Method Article

ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרואורגניזמים מעיים אנושיים הפכו לאחרונה למטרה חשובה של מחקר בקידום בריאות האדם ומניעת מחלות. כתוצאה מכך, חקירות של אינטראקציות בין אנביוקינטיקה (למשל, תרופות וטרום ביודונטיה) ומיקרוביוטה לבטן הפכו לנושא מחקר חשוב. עם זאת, בניסויים vivo עם מתנדבים אנושיים אינם אידיאליים למחקרים כאלה בשל ביואתיקה ואילוצים כלכליים. כתוצאה מכך, מודלים בעלי חיים שימשו להערכת האינטראקציות הללו בvivo. למרות זאת, לימודי מודל בעלי חיים עדיין מוגבלים בשיקולים ביולוגיים, בנוסף לקומפוזיציות והבדלים שונים של מיקרוביוטה בבעלי חיים לעומת בני אדם. אסטרטגיית מחקר אלטרנטיבית היא השימוש בניסויים תסיסה אצווה המאפשרים הערכה של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בטן במבחנה. כדי להעריך את האסטרטגיה הזאת, נעשה שימוש ב-EP (ביף) האקפוליסכאנטיות (בדומה) כנציג מסוג xenobiotic יוטי. לאחר מכן, האינטראקציות בין ביף EPS לבין מיקרוביוטה בבטן האדם נחקרו באמצעות מספר שיטות כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה, ניתוח מקומי קהילתי חיידקי עם רצף התפוקה הגבוה של 16 rRNA, וכרומטוגרפיה של גז של חומצות שומן קצרות (SCFAs). המוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת. וחשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות גם שונה כדי לחקור אינטראקציות כלליות בין האנדוביוטיקה אחרים המעיים microbiota.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוביוטה במעיים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד המעי האנושי ובבריאות המארחת. כתוצאה מכך, המעיים microbiota לאחרונה להיות יעד חשוב למניעת מחלות וטיפול1. יתר על כן, בקטריה המעיים אינטראקציה עם תאי מעיים מארחים ומווסת תהליכים מארחים יסודיים, כולל פעילויות מטבוליות, זמינות מזינים, אפנון מערכת חיסונית, ואפילו תפקוד המוח וקבלת ההחלטות2,3 . אנדוביוטיקה יש פוטנציאל רב להשפיע על הרכב חיידקי וגיוון של מיקרוביוטה בטן. כך, אינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם משכו את תשומת הלב מחקר הגוברת4,5,6,7,8,9.

קשה להעריך את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האנושית בvivo בשל האילוצים הביואתיים וההגבלות הכלכליות. לדוגמה, ניסויים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם לא ניתן לבצע ללא אישור של מינהל המזון והתרופות, וגיוס מתנדבים הוא יקר. לכן, מודלים בעלי חיים משמשים לעתים קרובות לחקירות כאלה. עם זאת, השימוש במודלים בעלי חיים מוגבל בשל קומפוזיציות microbiota שונים וגיוון בבעלי חיים לעומת הקהילות הקשורות לאדם. חלופה בשיטת חוץ גופית כדי לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם הבטן היא באמצעות השימוש בניסויים בתרבות האצווה.

הפרפוליסכדים (EPSs) הם prebiotics שתורמים באופן משמעותי לשמירה על בריאות האדם10. ברור epss כי מורכב של קומפוזיציות חד-סוכר שונים ומבנים יכולים להפגין פונקציות נפרדות. ניתוחים קודמים קבעו את ההרכב של ביף EPSs, אשר הם הנציג הבכיר ממוקד במחקר הנוכחי11. עם זאת, אפקטים מטבוליים המשויכים למארח לא נחשבו ביחס לקומפוזיציה ולגיוון של EPS.

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במיקרוביוטה צואה מ -12 מתנדבים להחמיץ את ביף EPSs. כרומטוגרפיה של שכבה דקה (למעלה), 16 s rRNA התפוקה הגבוהה ברצף של הגז, כרומטוגרפיה גז (GC) משמשים בשילוב כדי לחקור את האינטראקציות בין EPSs לבין מיקרוביוטה בטן האדם. יתרונות שונים של פרוטוקול זה בהשוואה לניסויים vivo הם בעלות נמוכה והימנעות של אפקטים מפריעים מחילוף החומרים של המארח. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר במחקרים אחרים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בבטן האדם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של הונאן אוניברסיטת המדע והנדסה (הונאן, סין), ואת אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג גונגאנג (ג'ג'יאנג, סין).

