מטלת אסוציאציה של ריח-תגמול בעלות נמוכה למבחני למידה וזיכרון

סיכום

נעשה שימוש במשימת למידה אסוציאטיבית של ריח-תגמול כדי לחקור את ההשפעות השונות של מניפולציה פיזיולוגית על זיכרון לטווח ארוך וקצר.

תקציר

פרדיגמות התנהגותיות חזקות ופשוטות של זיכרון אסוציאטיבי מעורר תיאבון הן חיוניות לחוקרים המתעניינים במנגנונים תאיים ומולקולריים של זיכרון. במאמר זה, מתואר פרוטוקול התנהגותי עכברי יעיל ובעלות נמוכה לבחינת ההשפעות של מניפולציה פיזיולוגית (כגון עירוי של חומרים פרמקולוגיים) על קצב הלמידה ומשך זיכרון הריח-תגמול. תוצאות מייצגות מסופקות ממחקר הבוחן את התפקיד השונה של פעילות קולטן טירוזין קינאז בזיכרון לטווח קצר (STM) ובזיכרון לטווח ארוך (LTM). עכברים זכרים הותנו לקשר תגמול (כדור סוכר) לאחד משני הריחות, והזיכרון שלהם לקשר נבדק 2 או 48 שעות לאחר מכן. מיד לפני האימון, מעכב קולטן טירוזין קינאז (Trk) או עירוי רכב הועברו לפקעת הריח (OB). למרות שלא הייתה השפעה של העירוי על קצב הלמידה, חסימה של קולטני Trk ב-OB פגעה באופן סלקטיבי ב-LTM (48 שעות), ולא זיכרון לטווח קצר (STM; 2 שעות). הפגיעה ב-LTM יוחסה לירידה בסלקטיביות הריח כפי שנמדדה על ידי אורך זמן החפירה. שיא תוצאות הניסוי הזה הראה שהפעלת קולטן Trk ב-OB היא המפתח לאיחוד זיכרון הריח.

מבוא

המנגנונים של היווצרות זיכרון אסוציאטיבי נחקרו בעבר בעיקר על סמך מחקרי התניה של פחד בניסוי אחד. עם זאת, למשימות שגרתיות רבות יש בדרך כלל דפוסי רכישה מורכבים יותר ומסתמכות על מפגשים חוזרים ונשנים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק פרדיגמה התנהגותית חסכונית של מכרסמים המשמשת להבנת המנגנונים התאיים והמולקולריים של למידה וזיכרון תיאבון רב-ניסויים.

למידת ריח התלויה בנורת הריח הראשית (OB) מספקת מספר יתרונות לחקר זיכרון תיאבון רב-ניסיוני. ראשית, לזיכרונות תלויי OB יש משכי זמן משתנים (STM, LTM וזיכרון לטווח בינוני¹) והם מסתמכים על אותו מנגנון מולקולרי ^2,3 ומנגנון מבני כמו במקומות אחרים במוח, כולל נוירומודולציה⁴, חיזוק לטווח ארוך⁵ ונוירוגנזה של מבוגרים ^6,7,8. שנית, בניגוד לאזורים מסדר גבוה יותר, כמו ההיפוקמפוס, זיכרונות תלויי OB מאפשרים תצפיות של התאמה ישירה יותר בין מניפולציות של הנסיינים בסביבה התפיסתית לבין שינויים במעגלים העצביים האחראים ללמידה 8,9,10,11 . במאמר זה, מפורטת פרדיגמת למידה וזיכרון אסוציאטיבית תלוית OB, שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנונים מולקולריים ומבניים כלליים. הוא פותח כדי לאפשר לחוקרים לגשת ליתרונות של למידת חוש הריח לחקר מנגנוני הזיכרון התאיים והמולקולריים.

בפרסום האחרון שלנו³, הפרוטוקול המתואר כאן שימש כדי להוכיח כי האיחוד של למידת ריח תיאבון תלוי בהפעלת קולטן Trk בתוך ה-OB. בפרוטוקול שלהלן נדונים גם תחומים שבהם ניתן להתאים את הפרדיגמה ההתנהגותית לצרכים ניסויים שונים.

