש או לתוך חממה 37 ° c עבור 30 דקות.
  10. כבו את האורות או היכנסו לחדר חשוך. הוסף את כל 100 μL של תקני AMC מדולל לבאר חדשה; לכל תקן יהיה באר אחת.
  11. בחשכה, להוסיף 10 μL של מצע פרוטאסאט מדולל לבארות המכילים דגימה וכלי שיטת סרק, אך לא לתקן AMC. מומלץ להגיע לכאן כדי להבטיח נפח שינון עקבי לאורך הבארות.
  12. מניחים את הצלחת לתוך הקורא לוחית ולהתחיל לרוץ קינטי.
    הערה: הצלחת לא צריך להיות תחת עצבנות מתמדת במהלך לרוץ קינטי, עם זאת, המשתמש יכול לבחור אם הצורך
  13. בסופו של הפעלה קינטית, ייצוא raw 360/460 ערכי פלורסנט ל-Microsoft Excel.
    1. ממוצע יחד בארות כפולות עבור כל תקן, כל מדגם ואת שיטת הפעולה ריק עבור כל 5 סריקות. ערכי פלורסנט גולמיים צריכים להגדיל את הסריקות עבור הדגימות אך להישאר יציבים (או להקטין מעט) עבור תקנים וכדורי שינוי.
    2. קח את תקן AMC הגבוהה ביותר ממוצע וחילוק לפי הריכוז הידוע (20 μM). חלק ערך זה על-ידי הריכוז לדוגמה המשמש ביכולת לקבל ערך AMC מתוקננת. עבור כל דוגמה וממוצע של שיטת האפס, חלק לפי ערך AMC הסטנדרטי.
    3. קח את הערך הסופי הזה וחלק באמצעות הריכוז לדוגמה המשמש באותו הסדר כדי לקבל את הערך המנורמל עבור כל מדגם ושיטת הפעולה Blank. . תעשה את זה עבור כל 5 הסריקות
    4. הפחת את הערך המנורמל של הערכה הריקה מכל ערך מדגם מנורמל עבור כל 5 הסריקות.

5. קוונפיקציה של הצמדה-חלבון ספציפי אוביקווינציה

  1. כימות של תגי polyubiquitin מגוונות שברים subcellular שונים שנאספו מרקמת המוח מכרסם צריך להיעשות באמצעות מגוון של פרוטוקולים בלוק סטנדרטי מערבי בשילוב עם ייחודי, הצמדה ספציפי polyubiquitin נוגדנים.
    1. עבור הרפתקאות, לערבב את הדגימות מנורמל עם נפח שווה של מאגר לדוגמה Laemmli בתוספת עם β-mercaptoethanol לאחוז של 5% על ידי נפח, לכל הוראה של היצרן.
    2. לקוונפיקציה של כל השינויים הpolyubiquitination ושינויים מבלי להתחשב בהצמדה, השתמש בנוגדן פאן-אוביקוויב.
    3. כדי לזהות את כל polyubiquitinated חלבונים, השתמש בנוגדן אוביקוויב שאינו מגיב באמצעות משקפיים.
    4. עבור polyubiquitination ספציפי הצמדה, השתמש נוגדנים שיכולים לזהות ליזין-27, ליזין-48, ליזין-63 ו ליניארי (M1) polyubiquitination.
  2. כדי למנוע זיהום בין התפתחויות, אשר יכול לגרום חיובית שווא או להפריע הדמיה של שינוי אוביקוויב שונים, ממברנות הרצועה בין התפתחויות באמצעות 0.1 M NaOH עבור 10 דקות.
    1. לשטוף את הקרומים ב-TBS עם 0.1% יצירת רצף פעמיים עבור 10 דקות ולחסום מחדש (באמצעות כל סוכן חוסם הוא המועדף בפרוטוקול הכתם המערבי בשימוש).
    2. דגירה את הקרום עם הנוגדן המשני ולהתפתח מחדש כדי לאשר כי הקרום היה הסיר של נוגדנים הראשי והמשני כראוי.
    3. מומלץ: להתפתחות מוצלחת של נוגדנים אוביקוויב שונים ללא זיהום, השתמש פלורסנט או קרוב אינפרא אדום מערכות הדמיה. לעתים קרובות, זה יכול למנוע. הרבה מקרים בין נוגדנים
  3. כמה אוביקוויב מערבי למחוק תמונות תספק עמודות של להקות נפרדות (כגון M1) בעוד אחרים לייצר דפוס כמו כתם עם כמה קווים ברורים או לא (משותף עם K48). עבור כימות של התמונה בלוק מערבי, לצייר תיבת סביב הטור המשתרע את כל סולם התקנים המולקולריים.
    1. כוונן את התיבה למעלה (או למטה) אם הצביעת אוביקוויב מאריכה את הסולם כולו; זה נפוץ עבור ליזין-48 שינויים ומשתנה באופן נרחב על פני תאים subcellular.