1. הכנת חיידקים

  1. הכנת מרק בינוני ביפידוחיידק
    1. שלב את הרכיבים הבאים ב 950 מ ל של מים מזוקקים: תמצית בשר, 5 g/L; תמצית שמרים, 5 גר'/L; פנימה של קזאין, 10 גרם/ליטר; soytone, 5 g/L; גלוקוז, 10 g/L; K2hpo4, 2.04 g/L; MgSO4· 7h2O, 0.22 g/L; . בסדר. H20, 0.05 g/L; המשך, 5 גר'/L; . רצף 80, 1 מ ל תמיסת מלח, 40 mL (CaCl2.2 h2O, 0.25 g/L; KH2פו4, 1 g/L; נחקו3, 10 גר'/L; הרוג, 2 גרם/ליטר); ו resazurin, 0.4 mL (2.5 mg/L). להתאים את ה-pH כדי 6.8 עם 2 M NaOH.
    2. אוטוקלב ב 121 ° c עבור 15 דקות ולאפשר ציר להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) תחת תנאים אנאירובית (10% H2, 10% CO2, 80% N 2). הוסף סינון-מעוקר cysteine-HCl (0.5 g/L) ו-mupirocin (5 מ"ג/L) למדיום.
  2. להוסיף סדרת מחלקים (50 μl) של הקפואים bifidobacterium לונגום לצינור תרבות עם 5 מ ל של ציר בינוני של bifidobacterium תחת תנאים אנאירובית, אז תרבות בחממה אנאירובית עבור 24 h ב 37 ° c.

2. הכנת משקפיים

  1. הכנת בינונית-PYG אגר
    1. שלב את הפעולות הבאות: peptone, 20 g/L; תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר; גלוקוז, 5 g/L; המשך, 0.08 ג'/ל; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4· 7h2O, 0.008 g/L; K2hpo4, 0.04 g/L; KH2PO4, 0.04 g/L; נחקו3, 0.4 ג'/ל; אגר, 12 g/L. להתאים את ה-pH כדי 7.2 באמצעות 10 M NaOH.
    2. אוטוקלב את התקשורת ב 121 ° c עבור 15 דקות וקריר עד ~ 50 ° c. אז, עבור 1 L של בינוני, להוסיף 0.5 mL של מסנן ויטמין K1 פתרון (1 גרם של ויטמין k1 מומס 99 mL של 99% אתנול), 5 מ ל של פתרון האמין (0.5 g של האמין הומס 1 מ ל 1 מול/L ' naoh , ואז הביא עד 100 mL עם מים מזוקקים), ו 0.5 g של cysteine-HCl.
    3. לפני שיוצקים את לוחיות PYG, להוסיף מסנן-מעוקר 5-bromo-4-כלורט-3-indolyl β-D-גלטופאוסייד (X-גל, 0.06 g/L), LiCl · 3H2O (5.7 g/l) ו-mupirocin (5 מ"ג/l) למדיום.
      הערה: X-Gal ו-LiCl. 3H2O לאפשר זיהוי של B. longum מושבות על לוחות באמצעות שינויי צבע.
  2. מחסן 20 μL של B. longum זנים (שלב 1.2) כדי pyg צלחות ומקום בחממה אנאירובית ב 37 ° c עבור 72 h.
  3. לאסוף מושבות חיידקי mucoid מן הצלחות PYG באמצעות סקופ שקילה, ואז לחלוטין להשעות בתוך 10 מ ל של פוספט מאגור מלוחים (PBS) באמצעות מתנד מערבולת.
    הערה: תערובות בקטריאלי ו-EPS צריך להיות מושהה לחלוטין על ידי vortexing או ללטף למעלה ולמטה שוב ושוב עד הסיבים מומס לחלוטין ב-PBS.
  4. צנטריפוגה את ההשעיה ב 6,000 x g עבור 5 דקות.
  5. העבירו בזהירות את הסופרנטנים לצינור הצנטריפוגה החדש וערבבו לגמרי עם שלושה כרכים של קור 99% אתנול על ידי היפוך ומיזוג חוזרות ונשנות.
  6. צנטריפוגה את התערובת ב 6,000 x g עבור 5 דקות לחלוטין להסיר את supernatants.
  7. הסר את הזרזים מצינורות הצנטריפוגה על ידי גירוד וייבוש של מחלץ EPS לילה באמצעות ואקום מהירות.