בסך הכל נעשה שימוש ב-27 עכברי CD-1 זכרים בוגרים, בני 8 שבועות בזמן הקנולציה, במחקר זה. להתפלגות הקבוצתית המדויקת והשימוש בערכת הריח, עיין בסעיף השיטות בפרסום הקודם שלנו³. עכברים זכרים שימשו כדי להימנע מתנודות גדולות ברמות האסטרוגן מכיוון שמחקרים קודמים¹² הראו שזיכרון הריח משופר על ידי רמות אסטרוגן מוגברות. עכברים אלה הוחזקו תמיד במחזור אור/חושך הפוך של 12:12 שעות והייתה להם גישה למים. במהלך הניסויים ההתנהגותיים, התזונה של העכברים הוגבלה כדי לשמור עליהם על ~90% ממשקל ההזנה החופשי שלהם. הגבלת התזונה החלה 3 ימים לפני תחילת הניסוי ההתנהגותי. כפי שיתואר להלן, לאותה קבוצת עכברים מוצגות מערכות ריח שונות על מנת להגיע לרמות המתאימות של עוצמה סטטיסטית תוך מזעור השימוש בבעלי חיים. סעיף הניתוח הסטטיסטי מראה כיצד להסביר את השונות האקראית שעלולה להיווצר על ידי זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול שלהלן מקפיד על הנחיות הטיפול בבעלי חיים של IACUC במכללת ארלהאם.

1. קנולציה של נורת הריח

הערה: ניתוחים אלה אינם דורשים טכניקה סטרילית מכיוון שהם אינם דורשים ביצוע חתכים גדולים. עם זאת, כל מוסד עשוי להיות שונה בדרישותיו. אם הנסיינים מבצעים ניתוח זה על זני עכברים מדוכאי חיסון, ייתכן שיהיה צורך בשיקולים נוספים. בסך הכל, הנסיינים מוזמנים לדון בפרוטוקול זה עם הווטרינר וצוות הטיפול בבעלי חיים לפני השימוש ולנקות ולחטא את כל הכלים בין כל ניתוח.

1. במהלך ההתקנה, יש להשרות צינוריות וברגים בכוס קטנה או בצלחת פטרי המכילה 32% כלורהקסידין כדי לשמור על חיטוי.
2. להרדים עכברים עם איזופלורן גזי 4% בחמצן טהור ולהדק למנגנון סטריאוטקסי. במהלך הניתוח, יש לוודא שהעכברים נשמרים תחת הרדמה איזופלורן של 1.5-2% המסופקת דרך חרוט אף. מעקב אחר הנשימה לאורך כל הניתוח. יש להשתמש במשחת עיניים למניעת יובש בעיניים בזמן הרדמה.
3. לאחר שהעכבר מאובטח ואינו מגיב עוד לצביטה יציבה של כף הרגל האחורית, השתמש ב-32% כלורהקסידין כדי לשפשף את החלק העליון של הראש על מנת לנקות את משטח החתך.
4. לאחר מכן, שפשפו את החלק העליון של הראש בכיוון הרוסטרלי לזנב עם לידוקאין (משכך כאבים מקומי).
5. לחץ כלפי מטה בחוזקה כדי לבצע חתך בודד לאורך קו האמצע בעזרת להב אזמל נקי.
6. בעזרת מקדחה המחוברת לסטריאוטקסיק, קדחו שני חורים מעל נורות הריח עבור צינורית ההנחיה (26 גרם) באמצעות קואורדינטות AP +5.0 מ"מ, ML +/- 0.75 מ"מ ביחס לברגמה.
7. קדחו שני חורים מעל תצורת המוח הקטן.
   הערה: מיקום הברגים הללו אינו צריך להיות מדויק, ודא שהם סימטריים לאורך קו האמצע.
8. הנח ברגים לתוך שני החורים מעל תצורת המוח הקטן והשתמש בדבק רקמות כדי להדק את הברגים הללו לגולגולת.
9. השתמש בסטריאוטקסית כדי להכניס את צינורית ההנחיה (26 גרם) לחורים שנקדחו מעל נורות הריח (שלב 1.6). הורד את הצינורית DV 1.0 מ"מ.
10. מערבבים את המלט הדנטלי בצלחת פטרי. השתמש בכף מתכת קטנה כדי לערום לאט את המלט הדנטלי סביב הצינורית. תן לזה להתייבש במשך 5 שניות. לאחר מכן, הסר את זרועות המכשיר הסטריאוטקסי, והקפיד לא לשלוף את צינורית ההנחיה החוצה בתהליך. המשיכו לערום את המלט הדנטלי על כל החתך עד שנוצר פקק קטן (ראו איור 1א).
11. הנח תקעי דמה לתוך צינורית ההנחיה בשלב זה כדי למנוע את הסתימה.
12. מיד לאחר הניתוח יש להזריק קטופרופן (0.2 מ"ג/ק"ג) ומי מלח (200 מיקרוליטר) כדי להפחית את הכאב ולהחזיר לחות. ספק מזון מרוכך או הידרוג'ל לעכברים לאחר הניתוח. אל תשאיר עכברים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה כדי לשמור על שכיבה על עצם החזה.
    הערה: עכברים גם שוכנים בנפרד מנקודה זו ואילך.
13. יש להזריק מי מלח (200 מיקרוליטר) וקטופרופן (0.2 מ"ג/ק"ג) פעם ביום למשך יומיים לאחר הניתוח.
14. במשך יומיים ועד 5 ימים, (לפי הצורך) לאחר הניתוח, יש לשקול את העכברים ולעקוב אחר משקלם. אם המשקל לא חוזר לרמות שלפני הניתוח תוך יומיים-שלושה, יש להתייעץ עם הווטרינר לגבי שיטת ההאכלה המתאימה.
15. אפשר לעכברים להתאושש לפחות 7 ימים לפני תחילת האימון ההתנהגותי.

