הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59734

⸱

29 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2Departamento de Farmacociências, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, 3Laboratório de Poluição Atmosfêrica Experimental - LIM05, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 4Instituto de Estudos Avançados, Universidade de São Paulo, 5Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.

תקציר

DNA adducts ו תחמוצת בסיסים DNA הם דוגמאות של נגעים DNA כי הם ביטויים שימושיים עבור הערכה רעילות של חומרים אלקטרופיפילית, ליצור electrophilic גיבים על ביומרה, או לגרום ללחץ חמצוני. בין הנוקלאואובסים המזיקים, הנחקר ביותר הוא 8-אוקסו -7, 8-דיהידרוטסטוסטרון (8-oxoGua) או 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-Oxogua), ביואריקר של oxidatively נזק בסיסי ב-DNA. אלדהאדס והאפוקסי כתוצאה מתהליך פרחמצון השומנים הם מולקולות אלקטרופיאליות המסוגלים ליצור מוטטוציציציציציציציציציציציציציציליציציליציציציציציציציציציציציציציציציציציציצילליציק1, כגון האדנו adducts,n2 εdGuo) ו-1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,N6-εdAdo), אשר הועלו כסמנים פוטנציאליים בתוך הפתופסיולוגיה של דלקת. שיטות סלקטיבית ורגיש עבור כימות ה-DNA שלהם הם הכרחי לפיתוח אסטרטגיות מניעה להאט את שיעורי המוטציה התא ופיתוח מחלות כרוניות (למשל, סרטן, מחלות ניווניות). בין השיטות הרגישות הזמינות עבור האיתור שלהם (כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מצמידים אלקטרוכימי או משולב גלאי המסה המוניים, שביט שיטה, חיסוני, 32P-postlabeling), סלקטיבי ביותר הם אלה המבוססים על ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לטנדם ספקטרומטר מסה (בדיקות-ESI/MS). סלקטיביות היא יתרון חיוני בעת ניתוח דגימות ביולוגיות מורכבות ו-בדיקות-ESI-MS/MS התפתחו כתקן זהב עבור כימות נוקלאוטידים שונה בתוך מטריצות ביולוגיות, כגון DNA, שתן, פלזמה ורוק. השימוש בתקנים פנימיים המסומנים בisotopically מוסיף את היתרון של תיקונים להפסדים של מולקולה במהלך ההידרוליזה DNA ושלבי העשרת האנליט, כמו גם להבדלים בין הדגימות. זה גם מסייע בזיהוי של שיא כרומטוגרפי נכון כאשר יותר מאשר שיא אחד קיים.

אנו מציגים כאן שיטות רגישות, מדויקות ומדויקות במיוחד-ESI-MS/MS אשר הוחלו בהצלחה עבור כימות 8-oxodGuo, 1,N6-דאדו ו-1,N2-dguo בריאות, כבד וכליות DNA של עכבר/J עבור הערכה של ההשפעות של הסביבה PM2.5 חשיפה.

מבוא

כמה מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מסוגלים החמצן איגרות חוב כפול של DNA בסיסים ו כמה פחמנים deoxyribose moiety, יצירת בסיסים חמצון ו-DNA שובר הגדיל1. כמולקולה טעונה שלילית עשיר חנקן ואטומי חמצן, DNA הוא גם יעד עבור קבוצות electrophilic כי מגיבים בעקשנות עם האתרים הנופילים (חנקן וחמצן), מתן מוצרים הנקראים adducts DNA2. כך, adducts DNA ו תחמוצת בסיסים DNA הם דוגמאות של נגעים DNA כי הם ביטויים שימושיים עבור הערכה רעילות של חומרים, כי הם electrophilic, ליצור אלקטרופילנים תגובתי על הטרנספורמציה ביולוגית, או לגרום למתח חמצוני1, 2. שתיים. למרות בסיסים DNA שונה ניתן להסיר דנ א על ידי בסיס או נוקלאוטיד תיקון כריתה (BER או NER), אינדוקציה של חוסר איזון בין הדור וההסרה של נגעים DNA לטובת מוביל לשעבר לעלייה נטו של רמות שלהם ב-DNA שעות נוספות ב-דנ א3 < /c5 >. תוצאות הן הגידול של שיעורי מוטציה DNA, מופחתת ביטוי גנים, ופעילות חלבון מופחת2,4,5,6,7, אפקטים הקשורים היטב ה פיתוח מחלות. מוטציות DNA עשוי להשפיע על פונקציות סלולריות מגוונות, כגון איתות התא, מחזור התא, שלמות הגנום, היציבות טלומר, epigenome, מבנה כרומטין, שחבור RNA, הומאוסטזיס חלבון, מטבוליזם, אפופטוזיס, ובידול התא8 ,9. אסטרטגיות להאט את קצב מוטציה התא ופיתוח מחלות כרוניות (למשל, סרטן, מחלות ניווניות) לעבור דרך הידע של מקורות מוטציה, ביניהם, נגעים DNA והגורמים שלהם.

ROS שנוצר באופן שולי עודף, בשל חשיפה מזהמים, דלקת מתמשכת, פתופסולוגיה המחלה (למשל, סוכרת), וכו ', הם גורמים חשובים של נזק ביואואלי, כולל DNA ו נזק לשומנים1. כדוגמה, הידרוקסיל תגובתי מאוד רדיקלי (OH) נוצר מ2O2 הפחתה על ידי מעבר יונים מתכת (פה2 +, Cu+) מחמצן בסיסים dna, moiety סוכר dna ו חומצות שומן רב בלתי רווי ב דיפוזיה מבוקרת מחירים10. בקרב 80 מאופיין בנוקלאואוסים מחמצנים3, הנחקר ביותר הוא 8-אוקסו-7, 8-דיהידרוטסטוסטרון (8-oxogua) או 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxogua, איור 1), נגע כי הוא מסוגל לגרום ל-GT transversions ב תאים ממגלית10,11. הוא נוצר על ידי חמצון אלקטרונית מונו של גואנין, או על ידי רדיקלים הידרוקסיל או סינגרז התקפת חמצן של גואנין ב-DNA1. חומצות שומן רב בלתי רוויות הם מטרות חשובות אחרות של חמצון תגובתי מאוד, כגון •או, אשר ליזום את תהליך של השומנים peroxidation1,12. זה מעניק לחומצות שומן הידרופרתחמוצות שעלולות להתפרק לאלקטרופיפילית אלדדס ואפוקסידז, כגון malondialdehyde, 4-הידרוxy-2-nonenal, 2, 4-דאדיאנאל, 4, 5-אפוקסי-(2ה)-decenal, הקסאנאל, אקרונליין, קרוטונלדהיד, אשר הם מסוגל ליצור מוטאוציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציציקציציציציציציציציציציציצילציקציקציציציציק האתאי adducts 1,N2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2-εdGuo, איור 1) ו-1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdAdo, איור 1 ) הוצעו כסמנים פוטנציאליים ביוארגיולוגיה של הדלקת14,15.