3. הכנת מדיום תסיסה

  1. הכנת מדיום תרבות בסיסית VI
    1. שלב את הפעולות הבאות: peptone, 3 g/L; טריטונים, 3 גר'/L; תמצית שמרים, 4.5 g/L; mucin, 0.5 g/L; מלחי מרה מס ' 3, 0.4 g/L; המשך, 4.5 ג'/ל; KCl, 2.5 g/L; MgCl2· 6h2O, 4.5 g/L; 1 מ ל רצף 80; CaCl2. 6h2O, 0.2 g/L; KH2PO4, 0.4 g/L; MgSO4· 7h2O, 3.0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0.32 g/L; FeSO4· 7h2o, 0.1 g/L; CoSO4· 7h2O, 0.18 g/L; CaCl2· 2h2O, 0.1 g/L; לאשר את היום4· 7h2O, 0.18 g/L; CuSO4· 5h2O, 0.01 g/L; ו-NiCl2· 6h2O, 0.092 g/L. להתאים את ה-PH כדי 6.5 עם HCl 1 M.
    2. הכן את האמין והציסטנין כפי שנעשה בסעיף 2.1 והוסף לאחר התיקון והצינון.
  2. הכן מדיה תרבותית המכילה מקורות פחמן שונים עם מדיית בסיס VI. לפני הפעלה אוטומטית, יש להוסיף 8 גרם/ליטר של סיבי EPS ל-VI הבינוני, הכולל קבוצה VI_Bif. בנוסף, הוסף 8 עמילן g/L ל-VI הבינוני כדי לייצג קבוצה VI_Starch. לבסוף, VI בינונית ללא תוספת של מקור פחמן משמש כפקד (קבוצה VI).
    הערה: אם EPS ו עמילן הם הומס הראשון במים חמים באמצעות מגנטים מגנטיים, ולאחר מכן מעורבב עם הכין מדיום VI.
  3. האוטוקלב כל המדיה ב 121 ° c עבור 15 דקות ולאפשר קריר כדי RT.
  4. העבר מדגם משנה (5 מ"ל) של כל בינוני לצינורות תרבות בחממה אנאירובית, ואחסן את המדיה הנותרת ב-4 ° c.

4. הכנה לדגימת צואה של אדם

  1. לאסוף דגימות בצואה טרי מיד לאחר הצרכים הטריים מתנדבים בריאים מבוגרים אנושיים באמצעות מכולות צואה, ולאחר מכן להשתמש לקראת הכנה להשתהות.
    הערה: לפני איסוף המדגם, יש להקפיד על כל המתנדבים כדי להבטיח שאין צורך בטיפול באנטיביוטיקה, בפרוביוטיקה או בטיפולים מוקדמים למשך שלושה חודשים לפחות לפני תרומת דגימות. בנוסף, כל התורמים חייבים לספק הסכמה מושכלת, בכתב.
  2. העבר מדגם צואה טרי (1 גרם) עד 10 מ"ל של 0.1 M אנאירובית PBS (pH 7.0) לתוך כוסות זכוכית, ואז להשתמש מוטות זכוכית כדי להכין 10% (w/v) ללגום.
  3. השתמש במכתש 0.4 מ"מ כדי לסנן את השימוש בצואה. לאחר מכן, השתמש במדגם משנה של המבחנות המסוננות כדי להשתמש בניסויי התסיסה של תרבות האצווה, ואחסן את השארית ב-80 ° צ' לניתוח נוסף.
    הערה: צעדים 4.2 – 4.3 מתנהלים בחדר אנאירובי.