2. משימת אפליה אסוציאטיבית

1. חליטות
   1. יש לתת לעכברים עירויים ספציפיים ל-OB של מעכב קולטן טירוזין קינאז, K252a (50 מיקרומטר; 5% DMSO במי מלח), או רכב (5% DMSO במי מלח) כדלקמן.
      1. העבירו את העירוי לחדר הניתוח של העכברים באופן דו צדדי. הזרקו נפח סופי של 2.0 מיקרוליטר לכל נורה עם קצב עירוי של 0.2 מיקרוליטר לדקה ו-10 דקות של זמן עירוי כולל באמצעות משאבת מזרק כפולה.
         הערה: ניתן להתאים את תזמון המניפולציה בהתאם לסוג המחקר ההתנהגותי המבוצע. שלבי העירוי המדויקים הם ספציפיים לכל משאבת מזרק ומסופקים במדריך היצרן.
      2. הקפד להשאיר את המזרקים בתוך הצינורית למשך כ-5 דקות לאחר המסירה כדי לעכב את הזרימה החוזרת ולקדם דיפוזיה. (כלומר, תכננו בסך הכל 15 דקות לכל עירוי).
2. ערכות ריח.
   1. לדלל את כל הריחות בשמן מינרלי קל ללחץ חלקי של 1.0 Pa באמצעות יחס מחושב מראש המבוסס על לחץ אדים (טבלה 1).
   2. השתמש ב-5 זוגות הריחות הנפרדים מטבלה 1 (המספרים בטבלה מציינים נפח במיקרוליטר כדי לערבב 50 מ"ל שמן מינרלי למשך 1.0 Pa).
   3. כדי להכין את החול הריחני לשימוש במהלך השלבים ההתנהגותיים (סעיף 2.3 ו-3), מערבבים 400 מיקרוליטר של ריח 1.0 Pa משלב 2.2.2 עבור כל 100 גרם חול משחק.
3. עיצוב
   הערה: עכברים צריכים לעבור עיצוב לתקופה של 10 ימים כמתואר להלן.
   1. הכניסו עכברים לחדר הניתוח וטפלו בהם במשך 10 דקות ביום במשך היומיים הראשונים לאחר ההחלמה מהניתוח.
   2. ביום השלישי, הכניסו צלחת פטרי מלאה בחול ריחני (+)-לימונן לתוך כלובי הבית של העכברים ומלאו בכ-10 כדורי סוכרוז, כל אחד 5 מ"ג במסה.
      הערה: השתמש ב-1.0 Pa (+)-לימונן (מערבבים 102 מיקרוליטר בשמן מינרלי של 50 מ"ל) כריח המתוגמל ובשמן מינרלי רגיל (החומר המדלל לריחות הבדיקה) כריח הלא מתוגמל. מומלץ גם לבחור ריחות מונומולקולריים מכיוון שסביר להניח שאלו יהיו חדשים לעכברים.
   3. מלאו גם את החול וגם את הכדורים ביום הרביעי.
   4. בימים 5 ו-6, התאקלמו את העכברים למנגנון ההתנהגותי המותאם אישית, על ידי הכנסתם לתוך המנגנון ואפשרו להם לחקור את החלל (איור 1B,C). הכינו את המכשיר באמצעות כלוב ביתי סטנדרטי, ופולי (מתיל מתקרילט) לבניית שני מכסים ומפריד מרכזי שחור. ודא שגם המכסים וגם המחיצה המרכזית גדולים ב-1-2 ס"מ מהכלוב הביתי.
   5. הכינו צלחת פטרי אחת של חול ריחני לימונן ואחרת עם חול המכיל שמן מינרלי. לאחר ההתאקלמות ביום החמישי והשישי, הכניסו את שתי צלחות החול לתא הבדיקה וערבבו 10 כדורי סוכרוז בצלחת בניחוח לימונן כדי לשמש כפרס. הנח כל עכבר בתא הבדיקה למשך 10 דקות ואפשר לחקור ולצרוך בחופשיות את כדורי התגמול.
   6. ביום השביעי, הציגו לעכברים גרסה מקוצרת של הליך הבדיקה הסופי, על ידי הכנסת הכלים המכילים חול בניחוח לימונן וחול ריחני בשמן מינרלי לתוך המנגנון ההתנהגותי. הפעם כלול את המחיצה המרכזית.
      1. הניחו פרס בודד על גבי החול בניחוח לימונן, והניחו את העכבר בתא המנוחה.
      2. לאחר שהעכבר הונח בתא המנוחה, הרם את המחיצה המרכזית כדי לאפשר לעכבר להיכנס לתא הבדיקה כדי לחקור ולחפור בכלים מלאי החול. החזר את העכבר לתא המנוחה לאחר ששלף את גלולת התגמול או לאחר שחלפו 5 דקות.
      3. חזור על תהליך זה למשך 10 ניסיונות בסך הכל עבור כל עכבר בודד. איזון נגד מיקום המנה המתוגמלת בצד שמאל או בצד ימין על ידי שימוש במחולל מספרים אקראיים. אין תקופות מנוחה בין הניסיונות.
   7. ביום השמיני, חזרו על הניסיונות של היום השביעי, אך גם קברו את הכדור בהדרגה עמוק יותר ויותר בחול.
      הערה: רוב העכברים צריכים לחפור אחר כדור התגמול הבלתי נראה עד הניסיון^העשירי ביום השמיני.
   8. ביום התשיעי, הגדילו את מספר הניסויים ל-20 ניסויים לכל עכבר עם קבורה עמוקה מלאה של כדור סוכרוז והכנסת העכברים לתא הבדיקה למשך דקה אחת לכל ניסוי. תנו לעכברים לחפור בשתי המנות כדי לקבל את הפרס.
   9. ביום העשירי, חזרו על 20 הניסיונות עבור כל עכבר, אבל אם הם חופרים בצלחת הלא מתוגמלת לפני שהם חופרים בצלחת המתוגמלת, ואז מתחילים את הניסיון הבא. אפשרו לעכברים שחפרו לראשונה בצלחת המתוגמלת (בניחוח לימונן) להחזיר את כדור התגמול לפני שליחתם בחזרה לתא המנוחה.

