פרוטוקול זה מתאר את הדור של מטופלים שמקורם בחולים, וניתוח במורד הזרם כולל כימות של התפשטות, בדיקות ציטורעילות, הזרמת cy, כתמים והדמיה מיקוד, על מנת להעריך את התרופה פוטנציאל המועמדים כtherapeutics אנטינאופלסטית. פרוטוקול זה תומך ברפואה מדויקת עם זיהוי תרופות ספציפיות לכל מטופל ולשלב המחלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בפרוטוקול זה, אנו מתווה את ההליך עבור הדור של spheroids הגידול בתוך 384-היטב לתלות טיפות כדי לאפשר הקרנת תפוקה גבוהה של אנטי סרטניים therapeutics ב מיקרוסביבה ייצוגית מבחינה פיזיולוגית. אנו מתווה את היווצרות של החולה הנגזר הטיפול בתאי גזע הסרטן, כמו גם, מניפולציה של הספרואידים האלה לניתוח מעמיק לאחר טיפולי התרופה. באופן ספציפי, אנו מתארים אוסף של מורפולוגיה ספרואידית, התפשטות, יכולת הרעילות, הרעלת סמים, תאים ומידע לוקליזציה של תאים. פרוטוקול זה מתמקד באופן מעמיק בטכניקות ניתוח אשר מיושמות בקלות באמצעות פלטפורמת הירידה 384-היטב תלויה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה. בעוד אנו מדגישים את החשיבות של המודל הזה בלימודי סרטן השחלות ומחקר תאי גזע הסרטן, הפלטפורמה 384-ובכן היא קלה למחקר של סוגי סרטן אחרים ודגמי מחלות, הארכת השירות של הפלטפורמה לתחומים רבים. על-ידי שיפור המהירות של הקרנת תרופות מותאמת אישית ואיכות תוצאות ההקרנה באמצעות מיושם בקלות בתרבויות תלת-ממד של נציג מבחינה פיזיולוגית, פלטפורמה זו צפויה לסייע בפיתוח של therapeutics חדש וספציפי למטופל אסטרטגיות טיפול, ולכן יש להם השפעה קלינית רחבה.
מבוא
התמותה ברחבי העולם הקשורות לסרטן הגיעו לאגרה של 9,800,000 מקרי מוות ב 20181, הדגשת הצורך בפיתוח של therapeutics משופרת. למרבה הצער, העלות של פיתוח תרופות לסרטן גדל, עם התפתחות של תרופה אחת עולה כ 650,000,000 USD2 המציין את הצורך אסטרטגיות משופרות כדי לפתח תרופות נגד סרטן חדש. תאי גזע הסרטן (CSCs), אשר מאופיינים על ידי מוגבר הגברת העמידה3, את היכולת לחדש את העצמי, ואת היכולת זרע גידולים חדשים4 נחשבים להיות אחראים להישנות הגידול4, גרורות5, ו מספר4,6, אשר כל לתרום לקיבולת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל דגימות המטופל נאספים תחת פרוטוקול IRB מאושר של ההסכמה חולים, אשר הדגימות שלהם הם דה מזוהה לאחר הגידול debulking ומיימת אוסף.
1. הדור של Spheroids ממספרי תאים קטנים ב 384-ובכן להוריד תלויים לוחות
- הניחו את צלחת הירידה התלויה בsonicator המלאה במים מעוקרים (DI) וsonicate במשך 20 דקות.
- עם יד כדורית, להסיר את הצלחת מsonicator ולשטוף אותו עם הפעלת מים DI.
- לאפשר את הצלחת לשבת באמבטיה של 0.1% חומצה הצורות הפלורליסטית עבור 24 שעות כדי למנוע ספיחה חלבונים ודבקות ספרואיד לבארות.
- להסיר צלחות עם יד כדורית ולשטוף את שני הצדדים של הצלחת עם הפעלת מים די ביסודיות.
