Method Article

ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרואורגניזמים מעיים אנושיים הפכו לאחרונה למטרה חשובה של מחקר בקידום בריאות האדם ומניעת מחלות. כתוצאה מכך, חקירות של אינטראקציות בין אנביוקינטיקה (למשל, תרופות וטרום ביודונטיה) ומיקרוביוטה לבטן הפכו לנושא מחקר חשוב. עם זאת, בניסויים vivo עם מתנדבים אנושיים אינם אידיאליים למחקרים כאלה בשל ביואתיקה ואילוצים כלכליים. כתוצאה מכך, מודלים בעלי חיים שימשו להערכת האינטראקציות הללו בvivo. למרות זאת, לימודי מודל בעלי חיים עדיין מוגבלים בשיקולים ביולוגיים, בנוסף לקומפוזיציות והבדלים שונים של מיקרוביוטה בבעלי חיים לעומת בני אדם. אסטרטגיית מחקר אלטרנטיבית היא השימוש בניסויים תסיסה אצווה המאפשרים הערכה של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בטן במבחנה. כדי להעריך את האסטרטגיה הזאת, נעשה שימוש ב-EP (ביף) האקפוליסכאנטיות (בדומה) כנציג מסוג xenobiotic יוטי. לאחר מכן, האינטראקציות בין ביף EPS לבין מיקרוביוטה בבטן האדם נחקרו באמצעות מספר שיטות כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה, ניתוח מקומי קהילתי חיידקי עם רצף התפוקה הגבוה של 16 rRNA, וכרומטוגרפיה של גז של חומצות שומן קצרות (SCFAs). המוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת. וחשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות גם שונה כדי לחקור אינטראקציות כלליות בין האנדוביוטיקה אחרים המעיים microbiota.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוביוטה במעיים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד המעי האנושי ובבריאות המארחת. כתוצאה מכך, המעיים microbiota לאחרונה להיות יעד חשוב למניעת מחלות וטיפול1. יתר על כן, בקטריה המעיים אינטראקציה עם תאי מעיים מארחים ומווסת תהליכים מארחים יסודיים, כולל פעילויות מטבוליות, זמינות מזינים, אפנון מערכת חיסונית, ואפילו תפקוד המוח וקבלת ההחלטות2,3 . אנדוביוטיקה יש פוטנציאל רב להשפיע על הרכב חיידקי וגיוון של מיקרוביוטה בטן. כך, אינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם משכו את תשומת הלב מחקר הגוברת4,5,6,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של הונאן אוניברסיטת המדע והנדסה (הונאן, סין), ואת אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג גונגאנג (ג'ג'יאנג, סין).

1. הכנת חיידקים

  1. הכנת מרק בינוני ביפידוחיידק
    1. שלב את הרכיבים הבאים ב 950 מ ל של מים מזוקקים: תמצית בשר, 5 g/L; תמצית שמרים, 5 גר'/L; פנימה של קזאין, 10 גרם/ליטר; soytone, 5 g/L; גלוקוז, 10 g/L; K2hpo4, 2.04 g/L; MgSO4· 7h2O, 0.22 g/L; . בסדר. H20, 0.05 g/L; המשך, 5 גר'/L; . רצף 80, 1 מ ל תמיסת מלח, 40 mL (CaCl2.2 h2O, 0.25 g/L; KH2פו4, 1 g/L; נחקו3, 10 גר'/L; הרוג, 2 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הייצור של EPS mucoid ניתן לצפות ב -B. longum התרבויות על לוחיות pyg לאחר דגירה אנאירובית עבור 72 h (איור 1a). צנטריפוגה של שריטות התרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא את האוסף של תאית כמו EPS (איור 1B). EPS מיובש ועמילן מסיסים שימשו לאחר מכן כמקורות פחמן לתרבויות תסיסה. השימוש ב-oligosaccharide לצורך הפרדה וניתוח טוהר בשל העלות הנמוכה והתוצאות המהירות18. למרות שקצב ההתדרדרות של העמילן על ידי מיקרוביוטה של הצואה האנושית היה מה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקדמות משמעותית נעשתה לקראת הבנה מיקרוביוטה הבטן האנושית הרכב ופעילויות בעשור האחרון. כתוצאה ממחקרים אלה, הושג הולובימונט, המייצג את האינטראקציות בין מחשבים מארחים לבין קהילות מיקרוביאלית הקשורות, כגון בין בני אדם לבין המעיים שלהם מיקרוביוטה19,20. יתר על כן, בני האדם נחשבים כעת גם כיום בתור סופר אורגניזמים21, שבו מיקרוביוטה בטן הוכרה כאחד האיברים הפונקציונליים בבני אדם22,23. הגוף .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. הנתונים הצוטטים ביין ואח '. . בסדר, 11