3. הדרכה ובדיקה

הערה: ברגע שהעכברים התחילו לחפור באופן אמין אחר כדורי התגמול הבלתי נראים עם רמזי הריח, הניסוי יכול להתחיל.

1. הדרכה
   הערה: שלב האימון מתחיל יומיים לאחר השלמת העיצוב ומורכב מ-20 ניסיונות לכל עכבר. לפני האימון, יש לספק מיד את עירוי התרופה/הרכב התוך-בולברי (ראה סעיף 2.1 לפרטי העירוי) ולהתחיל את האימון מיד לאחר העירוי.
   1. הנח עכבר בתא המנוחה.
   2. הניחו שתי צלחות חול מבושמות עם זוג ריחות חדשים בתא הבדיקה, שם קבור כדור פרס באחד הכלים.
   3. לאחר שתא הבדיקה מוכן, הרם את המחסום האטום והכנס את העכבר לתא הבדיקה. החזר מיד את העכבר לתא המנוחה, אם העכבר חופר תחילה בצלחת הלא מתוגמלת (רשום את הניסיונות הללו כ-"0"). אם העכבר חופר תחילה בריח המתגמל, אפשר לו לאחזר את הכדור ולהחזיר אותו לתא המנוחה. רשום את הניסויים הללו כ-"1". אם הניסוי נמשך דקה אחת מבלי שהעכבר יחזיר את התגמול, שלחו את העכבר בחזרה לתא המנוחה.
   4. נקו ומלאו מחדש כלים והתחילו את הניסיון הבא. חזור על אותו הדבר במשך 20 ניסיונות.
2. בדיקות
   הערה: ניתן לבצע בדיקת זיכרון בכל משך זמן שמעניין את החוקר. בניסוי זה, שתי קבוצות נפרדות של עכברים נבדקו שעתיים (STM) או 48 שעות (LTM) לאחר האימון בהתחשב בעניין בהשפעה הדיפרנציאלית של K252a על STM ו-LTM.
   1. בצע בדיקות באמצעות אותם ריחות ונוהל כמתואר עבור ההדרכה (סעיף 3.1).
      הערה: בהתאם לשאלת המחקר, ייתכן שהחוקר יצטרך לכלול קבוצות ביקורת. לדוגמה, בניסוי שפורסם בעבר, נחקרו ההשפעות של חסימת קולטן Trk על איחוד זיכרון³. לכן, קבוצת ביקורת הוחדרה ל-K252a לפני בדיקה של 48 שעות כדי להראות שההשפעות לא נבעו מהפרעה לשליפה.
3. ניתוח סטטיסטי
   הערה: תחביר SPSS 22.0 עבור כל שלב מסופק כקובץ משלים כדוגמה.
   1. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ניתוח ליניארי של השפעות מעורבות. בניגוד ל-ANOVAs, מודלים של אפקטים מעורבים ליניאריים יכולים להסביר טוב יותר השפעות אקראיות ומדידות חוזרות.
   2. חשב את המידה התלויה: "פרופורציה נכונה". נזכיר מ-3.1.3 ש-"1" הוקצה לניסויים שבהם העכבר חפר ראשון בריח המתגמל, ו-"0" אם העכבר חפר ראשון בריח הלא מתגמל. ממוצע כל חמישה ניסויים ליצירת ארבעה בלוקים לניסוי (TB; למשל, בלוק ניסוי 1 או TB1 היה הממוצע של ניסויים 1-5, בלוק ניסוי 2 או TB2 היה הממוצע של ניסויים 6-10 וכן הלאה).