figure-introduction-1
איור 1. מבנים כימיים של נגעים DNA לכמת במחקר הנוכחי. . ד ר 2-דיאוקסיבוז דמות זו השתנתה מתוך אוליביירה ואח '.34. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מחקרים שבוצעו בתחילת שנות השמונים אפשרו זיהוי רגיש של 8-oxodGuo על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים לזיהוי אלקטרוכימי (כרומטוגרפיה-ECD). הכמת של 8-oxodguo על ידי כדיקות-ECD במספר מערכות ביולוגיות נתון התנאים אוקסיגון הובילו הכרה של 8-oxodguo כמו ביואריקר של oxidatively המושרה נזק DNA1,16. למרות שהוא חזק ומאפשר את הכמת של 8-oxodGuo בטווח הנמוך למול17, כרומטוגרפיה-מדידות ECD להסתמך על הדיוק של זמן השמירה של אנליטה לזיהוי וברזולוציה של כרומטוגרפיה כדי למנוע הפרעות של רכיבים אחרים לדוגמה. כפי שזיהוי אלקטרוכימי דורש שימוש במלח (למשל, אשלגן פוספט, סודיום אצטט) בשלב הנייד, התחזוקה של מצבים אנליטיים נאותים זקוקה לזמן שגרתי של טור וניקוי ציוד.

לחילופין, השימוש של ה-dna בקטריאלי תיקון אנזים מערכת ה-dna גליפסיקלז (fpg) ו, לאחר מכן, האדם 8-oxoguanine גליסיקלז 1 (hOGG1), לאיתור והסרה של 8-oxoגואה מ-dna, יצא כדרך האינדוקציה של dna אלקליות יציב משך אתרים. האתרים האלקליות מומרים למעברי השילוב של דנ א ומאפשרים לכמת את האופיקציה העקיפה הגבוהה ביותר של 8-oxoGua על ידי אלקטרופורזה ביחידה בודדת של ג'ל ("שביט שומר"). את הרגישות הגבוהה ואת ההישג של הניתוחים ללא צורך בחילוץ ה-DNA הסלולר הם היתרונות העיקריים של סוג זה של שיטת. זה נותן את הנמוך ביותר יציב המדינה רמות של 8-oxogua ב-DNA, בדרך כלל 7-10 פעמים נמוך יותר מאשר רמות המתקבלות על ידי שיטות יואנליטיים המבוסס על הבדיקות. עם זאת, היא מדידה עקיפה של 8-oxogua וכמה החסרונות הם חוסר ספציפיות או יעילות לא ידוע של אנזימים תיקון בשימוש1,16,18.

חיסוני הם מערכת אחרים של שיטות המשמשות לזיהוי של 8-האוקגואה1 ו-DNA האקסוציציציציציציציציציציציציצינו1, כגון 1,N6-דאדו ו -1,N2-dguo12. למרות הרגישות, קיצור של השימוש בנוגדנים לאיתור נגעים DNA הוא חוסר ספציפיות בשל פעילות צולבת לרכיבים אחרים של דגימות ביולוגיות, כולל DNA נורמלי בסיסים1,12. כולל דנ א האקסוציטוציציציאלי, לרבות 1,N6-דאדו ו-1,n2-dguo, ניתן גם לזהות ולכמת על ידי רגיש מאוד 32P-postlabeling בחני12. רגישות גבוהה של 32P-התיוג מאפשר את השימוש של כמויות קטנות מאוד של DNA (g., 10 μg) לאיתור של כ 1 קרוב לכל 1010 בסיסים נורמליים19. עם זאת, השימוש בחומרים כימיים, חוסר ספציפיות כימית ודיוק נמוך הם כמה חסרונות19,20.

מגבלה משותפת של השיטות המצוטטות לעיל היא הסלקטיביות הנמוכה או הספציפיות לאיתור המולקולות הרצויות. בתרחיש זה, מצמידים מערכות המדידה לאלקטרו-מגנון מסוג ספקטרומטר המסה (בדיקות-ESI-MS/MS ו-בדיקות-MS3) התפתחו כסטנדרט הזהב לכמת של נוקלאוטידים ששונו בתוך מטריצות ביולוגיות, כגון דנ א, שתן, פלזמה ורוק מיכל בן , מיכל בן 19 , 20. היתרונות של כרומטוגרפיה-ESI-ms/ms הם רגישות (בדרך כלל בטווח fmol נמוך) ואת הספציפיות שסופקו על ידי i) את ההפרדה כרומטוגרפי, ii) תבנית מאפיין וידוע של פיצול מולקולה בתוך המסה תא התנגשות ספקטרומטר, ו iii) את המדידה המדויקת של המסה שנבחרה לחייב את היחס (m/z) במצב ניטור תגובה מרובה1,19. השימוש בתקנים פנימיים המסומנים בisotopically מוסיף את היתרון של תיקונים להפסדים של מולקולה במהלך ההידרוליזה DNA ושלבי העשרת האנליט, כמו גם להבדלים בין הדגימות. זה גם מסייע בזיהוי של שיא כרומואטוגרפי הנכון כאשר יותר משיא אחד קיים1,12,19,20.

מספר שיטות המבוססות על בדיקות – ESI-ms/ms שימשו עבור כימות של 8-oxodguo, 1,N6-דאדו ו 1,n2-dguo ב-DNA מופק דגימות ביולוגיות שונות12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . חלקיקים עדינים (PM2.5) לשאת כימיקלים אורגניים ובלתי אורגניים, כגון פחמימנים ארומטיים רב-מחזורי (pahs), ניטרו-pahs, אלדיודס, ketones, חומצות קרבוקסיליות, quinolines, מתכות, ויונים מסיסים במים, אשר עשויים לגרום לדלקת ו לחץ חמצוני, התנאים שעדיף על התרחשות של נזק ביואואלי ומחלה30,31,32,33. אנו מציגים כאן אימות מאומת-ESI-שיטות ms/ms אשר הוחלו בהצלחה עבור כימות של 8-oxodguo, 1,N6-דאדו ו-1,N2-dguo בריאות, כבד וכליות DNA של עכברים/J להערכת ה ההשפעות של הסביבה PM2.5 חשיפה34.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ארבעה שבועות גברים A/J עכברים, הפתוגן הספציפי חינם, התקבלו מן המרכז רבייה של בעלי חיים מעבדה של פונדסאו אוסמדו קרוז (FIOCRUZ ריו דה ז'ניירו, ברזיל, וטופלו בהתאם ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת של סאו פאולו (פרוטוקול no 1310/09).

1. אוסף של ממחטות עכברים

  1. . החיה את בעל החיים בעזרת קסילטין וקטמין עבור עכבר עם 30 גרם של משקל הגוף, להזריק פתרון (לא יותר מ 2 mL) המכיל 2.63 מ"ג של קטמין ו 0.38 mg של xylazine, intraperitoneally.
  2. איסוף דם (0.5-1.5 mL) לניתוחים משלימים (למשל, פעילות אנזים נוגד חמצון, רמות malondialdehyde).
  3. לגלח את שיער הבטן מהאגן לתהליך xiphoid. לעשות חתך בקו אמצע אנכי באזור שיער. הפוך חתכים בקווים אופקיים לרוחב כדי לחשוף את איברי הבטן.
  4. חתכו את אבי העורקים הבטני כדי לקדם את הדימום ולהרדים את החיה.
  5. הסר את רקמות הריבית (במקרה זה, כבד, כליות וריאות).
    1. להסיר את הכבד, לחתוך את הווריד. הנחות וריד הכבד של השער
    2. כדי להסיר את הכליות, לחלק את ורידים הכליות ואת העורקים.
    3. כדי להסיר את הריאות, לעשות חתך בגפיים הסרעפת היקף קרוב לקיר החזה. שוברים את הבריח על ידי פתיחת מספריים בפנים חלל בית החזה. חותכים את העצם החוצה מתהליך xiphoid לכיוון קנה הנשימה, כדי לחשוף את הריאות והלב.
      1. להחזיק את הריאה עם מלקחיים, מקטע את קנה הנשימה ואת הרצועות סביב הריאות. הסר בזהירות את הריאות בלוק פלוס לב. כדי להסיר את הריאות מתוך הבלוק, להחזיק את הלב עם מלקחיים ולחתוך את כל כלי בבסיסו.
  6. לשטוף את הרקמות מבודדים מיד בתמיסה מלוחים קר (0.9% הנאגל), להעביר צינורות קריוגניים, ומיד לטבול את הצינורות לתוך חנקן נוזלי. לאחר השלמת העבודה, אחסן את הצינורות ב-80 ° c.
    זהירות: חנקן נוזלי במגע ישיר עם העור, רירית או עיניים גורמות לכוויות. השתמש בהגנה אישית מתאימה כדי להימנע ממגע. לעבוד במעבדה מאוורר כדי למנוע חנק עקב אדי חנקן נוזלי.

2. הפקת דנ א

הערה: שיטת הפקת ה-DNA שונתה מ-Loureiro et al. (2009)35 כדי לאפשר ניתוח של הנגעים למדו כאן.

  1. להעביר את הצינורות המכילים את הרקמות כדי קרח יבש.
  2. השתמש צלחת תרבות להציב על הקרח כבסיס לחתוך חתיכת רקמה עם אזמל. . משקל 1 גרם לשימוש מיידי את הרקמה שנותרה יש לשמור על קרח יבש עד שהוא חוזר לאחסון ב-80 ° c.
    הערה: חשוב להימנע מהפשרה של הרקמה הנותרת כדי למנוע את היווצרות הממצאים אם יש צורך בחזרות של הניתוחים.
  3. לכל 1 גרם של רקמת 50 ml הכתיר צינורות, להוסיף 10 מ ל של הפתרון לפירוק התא המסחרי המכיל 0.5 מילימטר דפרוקסמין ולשמור על קרח.
    הערה: הוסף דפרוקסמין לנפח של פתרון לשימוש מיידי. עבור כל 100 mL של הפתרון, להוסיף 0.0328 g של מלח דפרוקסמין.
  4. המגון לסדר את הרקמות באמצעות הומוגניצר רקמה עד פתרון הומוגנית ללא שברי רקמה מתקבלים. שמרו על הצינור קר (על הקרח) בזמן המגון. השתמש במהירות נמוכה כדי למנוע חימום.
  5. הוסף 150 μL של הפתרון הפרוטאינאז K (20 מ"ג/mL) לכל דגימת הומוגניים. לנער את הצינורות על ידי היפוך ולשמור אותם בטמפרטורת החדר לילה.
  6. הוסף 40 μl של ריבונוקלאז פתרון (15 מ"ג/mL), ללחוץ על ידי היפוך, ולשמור את הצינורות בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
    הערה: הכנת ריבונוקלאז פתרון במאגר אצטט נתרן 10 מ"מ, pH 5.2 כדי למנוע משקעים. לחמם את הפתרון ב 100 ° c עבור 15 דקות לפני השימוש כדי לקבל פתרון חינם מ deoxyribonuclease.
  7. להוסיף 5 מ ל של הפתרון המסחרי משקעים חלבון, מערבולת במרץ, וצנטריפוגה ב 2,000 x g, 4 ° c, עבור 10 דקות.
  8. העבירו את הסופרנטנים לצינורות ה50 mL המכילים 10 מ ל הצטננות. היפוך החצוצרות בעדינות מספר פעמים עד להתבוננות של דנ א זירז.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, לשמור את הצינורות ב-20 ° c.
  9. לאסוף את הדנ א זירז באמצעות פיפטה פסטר הסגור בסוף. להעביר אותו צינורות המכיל 4 מ מ של 10 מ"מ מאגר טריס, 1 מ"מ deferoxamine, pH 7.0.
  10. לאחר ה-DNA הוא מומס לחלוטין בפתרון הנ ל (לא מערבולת), להוסיף 4 מ ל של פתרון כלורופורם המכיל 4% אלכוהול isoamyl.
  11. היפוך הצינורות 10 פעמים עבור הומוגון, צנטריפוגה ב 2,000 x g, 4 ° צ', עבור 10 דקות כדי להפריד את שני השלבים, ולהעביר את השלב העליון לצינור חדש.
  12. חזור על השלבים 2.10 ו-2.11 עוד פעמיים.
  13. הוסף 8 מ ל של אתנול מוחלט ו 0.4 mL של הפתרון 5 M הנאל לזרז את ה-DNA.
  14. לאסוף שוב את הדנ א זירז ולהעביר אותו 3 מ"ל של 70% אתנול. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת
  15. להיפטר פתרון אתנול עם זהירות ולהפוך את הצינורות המכילים את ה-DNA זירז על נייר סופג כדי להסיר את עודפי הפתרון.
  16. הוסף 200 μl של 0.1 mM הפתרון דפרוקסמין כדי לפזר את ה-DNA. שמרו על החצוצרות ב -4 ° c עד שהדנ א מתכלה לחלוטין (לילה).
  17. לקבוע את ריכוז ה-DNA על ידי מדידת ספיגת בשנת 260 nm וטוהר שלה על ידי 260/280 היחס של בספיגת ננומטר.
    הערה: כדי לקבוע את ריכוז ה-dna, להעביר סדרת מחלקים של 10 μl של פתרון ה-DNA כדי 990 μl של מים אולטרה-טהורים (100x דילול). הכפל את ספיגת ב 260 ננומטר (זה צריך להיות מתחת 1) על ידי 50 (50 μg/mL הוא ריכוז של דנ א כפול שנתקע כאשר ספיגת באורך 1 ס מ הנתיב פתרון ב 260 nm היא 1) ועל ידי דילול בשימוש (100x) כדי לקבל את ריכוז ה-DNA ב μg/mL. אם הספיגה ב 260 ננומטר היא מעל 1, מדלל נוספים נחוצים. היחס לספיגה של 260/280 ננומטר צריך להיות שווה או מעל 1.8 לטוהר הדנ א הרצוי, אבל היחס סביב 1.6 מקובלים.

3. הידרוליזה DNA אנזימטית

  1. מתכון לאנליזה
    1. 1,n6-εdAdo ו 1,N2-εdGuo ניתוחים: כדי סדרת מחלקים המכיל 150 μg של DNA, להוסיף 7.5 μl של 200 mM Tris/mgcl2 מאגר (pH 7.4), 1.4 μl של פתרון סטנדרטי המכיל 250 fmol/μl של [15N5 ] 1,n6-εdAdo ו [15N5] 1,n2-εdGuo, ו 15 יחידות של deoxyribonuclease I. להתאים את אמצעי האחסון הסופי כדי 200 μl עם מים באולטרסאונד, לחסר את הכרכים של אנזימים לשמש בשלב 3.2.1.
    2. 8-oxodguo מנתח: כדי סדרת מחלקים המכיל 80 μg של ה-DNA, להוסיף 3.8 μl של 200 mM Tris/mgcl2 מאגר (pH 7.4), 2 μl של הפתרון התקני הפנימי המכיל 1,000 fmol/μl של [15N5] 8-oxodguo, ו 8 יחידות של deאוקסיribon כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-100 μL עם מים באולטרטהורים, הפחתת אמצעי האחסון של אנזימים שישמשו בשלב 3.2.2.
      הערה: התקנים הפנימיים [15n5] 1,n6-εdAdo, [15n5] 1,n2-εdGuo ו-[15n5] 8-oxodguo יכול להיות מאפיין ומאופיין כ תואר35,36,37. הכמויות של התקנים הפנימיים באמצעי האחסון לדוגמה המוזרקים אמורות להיות זהות לאלה שבאמצעי האחסון של עקומת הכיול המוזרקים.
  2. מודג את הדגימות ב 37 ° c עבור שעה אחת.
    1. דגימות משלב 3.1: להוסיף 0.006 יחידות של פוספודיאסטראז אני מ Crotalus מתנוון ו 15 יחידות של פוספספטאז אלקליין מתוך רירית המעיים של שור.
    2. דגימות משלב 3.2: להוסיף 0.0032 יחידות של פוספודיאסטראז אני מ Crotalus מתנוון ו 8 יחידות של פוספספטאז אלקליין מתוך רירית המעיים של הפרה.
  3. מודג את הדגימות ב 37 ° c עבור שעה אחת.
  4. צנטריפוגה את הדגימות ב 14,000 x g עבור 10 דקות.
  5. דגימות משלב 3.2.1: הפרדת 10 μL של כל מדגם עבור כימות של הדאוקסינוקלאוטידים (דדו, dGuo) על ידי בדיקות/אבא (שלב 9). הנושא את שרידי אמצעי האחסון להפקת שלב מוצק (שלב 4).
  6. דגימות משלב 3.2.2: העברת 80 μL של סופרנטאנט לבקבוקונים עבור זריקות של 50 μL (1,000 fmol של [15N5] 8-oxodguo) ב-בדיקות-ESI-ms/ms מערכת. שמור את השאר 20 μL עבור כימות של dGuo על ידי בדיקת המידע/אבא (שלב 9).

4. הפקת שלב מוצק עבור ניתוחים של 1, n6-εdAdo ו-1, n2-εdGuo

  1. טען את מחסניות (SPE-סי18, 30 מ"ג/mL, 33 μm, 1 מ ל) עם 1 מ ל של רצף הפתרונות הבאים: 100% מתנול, מים מוהים, דגימת דנ א הידרוליאד, מים מיוהים, 10% מתנול, 15% מתנול, ו 100% מתנול (להיות נאסף).
    הערה: אל תשאירו את המחסניות מתייבשות בין היישומים של הפתרונות השונים. הוסף את הפתרון הבא מיד לאחר שהפתרון הקודם יזין לחלוטין את המחסנית.
  2. יבש ואקום השבר האחרון (100% מתנול) המכיל את הadducts.
  3. השהה מחדש את הדגימות היבשות ב-83.1 μL של מים אולטרה-טהורים מיד לפני ניתוח-בדיקות-ESI-MS/MS, כדי להשיג 200 fmol של כל תקן פנימי ב 50 μL של כל מדגם.

5. הכנת עקומות כיול

  1. הכינו לפחות חמש נקודות במרווח של 300 עד 6,000 fmol מתקן 8-oxodGuo, עם כמות קבועה של 1,000 fmol של [15N5] 8-oxodguo בכל נקודה. חשוב על כמויות אלה באמצעי האחסון שהוזרק.
  2. הכינו לפחות חמש נקודות במרווח של 1 עד 40 fmol של 1,n6-εdAdo ו-1, n2-εdGuo, עם כמויות קבועות של 200 fmol של [15n5] 1,n6-εdAdo ו [15n5] 1, נ 2-εdGuo בכל נקודה. חשוב על כמויות אלה באמצעי האחסון שהוזרק.
  3. הכינו לפחות חמש נקודות במרווח של 0.05-1 nmol של dGuo ודדו. חשוב על כמויות אלה באמצעי האחסון שהוזרק.

6. הכנת דגימות דנ א עבור אימות השיטה

  1. 1,n6-εdAdo ו-1,n2-εdGuo ניתוחים: להוסיף כמויות שונות של 1,n6-εdAdo ו 1,n2-εdGuo (g., 1.75, 8.75, 17.5, ו-35 fmol) וכמויות קבועות של [15N5] 1, N6-εdAdo ו [15N5] 1,N2-εdGuo (350 fmol) ל 100 μg של בלוטת התימוס של עגל לבצע את ההידרוליזה אנזימטית כפי שמתואר בשלב 3. . בשני ימים שונים השתמש בדגימות עבור דיוק השיטה והערכה מדויקת.
    הערה: הנפח הסופי של ה-DNA הידרוליטים יהיה 200 μL (שלב 3), שממנו 10 μL יופרדו לקוונפיקציה של deoxynucleosides על ידי בדיקות/אבא (שלב 9). הפתרון הנותר (190 μL) יהיה נתון לחילוץ שלב מוצק (שלב 4), את השבר מיובש יהיה מושהה ב 83.1 μL (שלב 4.3), שממנו 50 μL יהיה מוזרק ב-כנסי-ESI-מערכת MS/MS. כמויות של 1,n6-εdAdo ו-1, n2-εdGuo הוזרק יהיה 1, 5, 10, ו 20 fmol, עם 200 fmol של[15n5] 1, n6-εdAdo ו [15n5] 1,n 2-εdGuo בכל מדגם.
  2. 8-oxodGuo מנתח: להוסיף כמויות שונות של 8-oxodGuo (למשל, 734, 1,468, 2,938, ו 4,408 fmol) וכמות קבועה של [15N5] 8-oxodguo (2,000 fmol) כדי 100 μg של התימוס עגל DNA לבצע את ההידרוליזה אנזימטית כמתואר בשלב 3. . בשני ימים שונים השתמש בדגימות עבור דיוק השיטה והערכה מדויקת.
    הערה: הנפח הסופי של ה-DNA הhydrolysates יהיה 100 μL (שלב 3), שממנו 50 μL יהיה מוזרק ב-בדיקות-ESI-MS/MS מערכת. כמויות של 8-oxodGuo מוזרק יהיה 367, 734, 1469, ו 2204 fmol, עם 1,000 fmol של [15N5] 8-oxodguo בכל מדגם.
  3. הוסף 13.125 fmol של 1,N6-εdAdo (כדי לקבל 7.5 fmol בכרך ההזרקה) ו 35 Fmol של 1,N2-εdGuo (כדי להשיג 20 fmol בכרך ההזרקה) עד שמונה דגימות של 100 μg של DNA עגל בלוטת התימוס.
    1. הוסף את התקנים הפנימיים [15n5] 1,n6-εdAdo ו [15n5] 1,n2-εdGuo (200 fmol) לארבעה מהדגימות. המשיכו בהידרוליזה הדי. אנ. איי. ובהפקת השלב המוצק של כל הדגימות
    2. הוסף את התקנים הפנימיים [15n5] 1,n6-εdAdo ו [15n5] 1,n2-εdGuo (200 fmol) לארבעת הדגימות האחרות.
    3. השתמש בדגימות כדי לחשב את ההתאוששות של האדצינוריות מפני הפקת שלב מוצק.

7. כדיקות-מחקר ואנליזה בע ' ' ב-8-אוקאוגואו

  1. החדרת תקן 8-oxodGuo לתוך הציוד, להגדיר את הפרמטרים ESI-MS/MS עבור הזיהוי הטוב ביותר של דפוס הפיצול שלה על ידי ניטור תגובה מרובה (MRM): m/z 284 [m-H] + → m/z 168 [m-2 '-Deoxyribose + H]+.
    1. השתמש באותם הפרמטרים לזיהוי של [15N5] 8-oxodguo: m/z 289 [m + H]+m/z → 173 [m-2 "-deoxyribose + H]+.
      הערה: השתמש בציוד שווה ערך או טוב יותר מהציוד המשמש בעבודה זו (עיין בטבלת החומרים). הפרמטרים של ESI-MS/MS הוגדרו כמתואר בטבלה 1.
  2. מסנן (באמצעות 0.22 יקרומטר נקבובי ממברנות) ו degasify (באמצעות sonicator) כל ממיסים המבוסס על מים כלים.
  3. השתמש בתנאי הכרומטוגרפיה הבאים עבור הניתוחים, תוך טעינת המערכת כמוצג באיור 2.
    הערה: עמודה A מחוברת למשאבה הבינארית. המינט שלו מופנית לאיתור UV ופסולת ב -16 דקות הראשונות ומ32 עד 46 דקות של כרומטוגרפיה, כפי שמוצג באיור 2A. זהו הטור שדרכו המדגם משתמט מיד לאחר ההזרקה. עמודה ב' מחוברת למשאבה הisocratic ולספקטרומטר המסה. הוא מקבל את הפקודה של עמודה A רק במרווח 16-32 דקות, כאשר השסתום מוחלף למיקום המוצג באיור 2B. מיתוג השסתום מאפשר את החיבור בין שתי העמודות, אשר מוככבות על-ידי המשאבה הבינארית מעבר צבע. התצורה המוצגת באיור 2B מאפשרת הפרדה נוספת של שיא והיצרות. בנוסף, רק החלק הכרומטוגרפי של הריבית מגיע לספקטרומטר המסה, שיפור הרגישות והסלקטיביות.
    1. Elute 50 x 2.0 mm זיהוי, 2.5 μm, סי18 עמודה (עמודה a של איור 2) מצמידים מחסנית המאבטח סי18 (4.0 x 3.0 מילימטר זיהוי) עם הדרגתי של 0.1% החומצה פורמית (ממס a) ו מתנול המכיל 0.1% פורמית חומצה (ממס B) בקצב הזרימה של 150 μl/min ו 25 ° c.
      1. השתמש בתוכנית מעבר הצבע הבאה עבור המשאבה הבינארית: מ -0 עד 25 דקות, 0-15% מממס B; 25 עד 28 דקות, 15-80% מממס B; 28 עד 31 דקות, 80% מממס B; 31 עד 33 דקות, 80-0% מממס B; 33 עד 46 דקות, 0% מממס B.
      2. השתמש שסתום מיתוג כדי לכוון את 16 הראשון של הללויה כדי לבזבז את 16-32 דקות שבר לעמודה השנייה (150 x 2.0 מ מ' זיהוי, 3.0 μm, סי18, עמודה B של איור 2) מחובר למקור ESI וממוזג על ידי משאבת isocratic עם פתרון של 15% לי thanol במים המכילים 0.1% החומצה פורמית (150 μl/min).
        הערה: לפני השימוש בתוכנית שסתום המעבר של שלב 7.3.1.2, בדוק אם תקן 8-oxodGuo מתרחק מהעמודה הראשונה לאחר 16 דקות. חשוב לסגור את השסתום ב 32 דקות כדי להשתמש במעבר של המשאבה הבינארית כדי elute 8-oxodGuo מהעמודה השנייה ולקבל שיא כרומטוגרפי חדה. הנגע 8-oxodGuo מהטור השני בקירוב כ 36 דקות. וריאציות של זמן השמירה של האנליטה עשוי להתרחש בהתאם לעמודה והציוד המשמש. ייתכן שיש צורך בעיבודים לתוכניות מעבר צבע של הממיסים.

figure-protocol-1
איור 2. מערכת של שתי עמודות המשמשות 8-אוקסו -7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo) ניתוח. A) התצורה המשמשת ב -16 הדקות הראשונות ומ32 עד 46 דקות של הכרומטוגרפיה; B) התצורה המשמשת במרווח 16-32 דקות, ומאפשרת הפרדה נוספת וצמצום השיא בטור B לפני הימנעות ממקור ESI של ספקטרומטר המסה. נתון זה פורסם שוב מתוך אוליביירה ואח '.34. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

8. כדיקות-ESI-MS/MS ניתוח של 1, N 6 -εdAdo ו-1, N 2 -εdGuo

  1. החדרת 1,n6-ΕdAdo ו 1,n2-εdGuo סטנדרטים לתוך ציוד, להגדיר את הפרמטרים ESI-ms/ms עבור הזיהוי הטוב ביותר של דפוסי הפיצול שלהם על ידי ניטור תגובה מרובה (MRM): m/z 276 [m + H]+ → M/z 160 [m 2 '-deoxyribose + H]+ לזיהוי של 1,N6-εdAdo ו- M/z 292 [m + H]+ → m/z 176 [m-2 '-deoxyribose + H ]+ לאיתור של 1,N2-εdGuo.
    1. השתמש באותם הפרמטרים לזיהוי של [15N5] 1,N6-εdAdo (m/z 281 [m + H]+m/z → 165 [m-2 "-deoxyribose + H]+) ו [15n 5] 1,N2-εdGuo (m/z 297 [m + H]+ → m/z 181 [m-2 '-deoxyribose + H]+). הגדר את הפרמטרים של ESI-MS/MS כמתואר בטבלה 1.
פרמטרים של מערכי MS/MS8-oxodGuoאתאינו אדצינוריות
וילון גז20 psi20 psi
גז מדמיע5550
מקור גז יון50 psi40 psi
גז דיסוציאציה מושרה בהתנגשותבינוניבינוני
וולט ספריי יונים50004500
טמפ ' בדיקה450450
פוטנציאל לשרת31 וי, 8-אוקאוגואו41 V, 1, N6-εdAdo
31 ו, [15N5] 8-oxodguo41 V, [15N5] 1, N6-εdAdo
45 V, 1, N2-εdGuo
45V, [15N5] 1, N2-εdGuo
התנגשות אנרגיה23 eV, 8-אוקאוגואו25 eV, 1, N6-εdAdo
23 eV, [15N5] 8-oxodguo25 eV, [15N5] 1, N6-εdAdo
27 eV, 1, N2-εdGuo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdGuo
תא התנגשות יציאה פוטנציאלית16 וולט, 8-אוקאוגואו,8 V, 1, N6-εdAdo
16 V, [15N5] 8-oxodguo8 V, [15N5] 1, N6-εdAdo
16 V, 1, N2-εdGuo
16 V, [15N5] 1, N2-εdGuo
פוטנציאל הכניסה10 הגרסה הנ10 הגרסה הנ

. שולחן 1 פרמטרים המשמשים בציוד ESI-MS/MS לאיתור נגעים DNA. הטבלה הזאת השתנתה מתוך אוליביירה ואח '.34.

  1. מסנן (באמצעות 0.22 יקרומטר נקבובי ממברנות) ו degasify (באמצעות sonicator) כל ממיסים המבוסס על מים כלים.
  2. השתמש בתנאי הכרומטוגרפיה הבאים עבור הניתוחים.
    1. אליוט a 150 x 2.0 מ"מ זיהוי, 3.0 μm, סי18 עמודה מצמידים מחסנית המאבטח סי18 (4.0 x 3.0 מ"מ זיהוי) עם הדרגתי של 5 מילימטר אמוניום אצטט, pH 6.6 (ממס A) ו acetonitrile (ממס B) בקצב הזרימה של 130 μL/min ו -25 ° c.
      1. השתמש בתוכנית מעבר הצבע הבאה עבור המשאבה הבינארית: מ -0 עד 10 דקות, 0% מהממס B; 10 עד 39 דקות, 0-20% מממס B; 39 עד 41 דקות, 20-75% מממס B; 41 עד 46 דקות, 75% מממס B; 46 עד 47 דקות, 75-0% מממס B; 47 עד 60 דקות, 0% מממס B.
      2. השתמש שסתום מיתוג כדי לכוון את הראשון 35 מינימום של הללויה כדי לבזבז את 35-42 min שבר למקור ESI. ודא שרמת האוורור מוגדרת מהעמודה במרווח הזמן (35-42 דקות). בצע התאמות במקרה הצורך.

9. הכמת של הנורמה 2 '-deoxyribonucleosides על ידי בדיקת UV

  1. השתמש בציוד הדומה לציוד המשמש בעבודה זו (עיין בטבלת החומרים).
  2. Elute a 250 mm x 4.6 מ"מ זיהוי, 5 μm, סי18 עמודה המצורפת מחסנית המאבטח סי18 (4.0 x 3.0 מ"מ זיהוי) עם הדרגתי של 0.1% פורמית חומצה ומתנול.
    1. השתמש בתוכנית מעבר הצבע הבאה: מ -0 עד 25 דקות, 0 עד 18% מתנול; בין 25 ל -27 דקות, 18 עד 0% מתנול; מ -27 עד 37 דקות, 0% מתנול) בקצב זרימה של 1 מ"ל/min ו-30 ° c.
    2. הכנס 5 μL של כל דוגמה שנשמרה עבור 2 '-deoxynucleosides לכימות.
    3. הגדר את גלאי האב ב 260 ננומטר לאינטגרציה של הפסגות של dGuo ודדו.

10. קוונפיקציה של נגעים DNA

  1. לשלב את הפסגות של 8-oxodGuo, [15n5] 8-oxodguo, 1,N6-εdAdo, [15n5] 1,n6-εdAdo, 1,n2-εdGuo, ו [15N5] 1,n2 -εdGuo מן הבדיקות-בדיקות-בדיקות ms/ms.
    1. חישוב יחסי האזור של 8-oxodGuo/[15N5] 8-oxodguo, 1,n6-εdAdo/[15N5] 1,n6-εdAdo, ו-1,n2-εdGuo/[15N5 ] 1,N2-εdGuo עבור עקומות הכיול והדגימות.
    2. התווה את עקומות הכיול באמצעות יחסי האזור המתקבלים בשלב 10.1.1 בציר y וכמויות האנליטים הקיימות בכל נקודה בציר ה-x.
    3. לחשב את הסכומים (fmol) של נגעים בכל מדגם מוזרק באמצעות היחס מחושב בשלב 10.1.1 ועקומות כיול של צעד 10.1.2.
  2. לשלב את הפסגות של dGuo ודדו מניתוח הבדיקות-UV.
    1. התווה את עקומות הכיול באמצעות האזורים המתקבלים בשלב 10.2 בציר y וכמויות האנליטים הקיימות בכל נקודה בציר ה-x.
    2. חישוב הסכומים (nmol) של dGuo ו-דאדו בכל מדגם מוזרק באמצעות האזורים המתקבלים בשלב 10.2 ובעקומות הכיול של שלב 10.2.1.
  3. לחשב את הסכומים (nmol) של dGuo ו-דאדו הנמצאים בכל מדגם מוזרק במערכת בדיקת מערכת מערכות מחשב-ESI-MS/MS, בהתחשב בכך את הסכומים שחושבו בשלב 10.2.2 נמצאים בנפח המדגם של 5 μL, בעוד 50 μL הוזרקו במערכת ה-ESI-MS/MS.
    הערה: כדי לחשב את כמות ה-dGuo בדגימות המשמשות לניתוח 8-oxodGuo, הכפל את הסכום (nmol/μL) שהתקבל בשלב 10.2.2 על-ידי 50. כדי לחשב את כמויות של דדו ו-dGuo בדגימות המשמשות ניתוח של 1,n6-εdAdo ו-1,n2-εdGuo, לשקול את שלב הריכוז לאחר הפקת שלב מוצק. הנפח של 50 μL מוזרק במערכת בדיקת מערכות מקוריות-ESI/MS מקביל ל 114.32 μL של המדגם המקורי. הסכומים (nmol/μL) שהתקבלו בשלב 10.2.2 יש להכפיל על-ידי 114.32 כדי לקבל את הערכים הנכונים.
  4. חישוב השברים הטוחנת 8-oxodGuo/dGuo, 1,N6-εdAdo/דדו, 1,n2-εdGuo/dguo. היחס (לפני הפצע/לפני הפגיעה) מעניקים את מספר הנגעים לכל 10שישה מדורי dguo רגילים או לדדו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ריכוזי ה-DNA הממוצעים (± SD) שהתקבלו מהכבד של עכברים (~ 1 גרם רקמה), ריאה (~ 0.2 g רקמות) וכליות (~ 0.4 g רקמות) היו, בהתאמה, 5,068 ± 2,615, 4,369 ± 1,021, ו 3,223 ± 723 μg/mL בנפח הסופי של 200 μL. כרומאטוגרמה ייצוגית המתקבלת על ידי בדיקות-אבא של ה-DNA מטוהרים מוצג באיור 3. הנוכחות של ארבעת 2 '-deoxynucleosides, ללא RNA ribonucleosides, אשר באופן מיידי לפני המקבילה 2 '-deoxynucleosides, מדגים את טוהר ה-DNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעיה מרכזית הנמצאת בניתוח 8-oxodguo על-ידי שיטות הבדיקות היא האינדוקציה האפשרית של הקמתה במהלך הליכי בדיקות של חילוץ dna, dna הידרוליזה, וריכוז של ה-dna הידרוליטים22,38. כדי למזער את הבעיה של היווצרות העובדתי של 8-oxodguo, מומלץ התוספת של דפרוקסמין לכל הפקת DNA, אחסון והידרוליזה פתרונות, השימוש בשיטת הנתרן יודידה chaotropic והימנעות פנול בחילוץ DNA, כמו גם השימוש של כמויות DNA קרוב 100 μg בהליך הידרוליזה כדי למזער את התרומה של חמצון מלאכותי לתוצאה הסופית

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

FAPESP (המלון מבצע את הצ דה סאו פאולו, הליך 2012/22190-3 ו-2012/08616-8), CNPq (הליך 454214/2014-6 ו-429184/2016-6), שכמיות, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa האוניברסיטה דה סאו פאולו), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FAPESP/גלימות/ כפיר/פאפאג/FAPESP; הליך 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/שכמיות; שגרה. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; שגרה. 2011.1.9352.1.8) ו-CEPID Redoxoma (FAPESP; הליך. 2013/07937-8). ט. פ. אוליביירה ו-a. A. A. A. אוליביירה קיבל מלגות FAPESP (הליך. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) ו שכמיות (מפואר ביותר). מ. ה. ג. מדיירוס, פ. די Mascio, פ. נ. סאלדיווה, וא. פ. לוברו קיבל מלגות מ-CNPq.

חלק מהדמויות והטבלאות הקיימות בעבודה זו פורסמו במקור ב-אוליביירה A.A.F. et al. ההשפעות של הגנוזים ואפיגנוטוקסיונים בעכברים חשופים לחומר הסביבתי מרוכז חלקיקים עדינים (PM2.5) מסאו פאולו סיטי, ברזיל. חלקיקים וסיבי טוקסיקולוגיה 15, 40 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[15N5]-2'-deoxyadenosineCambridge Isotope LaboratoriesNLM-3895-25
[15N5]-2'-deoxyguanosineCambridge Isotope LaboratoriesNLM-3899-CA-10
אצטוניטרילקרלו ארבה ריאגנטים412413000
אלקליין פוספטאז מרירית המעי של בקרסיגמאP5521
אמוניום אצטטMerck101116
תמיסת תימוס עגל DNASigmaD1501
תמיסת ליזיס תאיםQIAGEN158908
כלורופורםקרלו ארבה ריאגנטים412653
דפרוקסאמיןסיגמאD9533
דאוקסיריבונוקלאז I (DNase I)Bio Basic IncDD0649
אתנולריאגנטים של קרלו ארבה414542
חומצה פורמיתSigma-AldrichF0507
מערכת HPLC-ESI-MS/MS HPLC: סדרת Agilent 1200                      ESI-MS/MS: מכשירי Applied Biosystems/MDS Sciex HPLC: משאבה בינארית (G1312B), משאבה איזוקרטית (G1310A), תנור עמודים עם שסתום מיתוג עמודים (G1316B), גלאי מערך דיודות (G1315C), דגימה אוטומטית (G1367C).                                                                                                                      ESI-MS/MS: ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים מרובעת ליניארית, דגם 4000 QTRAP.
מערכת HPLC/DADShimadzuשתי משאבות (LC-20AT), גלאי מערך דיודות צילום (DAD-20AV), מזרק אוטומטי (Proeminence SIL-20AC), תנור עמודה (CTO-10AS/VP)
עמודת HPLC (50 x 2.0 מ"מ מזהה זהה, 2.5 ומיקרו; m, C18)Phenomenex00B-4446-B0
עמודת HPLC (150 x 2.0 מ"מ מזהה זהה, 3.0 ומיקרו; m, C18)עמודת HPLC Phenomenex00F-4251-B0
(250 x 4.6 מ"מ מזהה זהה, 5.0 ומיקרו; m, C18)Phenomenex00G-4252-E0
HPLC C18 (4.0 x 3.0 מ"מ זהה)PhenomenexAJO-4287
איזואמיל אלכוהולסיגמא-אולדריץ'M32658
איזופרופיל אלכוהול (איזופרופנול)קרלו ארבה ריאגנטיםA412790010
קטמיןCevaשם מסחרי: דופלן
מגנזיום כלורידקרלו ארבה ריאגנטים349377
מגנזיום כלורידסיגמאM2393
מתנולקרלו ארבה ריאגנטיםL022909K7
פוספודיאסטראז I מ-Crotalus atroxSigmaP4506
תמיסת משקעים חלבוןQIAGEN158912
פרוטאינאז KSigma-AldrichP2308
ריבונוקלאז ASigmaR5000
נתרן כלורידסיגמא-אולדריץ'S9625
SPE-C18 (Strata-X)פנומנקס8B-S100-TAK
טריס (הידרוקסימתיל)-אמינומתאןקרלו ארבה ריאגנטים489983
קסילזיןSyntec do Brasilשם מסחרי: Xilazin
מחסנית מגן אבטחה

מקורות

  1. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
  4. Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
  5. Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
  6. Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
  7. Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
  8. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
  9. Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. , John Wiley & Sons. UK. (2015).
  10. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
  11. Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
  12. Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
  13. Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
  14. Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
  15. Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
  16. Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
  17. Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
  18. Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. , 69-76 (2017).
  19. Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
  20. Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
  21. Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
  22. Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
  23. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
  24. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
  25. Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
  26. Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
  27. Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
  28. Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
  29. Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
  30. IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
  31. De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
  32. Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
  33. Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
  34. Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40(2018).
  35. Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
  36. Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
  37. Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
  38. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
  39. Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
  40. Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
  41. Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
  42. Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
  43. Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
  44. Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
  45. Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
  46. Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
  47. Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
  48. Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
  49. Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
  50. Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
  51. Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HPLC ESI MS MSDNA8 OxodGuoDNAPM2 5
קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.