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31741109), קרן הונאן למדעי הטבע (No. 2018JJ3200), ואת התוכנית לבנות של משמעת אופיינית מיושם באוניברסיטת הונאן של המדע וההנדסה. אנו מודים LetPub (www.letpub.com) על הסיוע הלשוני שלה במהלך הכנת כתב היד הזה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 ומיקרו; מסנני ממברנה mMillipore SLGP033RBהשתמש לסינון דגימות
0.4 מ"מ מסננתתרמו פישר308080-99-1השתמש להכנת דגימות צואה אנושיות
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)SolarbioX1010השתמש להכנת צלחת צבע
AceticSigma-Aldrich71251מדגם סטנדרטי עבור SCFA
AgarSolarbioYZ-1012214הרכיב של
תא אנאירוביElectrotek AW 400SGתרבית חיידקים ותסיסה
חיטויSANYOMLS-3750השתמש לחיטוי
Bacto soytoneSigma-Aldrich70178הרכיב של
תנור אפייהשנחאי Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240Aהשתמש לחימום ואפייה
של תמצית בקרSolarbioG8270הרכיב של בינוני
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™חיידקים
מלחי מרהSolarbioYZ-1071304הרכיב של מדגם
בוטיריבינוני Sigma-Aldrich19215עבור SCFA
CaCl2SolarbioC7250תמיסת מלח של
עמוד נימיSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0.25 מ"מ ופעמים; 30 מ' ופעמים; 0.25 μ m)משמש לזיהוי SCFA
קזאין פפטוןסיגמא-אולדריץ'39396הרכיב של
צנטריפוגהבינונית Thermo ScientificSorvall ST 8שימוש לצנטריפוגה
CoSO4.7H2OSolarbioC7490הרכיב של
CuSO4.5H2OSolarbio203165הרכיב של בינוני
Cysteine-HClSolarbioL1550הרכיב של
אתנולSigma-AldrichE7023השתמש להכנת ויטמין K1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614הרכיב של
חומצה פורמיתSigma-Aldrich399388משמש
לכרומטוגרפיה של גזShimadzu CorporationGC-2010 Plusמשמש לזיהוי SCFA
זכוכיתפישר סיינטיפיקFB10050משמש להכנת תרחיץ
גלוקוזSolarbioG8760הרכיב של
בינוני HaeminSolarbioH8130הרכיב של
HClבינוניSigma-Aldrich30721תמיסה בסיסית המשמשת להתאמת ה-pH של המאגרים
איזובוטיריתSigma-Aldrich46935-Uמדגם סטנדרטי עבור
חומצות איזווולריותSigma-Aldrich129542מדגם סטנדרטי עבור SCFA
K2HPO4SolarbioD9880תמיסת מלח של
KClSolarbioP9921הרכיב של בינוני
KH2PO4SolarbioP7392תמיסת מלח של
LiCl.3H2Oבינוני SolarbioC8380השתמש להכנת צלחת צבע
תמצית בשרSigma-Aldrich-Aldrich70164הרכיב של
חומצה מטפוספוריתSigma-AldrichB7350דגימה סטנדרטית עבור SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160הרכיב של
MgSO4.7H2OSolarbioM8300תמיסת מלח של מערכת
MISEQבינוניתIllumina MiSeq 300PEרצף DNA
MnSO4. H20Sigma-AldrichM8179תמיסת מלח של
בינוני MupirocinSolarbioYZ-1448901אנטיביוטיקה
NaClSolarbioYZ-100376תמיסת מלח של בינוני
NaHCO3Sigma-Aldrich792519תמיסת מלח של בינוני
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000קבע את ריכוזי ה-DNA
NaOHSigma-Aldrich30620תמיסה בסיסית המשמשת להתאמת ה-pH של המאגרים
n-בוטנולChemSpider71-36-3משמש ל-TLC
NiCl2Solarbio746460הרכיב של
OrcinolSigma-Aldrich447420בינוני המשמש להכנת ריאגנטים
אורצינולPropionicSigma-Aldrich94425מדגם סטנדרטי עבור SCFA
QIAamp DNA שרפרף מיני ערכתQIAGEN51504לחלץ DNA גנומי חיידקי
אבקת PBS מוכנה לשימושסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA610100-0001משמש להכנת תרחיף השומנים
ResazurinSolarbioR8150ציוד אנאירובי
רכז ואקום מהירותLABCONCOCentriVapהשתמש להכנת EPS
עמילןSolarbioYZ-140602השתמש למקור הפחמן
חומצה גופרתיתSigma-Aldrich150692משמש להכנת ריאגנטים
T100 PCRBIO-RADהגברת PCR
TLC יריעות אלומיניוםMerckMillipore116835משמש ל-TLC
Trypticase פפטוןסיגמא-אולדריץ'Z699209הרכיב של בינוני
טריפטוןסיגמא-אולדריץ'T7293הרכיב של בינוני
Tween 80SolarbioT8360תמיסת מלח של בינוני
ValericSigma-Aldrich75054מדגם סטנדרטי ל-SCFA
ויטמין K1Sigma-AldrichV3501הרכיב של
מתנד מערבולתIndustriesVortex.Genie2השתמש למערבולת
תמצית שמריםSigma-AldrichY1625הרכיב של
בינוני ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251הרכיב של המדיום
בינוני בינוני סטנדרטי בינוני בינוני בינונית TLC SCFA בינוני בינונית אורצינול 1861096 בינוני Scientific

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personalit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endobiotics Gut MicrobiotaIn Vitro FermentationBifidobacterial EPSThin Layer ChromatographyGas Chromatography16S rRNA SequencingShort Chain Fatty AcidsAnaerobic IncubationFecal Sample PreparationPolysaccharide Degradation

Related Articles