מאמר שיטה

שימוש מיקרו רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת עם חומצה Phosphotungstic הכנה לדמיין את רקמת האדם האנושי

DOI:

10.3791/59752

⸱

5 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, Anesthesia and Pain Research Institute, Yonsei University College of Medicine, 3Surgical Anatomy Education Centre at the Yonsei University College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיה ממוחשבת של קרני רנטגן יעילה בהשגת מידע תלת מימדי מדגימות אנושיות שאינן בשימוש, אך הצלחה מוגבלת בהתבוננות ברקמות רכות. השימוש של סוכן phosphotungstic בניגוד חומצה יכול לפתור את הבעיה. אנו ליישם את הסוכן הניגוד הזה כדי לבחון את רקמות הרקמה העדינה האנושית (הרצועה התמך שחוגי).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח ידני ותצפית היסטולוגית הן שיטות נפוצות המשמשות לחקירת רקמות אנושיות. עם זאת, ניתוח ידני יכול לפגוע במבנים עדינים, בעוד עיבוד היסטולוגית התבוננות לספק מידע מוגבל באמצעות הדמיה חוצת-חתך. מיקרו רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (microCT) הוא כלי יעיל להשגת מידע תלת מימדי ללא פגיעה בדגימות. עם זאת, הוא מראה יעילות מוגבלת בהבחנה חלקי רקמה רכה. השימוש של גורמים לשיפור ניגודיות, כמו חומצה phosphotungstic (וועד ההורים), יכול לפתור בעיה זו על ידי שיפור ניגודיות רקמות רכות. הגענו ל-microCT עם וועד ההורים לחקור את רצועה התמך של האדם (בזן), שהוא מבנה עדין באזור המסלול. בשיטה זו, דגימות שנקטפו קבוע בפורמאלין, יבשים פתרונות אתנול סדרתי, ומוכתם עם פתרון הורים. לאחר כתמים, סריקת microCT, שחזור תלת-ממדי וניתוח מתבצעים. העור, הרצועות, והשרירים ניתן לדמיין בבירור באמצעות שיטה זו. גודל הדגימה והמשך של כתמים הם תכונות חיוניות של השיטה. עובי הדגימה המתאים היה כ-5 – 7 מ"מ, שמעליה התהליך הואט, והמשך האופטימלי היה 5 – 7 ימים, מתחתיו חור ריק באזור המרכזי התרחש מדי פעם. כדי לשמור על המיקום והכיוון של חתיכות קטנות במהלך חיתוך, תפירה על אותו אזור של כל חלק מומלץ. יתר על כן, ניתוחים ראשוניים של המבנה האנטומי נחוצים כדי לזהות בצורה נכונה כל פיסת. Parafilm יכול לשמש כדי למנוע ייבוש, אבל אכפת צריך לנקוט כדי למנוע עיוות הדגימה. התצפית הרב-כיוונית שלנו הראתה כי בזן מורכב מעבודה בעלת שכבות רב של צלחות רציפות, במקום סיבים כמו חוטים, כפי שדווחו קודם לכן. תוצאות אלה מרמזות כי סריקת microCT עם וועד ההורים היא שימושית לבדיקת תאים ספציפיים בתוך מבנים מורכבים של רקמת האדם. זה יכול להיות מועיל בניתוחים של רקמות סרטן, רקמות עצבים, ואיברים שונים, כמו הלב והכבד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח ידני ותצפית היסטולוגית משמשים בדרך כלל לבדיקת רקמות אנושיות, כגון שרירים ורקמות חיבור. עם זאת, ניתוח ידני יכול בקלות לפגוע במבנים עדינים, התבוננות היסטולוגית מספקת מידע מוגבל על משטחיםשטוחיםבחתךמשני1, 2. לכן, יש צורך בשיטות משופרות לבדיקת רקמות באופן מדויק ויעיל יותר.