5. תסיסה מחוץ למבחנה

  1. הוסף שאיפה מסוננים בצואה (500 μL) למדיום התסיסה שהוכן בשלב 3.2 בתוך חדר אנאירובי, ולאחר מכן דגירה ב 37 ° c.
  2. לאסוף 2 מ ל של דגימות מותסס ב 24 h ו 48 h בחדר אנאירובי ולאחר מכן צנטריפוגה מחוץ לחדר ב 6,000 x g עבור 3 דקות.
  3. העבירו בקפידה את הסופרנטנים לצינור הצנטריפוגה החדש שישמש לניתוח השפלה רב-סוכר וחומצות שומן קצרות (SCFAs) מדידות.
  4. לאחסן את צנטריפוגה כדורי ב-80 ° c ולאחר מכן להשתמש להפקת DNA חיידקים גנומית.

6. השפלה EPS על-ידי מיקרוביוטה של צואה אנושית

  1. טען 0.2 μL של סופרנטנים מותטים על גבי סיליקה ג'ל מצופה מראש-60 לוחות אלומיניום ולאחר מכן יבש באמצעות מייבש שיער.
  2. לפתח את הצלחות 20 מ ל של חומצה פורמית/n-butanol/מים (6:4:1, v:v: v) פתרון יבש באמצעות מייבש שיער.
  3. משרים את הצלחות בתוך מגיב orcinol כדי לצבוע, ואז יבש באמצעות מייבש שיער.
    1. להכין orcinol ריאגנטים על ידי המסת 900 מ"ג של Lichenol ב 25 מ ל של מים מזוקקים ולאחר מכן הוספת 375 mL של אתנול. לאחר מכן, חומצה גופרתית מרוכזת צריך להתווסף לאט והפתרון מעורבב ביסודיות.
  4. לוחות חום ב120 ° c במשך 3 דקות בתנור אפייה והערכת השפלה של EPS על ידי מדידת להקות האהבה.

7. השפעות EPS על מיקרוביוטה של המעי האנושי

  1. הקפא הפשרה דגימות צואה המקורי הכין בשלב 4.3 ודגימות מותסס הכין בשלב 5.4.
  2. לחלץ דנ א חיידקי גנומית (gDNA) מכל הדגימות באמצעות שרפרף בקטריאלי גנטי גנומית ערכת החילוץ בעקבות הוראות היצרן.
  3. קביעת ריכוזי DNA, integrities, וגודל הפצות באמצעות מיקרו ספקטרוסקופיה ואלקטרופורזה ג'ל אגר.
  4. התנהלות ה-PCR של גנים rRNA של בקטריאלי 16 מ-gDNA שחולצו באמצעות הבאים תיאר בעבר והפוך התחל12:
    -קדימה פריימר (ברקוד פריימר 338F): הוראות
    -הפוך פריימר (806R): מהפך
    השתמש בתנאי הציקלer התרמיים הבאים:
    1. 94 ° c עבור 5 דקות.
    2. 94 ° c עבור 30 ס מ.
    3. 55 ° c עבור 30 ס מ.
    4. 72 ° c במשך 1 דקות.
    5. חזור על 2 – 4 עבור 35 מחזורים
    6. 72 ° c עבור 5 דקות.
    7. 4 ° c להחזיק עד ההסרה של הציקלאה תרמית.
  5. ניהול רצף התפוקה הגבוהה של מוצרי ה-PCR בחברה ברצפי DNA באמצעות התפוקה ברמה גבוהה ביותר מיקרוביאלית הקהילה בדיקות.
  6. השיגו רצפים איכותיים ונקיים בעזרת התובנות הכמותיות לניתוח רצף של מיקרוביאלית (QIIME).
  7. הגדרת יחידות מיסוי מבצעיות (OTUs) עבור רצפי הגנים של 16S rRNA עם יותר מ-97% נוקלאוטיד דמיון באמצעות כלים ביואינפורמטיקה כגון חבילת התוכנה של מוארתור14.
  8. בחר רצף מייצג מכל OTU והשתמש במסווג ה-RDP יחד עם מסד הנתונים הטקמי של סילבה כדי לסווג רצפים מייצגים15.
  9. לחשב כיסוי של טוב, מדדים מגוון אלפא (כולל המדד סימפסון ושאנון), ועושר (מספר נצפה של OTUs) באמצעות כלים בביואינפורמטיקה16.

8. השפעות EPS על הפקת SCFA על ידי מיקרוביוטה המעי האנושי

  1. הוסיפו סופרנטנים מותטים (1 מ ל) המוכנים בשלב 5.3 עד 2 מנורות צנטריפוגה.
  2. הוסף 0.2 mL של 25% (w/v) חומצה מטאמזרחנית לכל הדגימות ולערבב ביסודיות את הפתרונות על ידי vortexing.
  3. צנטריפוגה את התערובות ב 13,000 x g עבור 20 דקות ולהעביר את supernatants כדי צינורות טריים.
  4. במקביל, להכין פתרונות 120 של propionic mM אצטית, בוטירית, איזווטיריק, חומצות ואלאריק ו isobutyric. אז, להוסיף 1 מ ל של כל חומצה מוכנה ל 1.2 mL של 25% (w/v) חומצה מטורית ולהשתמש כמו קוקטיילים סטנדרטיים.
  5. מסננים את הדגימות באמצעות קרום μM 0.22.
  6. זיהוי ריכוזי scfa באמצעות כרומטוגרפיה גז ביצועים גבוהים לפי פרוטוקולים שתוארו בעבר11,17.
    הערה: העמודה InertCap FFAP (0.25 mM x 30 m x 0.25 μM) משמש כרומטוגרפיה גז (GC). ריכוזי SCFA מבוססים לאחר מכן על בסיס אזורי שיא באמצעות שיטת התקן הפנימי של נקודה אחת בחבילת התוכנה של הפתרון GC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הייצור של EPS mucoid ניתן לצפות ב -B. longum התרבויות על לוחיות pyg לאחר דגירה אנאירובית עבור 72 h (איור 1a). צנטריפוגה של שריטות התרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא את האוסף של תאית כמו EPS (איור 1B). EPS מיובש ועמילן מסיסים שימשו לאחר מכן כמקורות פחמן לתרבויות תסיסה. השימוש ב-oligosaccharide לצורך הפרדה וניתוח טוהר בשל העלות הנמוכה והתוצאות המהירות18. למרות שקצב ההתדרדרות של העמילן על ידי מיקרוביוטה של הצואה האנושית היה מה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקדמות משמעותית נעשתה לקראת הבנה מיקרוביוטה הבטן האנושית הרכב ופעילויות בעשור האחרון. כתוצאה ממחקרים אלה, הושג הולובימונט, המייצג את האינטראקציות בין מחשבים מארחים לבין קהילות מיקרוביאלית הקשורות, כגון בין בני אדם לבין המעיים שלהם מיקרוביוטה19,20. יתר על כן, בני האדם נחשבים כעת גם כיום בתור סופר אורגניזמים21, שבו מיקרוביוטה בטן הוכרה כאחד האיברים הפונקציונליים בבני אדם22,23. הגוף ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. הנתונים הצוטטים ביין ואח '. . בסדר, 11

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31741109), קרן הונאן למדעי הטבע (No. 2018JJ3200), ואת התוכנית לבנות של משמעת אופיינית מיושם באוניברסיטת הונאן של המדע וההנדסה. אנו מודים LetPub (www.letpub.com) על הסיוע הלשוני שלה במהלך הכנת כתב היד הזה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 ומיקרו; מסנני ממברנה mMillipore SLGP033RBהשתמש לסינון דגימות
0.4 מ"מ מסננתתרמו פישר308080-99-1השתמש להכנת דגימות צואה אנושיות
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)SolarbioX1010השתמש להכנת צלחת צבע
AceticSigma-Aldrich71251מדגם סטנדרטי עבור SCFA
AgarSolarbioYZ-1012214הרכיב של
תא אנאירוביElectrotek AW 400SGתרבית חיידקים ותסיסה
חיטויSANYOMLS-3750השתמש לחיטוי
Bacto soytoneSigma-Aldrich70178הרכיב של
תנור אפייהשנחאי Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240Aהשתמש לחימום ואפייה
של תמצית בקרSolarbioG8270הרכיב של בינוני
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™חיידקים
מלחי מרהSolarbioYZ-1071304הרכיב של מדגם
בוטיריבינוני Sigma-Aldrich19215עבור SCFA
CaCl2SolarbioC7250תמיסת מלח של
עמוד נימיSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0.25 מ"מ ופעמים; 30 מ' ופעמים; 0.25 μ m)משמש לזיהוי SCFA
קזאין פפטוןסיגמא-אולדריץ'39396הרכיב של
צנטריפוגהבינונית Thermo ScientificSorvall ST 8שימוש לצנטריפוגה
CoSO4.7H2OSolarbioC7490הרכיב של
CuSO4.5H2OSolarbio203165הרכיב של בינוני
Cysteine-HClSolarbioL1550הרכיב של
אתנולSigma-AldrichE7023השתמש להכנת ויטמין K1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614הרכיב של
חומצה פורמיתSigma-Aldrich399388משמש
לכרומטוגרפיה של גזShimadzu CorporationGC-2010 Plusמשמש לזיהוי SCFA
זכוכיתפישר סיינטיפיקFB10050משמש להכנת תרחיץ
גלוקוזSolarbioG8760הרכיב של
בינוני HaeminSolarbioH8130הרכיב של
HClבינוניSigma-Aldrich30721תמיסה בסיסית המשמשת להתאמת ה-pH של המאגרים
איזובוטיריתSigma-Aldrich46935-Uמדגם סטנדרטי עבור
חומצות איזווולריותSigma-Aldrich129542מדגם סטנדרטי עבור SCFA
K2HPO4SolarbioD9880תמיסת מלח של
KClSolarbioP9921הרכיב של בינוני
KH2PO4SolarbioP7392תמיסת מלח של
LiCl.3H2Oבינוני SolarbioC8380השתמש להכנת צלחת צבע
תמצית בשרSigma-Aldrich-Aldrich70164הרכיב של
חומצה מטפוספוריתSigma-AldrichB7350דגימה סטנדרטית עבור SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160הרכיב של
MgSO4.7H2OSolarbioM8300תמיסת מלח של מערכת
MISEQבינוניתIllumina MiSeq 300PEרצף DNA
MnSO4. H20Sigma-AldrichM8179תמיסת מלח של
בינוני MupirocinSolarbioYZ-1448901אנטיביוטיקה
NaClSolarbioYZ-100376תמיסת מלח של בינוני
NaHCO3Sigma-Aldrich792519תמיסת מלח של בינוני
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000קבע את ריכוזי ה-DNA
NaOHSigma-Aldrich30620תמיסה בסיסית המשמשת להתאמת ה-pH של המאגרים
n-בוטנולChemSpider71-36-3משמש ל-TLC
NiCl2Solarbio746460הרכיב של
OrcinolSigma-Aldrich447420בינוני המשמש להכנת ריאגנטים
אורצינולPropionicSigma-Aldrich94425מדגם סטנדרטי עבור SCFA
QIAamp DNA שרפרף מיני ערכתQIAGEN51504לחלץ DNA גנומי חיידקי
אבקת PBS מוכנה לשימושסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA610100-0001משמש להכנת תרחיף השומנים
ResazurinSolarbioR8150ציוד אנאירובי
רכז ואקום מהירותLABCONCOCentriVapהשתמש להכנת EPS
עמילןSolarbioYZ-140602השתמש למקור הפחמן
חומצה גופרתיתSigma-Aldrich150692משמש להכנת ריאגנטים
T100 PCRBIO-RADהגברת PCR
TLC יריעות אלומיניוםMerckMillipore116835משמש ל-TLC
Trypticase פפטוןסיגמא-אולדריץ'Z699209הרכיב של בינוני
טריפטוןסיגמא-אולדריץ'T7293הרכיב של בינוני
Tween 80SolarbioT8360תמיסת מלח של בינוני
ValericSigma-Aldrich75054מדגם סטנדרטי ל-SCFA
ויטמין K1Sigma-AldrichV3501הרכיב של
מתנד מערבולתIndustriesVortex.Genie2השתמש למערבולת
תמצית שמריםSigma-AldrichY1625הרכיב של
בינוני ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251הרכיב של המדיום
בינוני בינוני סטנדרטי בינוני בינוני בינונית TLC SCFA בינוני בינונית אורצינול 1861096 בינוני Scientific

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309(2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099(2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576(2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889(2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533(2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endobiotics Gut MicrobiotaIn Vitro FermentationBifidobacterial EPSThin Layer ChromatographyGas Chromatography16S rRNA SequencingShort Chain Fatty AcidsAnaerobic IncubationFecal Sample PreparationPolysaccharide Degradation

Related Articles