- להקיש במרץ או לנער את הצלחת בתוך הקבינט אב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Spheroids שנוצרו עם קווי תאים או החולה נגזר CSCs ניתן ליצור עם מגוון של מספרי תאים קטנים בתוך טיפות תלויות (איור 2A). Spheroids טופס מהימן עם כמה כמו 10 תאים לכל טוב, אשר מאפשר שימור של דגימות מטופלים נדירים. תאים בתוך spheroids אלה מוקפים בתאים אחרים 3 ממדים כפי שהם יהיו בvivo, המאפשר לאנשי קשר של תא התא הפיזיולוגי ושיעורי דיפוזיה. תאים סרטניים בתוך spheroids מתרבים גורם spheroids להתרחב בגודל לאורך זמן (איור 2B). כמו תאים אגרסיביים יותר החולים או קווי התאים לצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
384-היטב תלוי הלוח ירידה פלטפורמה עבור היווצרות 3D ספרוoid הוא כלי מיושם בקלות עבור כל ביולוגיה תא או סרטן בביולוגיה מעבדות. זו פלטפורמה פיזיולוגית מאפשר לימוד של קווי התא, כמו גם, דגימות המטופל העיקרי בתוך תרבויות תלת-ממד רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית תוך מתן אפשרות הקרנת סמים בתפוקה גבוהה. הפלטפורמה מבטיחה גם שתנאי התרבות הם מאוד מהירים ומאפשרים שליטה מדוקה על צפיפויות הציפוי, היחס בין התרבות הסלולרית, הרכיבים המתכלים והקומפוזיציה הבינונית. יתרה מזו, הפלטפורמה הפיזיולוגית הזאת מאפשרת לניסויים להיות מאוד מאפשרים לשיטות ני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו נתמכת בעיקר על ידי משרד ההגנה OCRP הקריירה המוקדמת הפרס W81XWH-13-1-0134 (GM), משרד ההגנה פרס פיילוט W81XWH-16-1-0426 (GM), משרד ההגנה החוקר יזם הפרס W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), ריבקין מרכז לסרטן השחלות וסרטן השחלות מישיגן ברית. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס P30CA046592. CMN נתמך על ידי האגודה הלאומית לחקר בוגרי קרן המדע תחת גרנט מס ' 1256260. MEB נתמכת על-ידי המחלקה לסיוע בוגר מחלקת החינוך בתחומי הצריכה הלאומית (GAANN).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% טריפסין-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 מ"ל פיפט סרולוגי | פישר סיינטיפיק | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si שמן | Millipore Sigma | 63148-62-9 | משמש לציפוי עובש מערך ספרואיד כדי להקל על הסרת ג'לים לעיבוד רקמות, כמו היסטוג'ל, מהתבנית. |
| צלחת תרבית רקמות 100 מ"מ | Thermo Scientific | 130182 | |
| צינור חרוטי 15 מ"ל | Celltreat | FL4021 | |
| 1x DMEM ללא סרום בינוני | Gibco | 11965-092 | |
| 1x F12 ללא סרום בינוני | Gibco | 11765-054 | |
| 1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4',6- דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) | תרמו פישר | D1306 | |
| 40 ומיקרו; m filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| צלחת 6 בארות | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | אנזים עדין לניתוק תאים המורכב מאנזימים פרוטאוליטיים וקולגנוליטיים. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | צבע רזזורין המשמש למדידת כדאיות והתפשטות של תאים על סמך יכולתם להפחית רזזורין לרסורופין, שהוא פלואורסצנטי מאוד. |
| ערכת בדיקת ALDEFLUOR | Stem Cell Tech | 1700 | לזיהוי תאי גזע ואב המבטאים רמות גבוהות של אלדהיד דהידרוגנאז , אינדיקטור לתאי גזע סרטניים. הערכה מורכבת מ-ALDEFLUOR Reagent, DEAB, חומצה הידרוכלורית, דימתיל-סולפוקסיד ומאגר בדיקת ALDEFLUOR. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) הוא מעכב של איזואנזימים של ALDH, המשמש לקביעת צביעה לא ספציפית של ALDH. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford | Instruments-Antibiotics | |
| and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | בקרת איזוטיפ לכימות צביעה לא ספציפית של נוגדנים IgG2b. |
| תוסף B27 | Gibco | 17504044 | |
| בסיסי Fibroblast Growth Factor | טכנולוגיות תאי גזע | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 מזרקי אינסולין | פישר סיינטיפיק | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | נוגדן פלואורסצנטי המכוון ל-CD133, סמן תאי גזע סרטניים. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | חומר כימותרפיה מבוסס פלטינום המתפקד כחומר אלקילציה המשבש את ה-DNA. |
| DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) | Invitrogen | D1306 | |
| גורם גדילה אפידרמלי | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| סרום בקר עוברי - פרימיום (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | ג'ל לעיבוד רקמות שיכול לחדור ולהחזיק את הדגימה בתוך הג'ל תוך מניעת שינוי צבע סביב הדגימה בעת הצביעה. |
| תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי | Lonza | PT-5006 | |
| תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים | Lonza | CC2543 | |
| תוסף אינסולין-טרנספרין-סלניום | Gibco | 51500-056 | |
| ערכת כדאיות חי/מת | ערכת Invitrogen | L3224 | לזיהוי מבוסס פלואורסצנטי של תאים חיים (calcein-AM) ומתים (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM חומצות אמינו לא חיוניות | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 תוכנה | מכשירים מולקולריים-אולימפוס | ||
| IX81 מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך | אולימפוס-אולימפוס | ||
| IX83 מחקר מיקרוסקופ הפוך | אולימפוס | ||
| Parafilm M | תומאס סיינטיפיק | 7315D35 | רצועות פולימר תרמופלסטיות המשמשות להגבלת אידוי טיפות בלוחות טיפה תלויים תוך מתן אפשרות להחלפת גזים. |
| Perfecta 3D 384 לוחות טיפה תלויים היטב | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | זמין דרך Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin הוא פפטיד לתיוג פלואורסצנטי של F-actin בתאים קבועים. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D | Systems-מדפסת | תלת מימד |
| סטרילית DI מים | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | צבע אזו המשמש להבדיל בין תאים חיים ומתים על סמך יכולתו לעבור דרך הממברנה הפגועה של תאים מתים, אך לא הממברנה השלמה של תאים חיים. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D | Systems-A | חומר פולימרי תואם ביולוגית להדפסת תלת מימד. |
| יחידת סורק קונפוקלי YKOGAWA CSU-X1 | להתקנה | - |
מקורות
- All cancers Source: Globocan. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