טומוגרפיה ממוחשבת קונבנציונאלי (CT) משמשת בדרך כלל בפרקטיקה קלינית, אך חסרה לו היכולת להבחין בין מבנים קטנים2,3. מיקרו X-ray CT (microCT) הוא כלי יעיל להשגת מידע תלת מימדי (3D) של מבנים קטנים מדגימות, מבלי להרוס אותם. עם זאת, microCT יש יישומים מוגבלים, כי רק רקמות צפופות ניתן לדמיין בבירור; אין אפשרות להשתמש בה כדי להבדיל בין רקמות רכות. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להשתמש בחומרים מכתיבי. הגורמים לשיפור ניגודיות, כמו phosphotungstic חומצה (ועד ההורים), חומצה פוספומפוליב, ו יוד של lugol, לשפר את שיעור ניגודיות רך רקמות במהלך סריקת4,5. מספר מחקרים השוואת סוכנים אלה מראים כי הורים מדגים ביצועים טובים קל לטפל6,7,8.

(בזן) הוא מבנה עדין סביב המסלול, שניתן לפגוע בו בקלות במהלך התצפית המקובלת9. בדקנו ובהצלחה הצלחנו לאחזר מידע תלת-ממדי על מבנה זה באמצעות microCT עם הורים כסוכן ניגודיות. ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים על רקמות אנושיות אחרות, כגון הלב והכבד, עם שינויים מתאימים10,11,12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל גופות שנוצלו במחקר זה נתרמו באופן חוקי למרכז לחינוך האנטומיה כירורגי באוניברסיטת יונסיי המכללה לרפואה.

1. קבלת דגימות

  1. לצייר קו החתך על הגופה עם עיפרון צבעוני כדי לציין את אזור חיתוך לקציר דגימה. בדוק כי קו החתך נמשך מתרחב באופן מיידי על canthus האמצעי, מהצד האחר כדי canthus לרוחב, העליון לגבול מעולה של העפעף התחתון, ו-1 ס מ מתחת לקו מן השפה מסלולית.
    הערה: שקול את גודל המדגם המבוסס על גודל הסריקה המקסימלי של ציוד ה-micro-CT (הציוד שלנו יכול לרכוש תמונה עם ממד האובייקט המרבי של 7 × 7 ס מ). כאן, דוגמה כ 1 ס מ רוחב, 3 ס"מ אורך, ו 1.25 גרם משקל נקצרו מאזור בזן.
  2. חותכים את רקמות הפנים. בעקבות קו החתך עם להב ודאו שהחתך עמוק, כך שקצה הלהב נוגע בעצם. המדגם חייב לכלול את העור, רקמה תת עורית, שריר, שומן, וקרום.
  3. תקן את המדגם ב 10% פורמלין באופן מיידי ולשמור אותו עבור 5 עד 7 ימים בטמפרטורת החדר (איור 1a).
    הערה: ניתן להשתמש בשתי הגופות החנוטים והנקיים עבור מחקר זה. עם זאת, פתרון הקיבעון עבור גוויות עשוי להיות שונה מעט מהפתרון המשמש בניסוי ביולוגי. לכן, אנו מציעים לתקן את המדגם עם 10% פורמאלין שוב, גם לאחר קבלת המדגם של גופות חנוטים.

2. הכנה לצביעת

  1. לאחר התיקון, פורסים את המדגם לתוך 3 חתיכות (5 – 7 מ"מ עובי). אין לאבד את המיקום והכיוון של כל פיסת במהלך תהליך זה.
    הערה: הסורק microCT אנו משתמשים יכול לכסות את הגודל המרבי של 7 cm³, אבל פתרון הורים לא יכול לחדור את המדגם בהצלחה אם הוא עבה מדי.
  2. לתפור את הצד superolateral של כל פיסת באמצעות מחט שחור חוט כגון הכיוון של המדגם ניתן לבדוק מאוחר יותר.
  3. הפחתת המדגם בסדרה של 30%, 50%, ו 70% אתנול פתרונות עבור יום אחד כל אחד.
  4. מניחים את המדגם ב 70% אתנול עד לצביעת.

3. הכנה להורים

  1. התחל את תהליך הצביעת של הורים שבוע לפני תזמון סריקת microCT.
  2. להכין 210 mL של 70% אתנול פתרון ולהוסיף 2.1 g של כוח הורים לו. מערבבים היטב באמצעות שייקר ב 55-60 סל ד.
    הערה: ריכוז הפתרון של וועד ההורים אמור להיות 1% באתנול.
  3. הכינו 3 70 מכולות פלסטיק עבור כל פריט חתוך. מלא את המכלים. בתמיסה של ועד ההורים להשרות את הדגימות לתוך המכולות ולמקם אותם על שייקר לחדירה יעילה. השאירו את הדגימות במשך 5 – 7 ימים (איור 1B).
  4. כאשר הצביעת מסתיימת, לאחסן את המדגם ב 70% אתנול כדי להתכונן סריקה.
    הערה: ניתן לשמור את הדגימות המוכתמת במשך מספר חודשים, אך מומלץ לסרוק את הדגימות בהקדם האפשרי כדי להבטיח כתמים מלאים.

4. סריקת מיקרו-Ct

  1. עטוף את המדגם עם parafilm כדי למנוע ייבוש. אין לעטוף את הדגימות חזק מדי, כי זה עלול להוביל דפורמציה.
  2. פתח את הסורק והניח את המדגם על המגש (איור 2).
  3. הגדר את הפרמטרים סריקה כדלקמן: מתח מקור (kV) = 70, מקור זרם (μA) = 114, אל מסנן = 0.5 מ"מ, גודל פיקסל תמונה (μm ²) = 20, פיקסלים = 2240 × 2240, חשיפה (ms) = 500, שלב סיבוב (מעלות) = 0.3.
    הערה: ניתן לשנות את הפרמטרים בהתאם לדוגמאות ו/או לסורקים הנמצאים בשימוש.
  4. . תתחיל לסרוק
    הערה: הסריקה אורכת 30 עד 60 דקות בהתאם לרזולוציה המיועדת ולמהירות הסורק.

5. שחזור ואופטימיזציה של נתונים

  1. הפעל את תוכנת השחזור. בחר ' ערכת נתונים פתוחה ' בתפריט ' פעולות ' כדי להפעיל את הקבצים שנסרקו.
  2. בחר בכרטיסיה הגדרות בחלון השחזור . הגדר את הפרמטרים כדלקמן: ממצאים הטבעת הפחתת = 7, קרן התקשות תיקון (%) = 40.
    הערה: ניתן לשנות את הפרמטרים בהתאם למדגם.
  3. התחל בשחזור על-ידי בחירה באפשרות התחל בכרטיסיה התחלה . הנתונים הסופיים יאוחסנו בתיקיה המיועדת.
  4. הפעל את הקובץ שינוי גודל התוכנה. בחר ערכת נתוני מקור כדי להפעיל את הקבצים המשוחזר.
  5. בחר jpg בכרטיסיה ערכת נתוני היעד .
  6. בחר את האפשרות שינוי גודל 1/2 עם אפשרות איכות של ללא אינטרפולציה (מהיר).
  7. התאם את שורת השקופיות ל100 (גבוהה ביותר) בכרטיסיה דחיסת תמונה . התחל בהמרה.
    הערה: אפשרות שינוי הגודל היא למנוע האטה של מהירות המחשב בעת עיבוד תלת-ממד; עם זאת, היא עשויה לגרום לרזולוציה נמוכה יותר בעת שינוי הגודל בהרחבה. אנו מציעים שינוי גודל לחצי עבור רזולוציה מקובלת עם טיפול טוב יותר.

6. שחזור תלת מימד

  1. הפעל את תוכנת עיבוד העוצמה תלת-ממדית.
  2. בחר פעולות > טען נתוני אמצעי אחסון כדי להפעיל את ערכת הנתונים.
  3. כוונן את רמת הבהירות והניגודיות על-ידי שינוי פונקציית העברת צורות בהיסטוגרמה בכרטיסיה עורך פונקציות העברה .
  4. בחר אפשרויות > תאורה.
  5. בחרו ' צלליות ' ו'תאורת שטח '. אפקטים אלה מספקים צליל מידול ריאליסטי.
  6. מצא את התצוגה הטובה ביותר על-ידי הזזת (לחץ וגרור), סיבוב (לחץ לחיצה ימנית וגרור), והתקרבות או יציאה (גלול) את המודל.
  7. החלק את המטוס (shift + לחץ וגרור בכיוון הפנימי) כדי להציג את התמונות הסקציוניות (איור 3).
  8. הפעל את סמל האור . כוונן את סרגל סימון התאורה ולמצוא את התאורה הטובה ביותר לצפייה. לאחר מכן, כבה את הסמל וסגור את הכרטיסיה תאורה .
  9. בחר באפשרויות > הצג את > תיבה מסיכה כדי להסתיר את התיבה עבור התמונה הסופית.
  10. בחרו ' פעולות ' ≫ שמירת תמונה לאחסון התמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנייה המפורטת של בזן הושגה על ידי microCT עם הכנה להורים (איור 4). המבנה הligamentous ביותר המשתרעת בין הדרסטיות והקרום היה מובהק (איור 4A). בתצוגה הקורלית (איור 4B), הכמות והמורכבות של הסיבים הגדילו את האור. בתצוגה האופקית (איור 4C), נצפתה מצגת משוכללת עם מבנה ארבוריזד. הבחנו בצורה המאופיינת בלוחות מתמשכים, במקום בסיבים כמו חוטים, כפי שדווחו קודם לכן. בתצוגת המשונן (איור 4 ד

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת מיקרוct עם הכנה להורים בבדיקת רקמות רכות אנושיות. בקצרה, דגימות נקצרו וקבוע פורמלין במשך כמה ימים, ואחריו התייבשות פתרונות אתנול סדרתי. הצבת המדגם לתוך הפתרון של הורים ישירות לאחר קיבעון פורמלין יכול לגרום לפיצוח רקמות מסוימים בשל התייבשות מהירה. לכן, יש צורך בהתייבשות טורית. לפני כתמים של ועד ההורים בשלב הבא, הדגימות מוכתמות. בפתרון הורים לשבוע לאחר מכן ניתן לבצע סריקת MicroCT, שחזור תלת-ממדי וניתוח. המטרה שלנו הייתה להתבונן בשיטה זו ובמבנים סמוכים. הצגנו בהצלחה את הרקמה כדגם תלת-ממדי. העור, הרצועות והשרירים דמיינו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מלגת מחקר של הפקולטה של אוניברסיטת יונסיי המכללה לרפואה (6-2018-0099). המחברים מודים לאנשים שתרמו בנדיבות את גופם לקולג ' של אוניברסיטת יונסיי לרפואה. אנחנו אסירי תודה לג הו קים וג הו באנג על התמיכה הטכנית שלהם (אנשי הצוות במרכז החינוך לאנטומיה כירורגית ב אוניברסיטת יונסיי המכללה לרפואה). אנחנו גם אסירי תודה ל-ג'נובה ושות בע מ עבור מערכת סריקת microCT באיכות גבוהה בשימוש במחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12 טונגסטו (VI) חומצה זרחתית n-hydrate
חומצה פוספוטונגסטית		Junsei84220-0410אבקת PTA
CTvoxBrukerver 2.7תוכנת סיור תלת מימד
NreconBrukerver 1.7.0.4תוכנת שחזור
SkyscanBruker1173סורק MicroCT
TconvBrukerver 2.0קובץ תוכנה לשינוי גודל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
  2. Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
  3. Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
  4. Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
  5. Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
  9. Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042(2018).
  10. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597(2017).
  11. Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
  12. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).
  13. Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
  14. Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
  15. Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Parafilm

מאמרים קשורים