    2. הפחת את הרקע, המחושב כדחיסות האופטית הממוצע של הרקע המקיף את העמודה בכל הצדדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות ההליך המתואר כאן, גרעיני, cytoplasmic ושברים סינפטית נאספו מן האמיגדלה לרוחב של המוח עכברוש (איור 1). טוהר השברים הבודדים אושרו באמצעות הכתמים המערביים, בודק עם נוגדנים נגד חלבונים שצריכים להיות מועשרים או מרוקנים את הליפוסט. בחצי הכדור הראשון שבו שבר סינפטית גולמי נאסף, דחיסות פוסט סינפטית חלבון 95 (PSD95) היה נוכח סינפטית, אבל לא גרעיני, שבר, עם רמות נמוכות יותר בציטופלסמה (איור 2A). זה עקבי עם העבודה הקודמת להפגין כי ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו להדגים שיטה יעילה לכמת שינויים בפעילות אוביקוויב-פרוטאסאט באמצעות תאים שונים subcellular באותה חיה. כיום, רוב הנסיונות למדידת שינויי הסלולר בפעילות של מערכת אוביקוויב-פרוטאסביט הוגבלה לתא אחד לכל מדגם, והתוצאה היא צורך לחזור על ניסויים. זה מוביל לעלויות משמעותיות ולאובדן חיי בעלי חיים. הפרוטוקול שלנו מקל על בעיה זו על ידי פיצול האונות, המאפשר שברים סלולריים שונים לאסוף מכל האונה של אותה חיה. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים להראות בפעם הראשונה כי באותו בעל חיים אוביקוויב-פרוטסאין פעילות באופן מכריע שינויים גרע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי כספי הפעלה מהמכללה למדעי החקלאות והחיים והמכללה למדעים ב-וירג טק. ט נתמכת על ידי תוכנית ג'ורג ' וושינגטון קארבר ב וירג טק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTAFisher15575020ספקים שונים אחרים
ערכת פעילות פרוטאזום 20SMillipore SigmaAPT280ספקים אחרים נושאים גרסאות שונות
ATPFisherFERR1441ספקים שונים אחרים
נוגדן בטא-אקטיןאיתות תאים4967Sספקים שונים אחרים
תא נוגדן בטא-טובוליןתא איתות2128Tספקים שונים אחרים BioTek
Synergy H1 קורא צלחותBioTekVATECHH1MT3ספקים אחרים נושאים גרסאות שונות
B-mercaptoethanolFisherICN19024280ספקים שונים אחרים
Clasto lactacystin b-lactoneMillipore SigmaL7035ספקים שונים
אחרים קריוגניתפישר033377Bספקים שונים אחרים
DMSODMSOD8418Varous ספקים אחרים
DTTMillipore SigmaD0632ספקים שונים אחרים
GlycerolMillipore SigmaG5516ספקים שונים אחרים
נוגדן H3Abcamab1791ספקים שונים אחרים
HEPESMillipore SigmaH3375ספקים שונים אחרים
חומצה הידרוכלוריתפישרSA48ספקים שונים אחרים
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021ספקים שונים אחרים
K48 נוגדן יוביקוויטיןAbcamab140601ספקים שונים אחרים
K63 נוגדן יוביקוויטיןAbcamab179434ספקים שונים
אחרים KClMillipore SigmaP9541שונים ספקים אחרים
מטחנת רקמות KONTESVWRKT885300-0002ספקים שונים אחרים
Laemmli מאגר דגימהBio-rad161-0737ספקים שונים אחרים
חיישני חייםשל נוגדנים יוביקוויטין ליניארייםAB-0130-0100נוגדן M1 בלבד
MgClMillipore Sigma442611ספקים שונים אחרים
מיקרוצנטריפוגהEppendorf2231000213יצרנים/דגמים שונים אחרים
myr-AIPEnzo Life SciencesBML-P212-0500נישא על ידי Millipore-Sigma
NaClMillipore SigmaS3014ספקים שונים אחרים
Odyssey Fc Imaging SystemLiCor2800-02ספקים אחרים נושאים גרסאות שונות
מעכב פוספטאזMillipore Sigma524625ספקים שונים אחרים
Precision Plus חלבון סטנדרטיBio-rad161-0373ספקים שונים אחרים
מעכב פרוטאזMillipore SigmaP8340ספקים שונים אחרים
PSD95 נוגדןאיתות תאים3450Tספקים שונים אחרים
SDSMillipore SigmaL3771ספקים שונים אחרים
נתרן הידרוקסידFisherSS255ספקים שונים אחרים
SucroseMillipore SigmaS0389ספקים שונים אחרים
TBSAlfa AesarJ62938Varous ספקים אחרים
TrisMillipore SigmaT1503ספקים שונים אחרים
Tween-20FisherBP337-100ספקים שונים אחרים
נוגדן יוביקוויטיןEnzo מדעי החייםBML-PW8810ספקים שונים אחרים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115(2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349(2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150(2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים