מאמר שיטה

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

13K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59750

⸱

20 ביולי 2019

 , 
1Neural Circuits Research Group, Korea Brain Research Institute

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

תקציר

מארגני הסלולר, כגון רשתית המיטובית והאנדופלמיק (ER), יוצרים רשת לביצוע מגוון פונקציות. מבנים אלה מעוקל במיוחד מקופלים לצורות שונות כדי ליצור רשת דינמית בהתאם לתנאים הסלולריים. הדמיה של רשת זו בין המיטוגרם ו-ER כבר ניסה להשתמש ברזולוציה סופר פלואורסצנטית הדמיה ומיקרוסקופ אור; עם זאת, הרזולוציה המוגבלת אינה מספיקה להתבונן בקרומים שבין המיטו, ו-ER בפרוטרוט. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור מספק ניגודיות ממברנה טובה רזולוציה בקנה מידה ננו להתבוננות של אורגלים סלולריים; עם זאת, היא צורכת זמן רב במיוחד כאשר מעריכים את מבנה תלת-מימדי (3D) של אורגלים מעוקלים במיוחד. לכן, הבחנו במבנה של המיטוסקופיה ו-ER באמצעות מיקרוסקופ האור אלקטרון (קלם) וטכניקות המיקרוסקופיה אלקטרונים באמצעות ascorbate peroxidase 2 משופר ומחזרת peroxidase צביעת. שיטה מכתימה בלוקים, מיקרוסקופ סדרתי דק (טומוגרפיה ממוחשבת), והמיקרוסקופיה אלקטרונית של אמצעי האחסון הוחלו כדי להתבונן במבנה התלת-ממדי. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שילוב של המיקרוסקופיה אלקטרון תלת-ממד כדי לבצע מחקרים מבניים מפורטים של המיטולוגיה ו-ER.

מבוא

הרשת המיטו, והאנדופלזמית (ER) הן ממברנות סלולאריים מאוגדות. החיבור שלהם הכרחי עבור תפקידם, וחלבונים הקשורים לרשת שלהם תוארו1. המרחק בין המיטוגרם ו-ER דווח כ 100 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אור2; עם זאת, מיקרוסקופ סופר ברזולוציה האחרונות3 ו מיקרוסקופ אלקטרוני (EM)4 מחקרים חשפו אותו להיות קטן במידה ניכרת, על כ 10-25 ננומטר. הרזולוציה שהושגה במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר נמוכה מ-EM, ותיוג ספציפי הוא הכרחי. EM היא טכניקה מתאימה כדי להשיג ניגודיות ברזולוציה גבוהה מספיק עבור מחקרים מבניים של הקשרים בין מיטוכונמיטוa ו-ER. עם זאת, חיסרון הוא המידע המוגבל של ציר z מכיוון שהסעיפים הדקים חייבים להיות כ-60 ננומטר או דק יותר עבור מיקרוסקופ אלקטרוני שידור קונבנציונאלי (TEM). עבור הדמיה מספקת של ציר EM z, מיקרוסקופ אלקטרוני תלת מימדי (3DEM) ניתן להשתמש5. עם זאת, זה כולל הכנת מאות חלקים סידוריים דקים של תאים שלמים, וזה עבודה מסובכת מאוד שרק כמה טכנולוגים מיומנים שולט. קטעים דקים אלה נאספים על הסרט formvar שברירי מצופה ברשתות TEM אחד-חור. אם הסרט נשבר על בחורה אחת, הדמיה טורית ושחזור נפח אינו אפשרי. בלוק סדרתי הסורק מיקרוסקופ אלקטרונים (SBEM) היא טכניקה פופולרית עבור 3DEM המשתמשת הרסני בלוקים בתוך המיקרוסקופ אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) תא ואקום עם סכין יהלום או (דיכ-SBEM) או קרן יון ממוקדת (פרפור-SEM) 6. עם זאת, כיוון שטכניקות אלה אינן זמינות בכל המתקנים, אנו ממליצים על מערך טומוגרפיה7 באמצעות הגנות סדרתיות ו-SEM. In מערך טומוגרפיה, מקטעים סידוריים לגזור באמצעות ultramicrotome מועברים שמיכות זכוכית במקום רשת TEM ודמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור SEM8. כדי לשפר את האות עבור הדמיה לאחור (bse) להדמיה, אנו מנוצלים באמצעות שימוש בפרוטוקול של כתמי EM באמצעות השימוש אוסמיום tetroxide (OsO4)-תאים קבועים עם osmi, thiolic הידרזידה (TCH)9, המאפשר לנו להשיג תמונות ללא כתמים כפולים שלאחר ההטבעה.

בנוסף, סמן מיטוכונדריאלי SCO1 (ציטוכרום c אוקסידאז הרכבה חלבון 1) – ascorbate peroxidase 2 (APEX2)10 תג מולקולרי שימש להמחיש המיטו, ברמת EM. APEX2 הוא כ 28 kDa ונגזר מ סויה ascorbate peroxidase11. זה פותחה כדי להראות את המיקום המפורט של חלבונים ספציפיים ברמה EM באותו אופן שבו חלבון פלורסנט ירוק מתויג חלבונים משמש במיקרוסקופ אור. APEX2 ממירה 3, 3 '-diaminobenzidine (בתוספת) לתוך פולימר מסיסים אוסמיפילית באתר של התג בנוכחות מימן הקופמי חמצן (H2O2). APEX2 יכול לשמש כחלופה לתיוג נוגדנים מסורתיים EM, עם לוקליזציה חלבון לאורך כל העומק של התא כולו. במילים אחרות, חלבון APEX2 מתויג יכול להיות מדמיינו על ידי ספציפי osmication11 ללא התוויות חיסוני והחדירות לאחר ההקפאה האולטרה. חזרת peroxidase (HRP) הוא גם תג רגיש אשר מזרז את ה-H2O התלויים החומר של התוספת לתוך מהפך מקומי, מתן ניגודיות EM לאחר הטיפול עם OsO4. רצף פפטיד היעד של המטרה HRP-KDEL (ליס-asp-לגלו-leu)12 הוחל על הדמיה של ER בתוך תא שלם. כדי להעריך את הפרוטוקול שלנו של ניצול התגים הגנטיים ואת הגוש בלוקים עם אוסמיום מופחת ו TCH (שיטת roto), באמצעות אפקט osmication באותו זמן, השוונו את הניגודיות הממברנה עם וללא שימוש של כל תג גנטי ב-roto בלוק בלוקים. למרות 3DEM עם טומוגרפיה מערך ו מכתים את השילוב עם איפקס ו HRP יש, בהתאמה, היה מנוצל למטרות אחרות, הפרוטוקול שלנו הוא ייחודי כי יש לנו מערך טומוגרפיה משולבת עבור 3DEM ו-מכתים את השילוב של המיטו, ותיוג ER. באופן ספציפי, הראנו חמישה תאים עם ובלי הגנים מתויגים איפקס באותו סעיף, אשר סייעה בחקירת ההשפעה של השינוי הגנטי על תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות התא עם מיכל התרבות בדוגמת הרשת ומעבר תאים עם SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL וקטור.

  1. Seed 1 x 105 HEK293T תאים על-ידי הצבת אותם לתוך 35-mm זכוכית מנות התחתית התרבות באווירה מחולל לחות המכיל 5% CO2 ב 37 ° צ' ב בינונית שונה של הנשר של דולבCO (dmem) שיושלם עם 10% סרום שור עוברי, 100 U/mL פניצילין, ו 100 U/mL סטרפטומיצין.
  2. יום לאחר זריעת התאים, כאשר הם גדלו ל 50%-60% שליטה, להציג את SCO1-APEX210 ו hrp-kdel12 פלאמיד לתאים באמצעות מגיב החצייה על פי הוראות היצרן (SCO1-APEX2 cdna 0.5 μg + HRP-KDEL-DNA 0.5 μg לכל 3 מגיב μrfl.

2. מיקרוסקופ אור של תאים הגדלים על מנות תרבות בדוגמת וצביעת לAPEX2 ו HRP

  1. ב 16-24 h לאחר ההעברה, להסיר את כל התקשורת התרבותית ומיד להוסיף 250 μL של חם (30-37 ° c) פתרון קיבעון (שולחן 1) על ידי ליטוף עדין. להסיר מיד את הפתרון קיבעון ולהחליף אותו עם 1.5 mL של פתרון קיבעון טרי. דגירה על קרח עבור 60 דקות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד ב 1 מ ל של קרח קר 0.1 M נתרן קאבאיחור מאגר (שולחן 1).
    התראה: אדי אלדהיד רעילים מאוד. בצע את כל העבודה תחת כיסוי מאוורר.
  2. הוסף 1 מ ל של קר (0-4 ° c) 20 מ"מ תמיסת גליסין ו-דגירה עבור 10 דקות על הקרח ואחריו שלוש שוטף של 5 דקות כל אחד מ-mL של קר 0.1 M נתרן קאבישופות מאגר.
  3. הכנת פתרון מרענן של 1 x (3.33 mL של 0.3 M הפתרון השני של הקהשני + 10 μL של 30% H2O2 + 5.67 mL של מים קרים + 1 מ"ל 10x בתוך הפתרון).
  4. הוסף 500 μL של הפתרון הטרי בגודל 1x המוכן (שלב 2.3) ו-דגירה על הקרח במשך כ 5-45 דקות עד כתם חום בהיר גלוי תחת מיקרוסקופ אור הפוכה (איור 1X).
  5. להסיר בעדינות את הפתרון לטפוח ולשטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של קר 0.1 M נתרן קא, מאגר בזמן האחרון עבור 10 דקות כל אחד.
  6. השתמש במיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות פאזה (או מיקרוסקופ אור בהיר) כדי להמחיש את הצביעת הסיביות בהגדלה של 100x או יותר. השתמש בעט סמן כדי לסמן את החלק התחתון של הזכוכית שבה אזור הריבית (ROI) ממוקם (איור 1B, C).

3. הכנה לדוגמא לבלוק EM

  1. ביצוע תרבות התאים וצביעת לטיפה כמתואר בשלבים 2.1-2.6.
  2. לאחר לתקן את הדגימות עם 1 mL של 2% מופחת OsO4 עבור 1 h ב 4 ° c.
    התראה: יוסו4 האדים הם רעילים מאוד. בצע את כל העבודה תחת כיסוי מאוורר.
  3. הכינו פתרון TCH חדש (טבלה 1) במהלך שלב 3.2 ולעבור דרך מסנן 0.22-μm.
    התראה: אדי TCH רעילים מאוד. בצע את כל העבודה תחת כיסוי מאוורר.
  4. הסר את הקבע ושטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT).
  5. מניחים את התאים ב 1 מ ל של פתרון TCH בעבר מוכן מסונן עבור 20 דקות ב RT.
  6. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
  7. לחשוף את התאים פעם שנייה ל 1 מ ל 2% אוסמיום tetroxide במים מזוקקים עבור 30 דקות ב RT.
  8. הסר את הקבע ושטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד ב-RT. הוסף 1 ml של 1% uranyl אצטט (ימית), ולעזוב את הלילה ב 4 ° c בחושך.
  9. לשטוף את התאים שלוש פעמים 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
  10. הפתרון המוביל של וולטון לפני החום (שולחן 1) בתנור ב 60 ° c עבור 30 דקות.
  11. הכתם את התאים עם הפתרון המוביל של וולטון על ידי הוספת 1 מ ל של הפתרון טרום מחומם להוביל העופרת, ולאחר מכן מניחים בתנור עבור 30 דקות ב 60 ° c.
  12. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
  13. מודטה בסדרה מדורגת של 2-mL האתנול האקאביטים (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) עבור 20 דקות כל אחד ב-RT.
  14. Decant האתנול ואת הדגירה עבור 30 דקות ב 1 מ ל של 3:1 אתנול: צמיגות נמוכה הטבעה תערובת בינונית ב RT.
  15. הסר את המדיום ולהוסיף 1 מ ל של 1:1 אתנול: צמיגות נמוכה הטבעה תערובת בינונית. דגירה עבור 30 דקות ב RT.
  16. הסר את המדיום ולהוסיף 1 מ ל של 1:3 אתנול: צמיגות נמוכה הטבעה תערובת בינונית. דגירה עבור 30 דקות ב RT.
  17. הסר את המדיום והוסף 1 mL של 100% מדיום הטבעה בצמיגות נמוכה ו-דגירה לילה.
  18. להטביע את המדגם ב 100% הטבעה בצמיגות נמוכה תערובת והדגירה עבור 24 h ב 60 ° c.
  19. הכן 90-ננומטר מקטעים עבים באמצעות בדיקת אולטרה-מיקרוטומה.
  20. צפו ברשת תחת TEM ב 200 kV.

4. סדרתי והרכבה על indium-בדיל-תחמוצת מצופה שמיכות עבור הדמיה SEM

  1. הכנת מצע
    1. נקיון indium-בדיל-תחמוצת (איטו)-מצופה זכוכית שמיכות (22 מ"מ x 22 מ"מ) על ידי עצבנות עדינה ב איזופנול עבור 30-60 s.
    2. להסיר את הכיסויים, לנקז את עודף איזופנול, ולהשאיר בסביבה ללא אבק עד יבש.
    3. פנקו את שמיכות זכוכית מצופה איטו על ידי הפרשות זוהר באמצעות מתאם פלזמה עבור 1 דקות.
      הערה: הפעלת פלזמה מהווה מאפיין הידרופילי על פני המצע. זה יוצר סרט דק מאוד של מים על מצע כדי למנוע את היווצרות קמט בסעיפים כאשר המקטע מחובר המצע.
    4. הכנס את כיסוי הזכוכית מצופה איטו לתוך מחזיק המצע, ומקום לתוך הסירה הסכין.
  2. חיתוך של בלוק המדגם והחסימה הטורית
    1. הכנס את בלוק המדגם לתוך מחזיק המדגם של האולטרה-מיקרוטומה והגדר לבלוק הגזם.
    2. השתמש להב גילוח כדי לקצץ את כל שרף עודף סביב מיקום היעד (מזוהה בשלב 2.6, איור 1D-G). צורת פני הבלוק צריכה להיות טרפז או מלבני. הקצה המוביל והקצה הנגרר חייבים להיות מקבילים באופן מוחלט (איור 1H, I).
    3. הכנס את מחזיק המדגם על זרועו של האולטרה מיקרוטומה ומניחים את סכין היהלום במחזיק הסכין. הכנס את שמיכות הזכוכית של ה-ITO לתוך מוביל הכלים והצמד את המנשא לידית (איור 1J). הגדר את מוביל הסרט לתוך סירת הסכין ולמלא את סירת הסכין עם מים מזוקקים מסוננים (איור 1K).
    4. כוונן את תנוחת המנשא עם שקופית הסכין על ידי דחיפת בזהירות של ידית המחזיק כדי לקבוע את הקצה של הזכוכית האיטו קרוב לסכין (איור 1L).
    5. לאחר גזירת הקטע, עצרו את התהליך הרציף, ופתחו באיטיות את הבורג ההידוק של הצינור וסוחטים את סירת המים (קצב הזרימה של טיפת מים אחת לשנייה).
    6. לאחר השלמת תהליך איסוף הכלים, הסר את המצע עם ידית האחיזה של המכשיר וייבש את רצועת הכלים (איור 1M).

5. הדמיה של ה-SEM והיישור של מחסנית תמונת ה-SEM

  1. הר את שמיכות מצופה איטו על רכיבי אלומיניום עם נייר דבק דביק. חותם את משטח הזכוכית ואת פני השטח בשארית עם נייר דבק דביק, ואז מעיל עם שכבת פחמן עבה 10 ננומטר (איור 1N).
  2. שים לב שמיכות מצופה איטו ב פליטת שדה SEM במתח האצה נמוך של 5 kV ו מרחק עבודה מתאים לאוסף יעיל של BSEs.
  3. יבא את התמונות הטוריות לתוכנת Image J (פיג'י)13 באמצעות האפשרות ' מחסנית וירטואלית '. פתח מקטע חדש14, ויבא את מחסנית התמונה לתוך trakem. לחצו על לחצן העכבר הימני ובחרו בתפריט ' יישור '.
  4. לאחר מכן בחרו בטווח התמונה (מהתמונה הראשונה לתמונה האחרונה). סיימו את היישור האוטומטי, שמרו את ערכת הנתונים המיושרת ובחרו ' ייצוא ' להידור תמונה שטוחה מטווח התמונה שנבחר (מהתמונה הראשונה לתמונה האחרונה). לבסוף, שמרו את נתוני התמונה השטוחים בתבנית AVI בתפריט הראשי של Image J.
    הערה: סרט משלים 1 הסרט המשלים 2 להראות את מחסנית התמונה SEM ומחסנית תמונה חתוכה, בהתאמה.

6. פילוח של המיטומטר ו-ER מתמונות סדרתיות

  1. הפעל את 3dmod ב-IMOD15 תוכנה וקבצי תמונה פתוחים.
  2. בחלון ZaP, צייר את המתאר של המיטו, ו-ER באמצעות לחצן העכבר האמצעי.
  3. כדי להמחיש את אמצעי האחסון המקוקף, פתח את חלון תצוגת הדגם (סרט משלים 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מתאר את לוח הזמנים וזרימת העבודה עבור פרוטוקול זה. הפרוטוקול דורש 7 ימים; עם זאת, בהתאם לזמן שהושקע על הדמיה SEM, זה עשוי להגדיל. עבור העברה של תא, השטף של התאים צריך להיות נשלט כדי לא לכסות את החלק התחתון של לוח הרשת כולו (איור 1A). צפיפות תא גבוהה עלולה למנוע זיהוי של תא הריבית במיקרוסקופ אור והתבוננות ב-EM. השתמשנו גנטית מתויג פלמידים כי הביע APEX2 ו HRP לבחור ביעילות בתאים מזוהמים בין תאים תרבותיים רבים בצלחת התרבות. אנו מתורבתים HEK293T תאים ואישר את הביטוי של SCO1 מקושרים AP...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קביעת הלוקליזציה התאית של חלבונים ספציפיים ברזולוציית ננומטר באמצעות EM היא חיונית כדי להבין את הפונקציות הסלולר של חלבונים. בדרך כלל, ישנן שתי טכניקות ללמוד לוקליזציה של חלבון היעד באמצעות EM. אחת היא טכניקת החיסוני זהב, אשר נעשה שימוש EM מאז 1960, והשני הוא טכניקה באמצעות לאחרונה פיתח תגים מקודד גנטית16. שיטות האנטי מסורתיות שהיו מועסקים נוגדנים-חלקיקי זהב או נקודות קוונטיות כדי להראות את המיקום של החלבון המסומן. עם זאת, בשל הדרישה של נוגדנים באיכות גבוהה ואת יעילות החדירה של נוגדנים מושפע שרף ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

מחקר זה נתמך על ידי התוכנית מחקר בסיסי של KBRI באמצעות קוריאה מכון מחקר המוח ממומן על ידי משרד המדע והתקשוב (19-BR-01-08), וקרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (לא. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL פלמידס המסופקים באדיבות היאן-וו רי (האוניברסיטה הלאומית של סאול). נתוני TEM נרכשו בבית מחקר המוח מתקנים ליבה ב KBRI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
GlutaraldehydeEMS16200השתמש רק במכסה אדים
ParaformaldehydeEMS19210השתמש רק במכסה אדים
נתרן קקודילאטEMS12300
אוסמיום טטרוקסיד 4% תמיסה מימיתEMS16320השתמש רק במכסה אדים
Epon 812EMS14120EMbed 812- 20 מ"ל / DDSA- 16 מ"ל / NMA - 8 מ"ל / DMP-30 - 0.8 מ"ל
אולטרה מיקרוטום Leica ARTOS 3DLeicaARTOS 3D
Uranyl acetateEMS22400כימי מסוכן
עופרת ציטראטEMS17900
35 מ"מ צלחת כיסוי מרושתתMattekP35G-1.5-14-CGRD
מפרק זוהרPelcoeasiGlow
Formvar מצופה פחמן רשתנחושתטד פלה01805-F
חומצה הידרוכלוריתSIGMA258148
Fugene HDPromegaE2311
GlycineSIGMAG8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)SIGMAD8001כימיקל מסוכן
30% תמיסת מי חמצןMerck107210
אשלגן הקסציאנופראט (II) טריהידרטSIGMAP3289
0.22 אום מסנן מזרקSartorius16534
ThiocarbonyldihydrazideSIGMA223220השתמש רק במכסה אדים
אשלגן הידרוקסידFluka10193426
חומצה L-אספרטיתSIGMAA9256
אתנולMerck100983
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורFEITecnai G2
תחמוצת פח אינדיום (ITO) כיסויי זכוכית מצופיםSPI06489-ABזכוכית שברית
איזופרופנולפישר BioreagentsBP2618-1
סכין יהלוםLeicaAT-4
מיקרוסקופ אור מושרשNikonECLipse TS100
מיקרוסקופ אלקטרונים סורקZeissAuriga

מקורות

  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623(2017).
  3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  4. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
  5. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
  6. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  7. Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
  8. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  9. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  10. Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011(2012).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).
  17. Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
  18. Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
  19. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923(2015).
  20. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).
  21. Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764(2013).
  22. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
  23. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  24. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Peroxidase 2En Bloc

מאמרים קשורים