   3. הגדר את המשתנים הבלתי תלויים או ההשפעות הקבועות כקבוצות תרופות (K252a או Vehicle; סעיף 2.1.1) וגושי ניסוי (מ-3.3.1). בתוצאות המייצגות שלהלן מפורטים המשתנים המשמשים לכל ניתוח.
   4. כלול עכבר בודד וערכת ריחות המקוננים בתוך העכבר כ"השפעות אקראיות" על מנת לפצות על הבדלים התנהגותיים מהותיים בעכברים וכל השפעות של שימוש בערכות ריח מרובות.
   5. בצע טרנספורמציה לוגית על הפרופורציה הנכונה.
      הערה: הפרופורציה הנכונה אינה משתנה תלוי רציף ולא קשור. לפיכך, הוא מפר שתי הנחות עבור מודלים ליניאריים. לכן, התמרת הלוגיט מתבצעת.
   6. השתמש באמצעים שוליים משוערים לביצוע בדיקות פוסט-הוק על אינטראקציות משמעותיות שזוהו על ידי המודל המלא; יש לתקן השוואות זוגיות מרובות בבדיקות פוסט הוק. בדרך כלל משתמשים ב-Bonferroni או Šidák.

תוצאות

כפי שתואר, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להעריך את ההשפעה של מניפולציה מסוימת על למידה, STM ו-LTM. תוצאות מדגם מ-Tong et al, 2018³ מוצגות כאן. התוצאות תומכות בהשערה שחסימת קולטן Trk מעכבת באופן סלקטיבי LTM, אך לא למידה או STM.

איור 2A מציג את הסכמות של האימון, מבחן STM ומבחן LTM. ראשית, הוכח כי עירויי K252a לא השפיעו על קצב הלמידה של אסוציאציה של ריח-תגמול. איור 2B (סעיף 3.1) מציג את קצב הלמידה הן של K252a והן של קבוצות הרכב מהאימון. ניתוח סטטיסטי באמצעות מודל מעורב ליניארי הופעל עם שתי השפעות קבועות, קבוצת תרופות ובלוק ניסוי (TB); עכבר וסט ריחות מקוננים בתוך העכבר היו אפקטים אקראיים. נתונים מבדיקות (סעיף 3.2) לא נכללו בניתוח. השפעה עיקרית משמעותית נצפתה מחסימת הניסוי (F(3, 183.692) = 43.735, p < 0.001), אך לא נרשמה השפעה מקבוצת התרופות (F(1, 85.685) = 0.132, p = 0.717) ולא הייתה אינטראקציה משמעותית (F(3, 183.692) = 0.111, p = 0.954). בדיקות פוסט-הוק, תוך שימוש בהתאמת Šidák, אישרו כי קבוצות ה-K252a והרכב לא היו שונות באף אחד מבלוקי הניסוי במהלך האימון (עמ ' > 0.05 לכל ההשוואות). TB2, TB3 ו-TB4 היו גבוהים משמעותית מ-TB1 בכל ההשוואות (p ≤-0.001 בכל המקרים), מה שמדגים ששתי הקבוצות למדו בהצלחה את הקשר בין ריח-תגמול עד סוף 20 ניסויי אימון.

לאחר מכן, כדי לבחון את השפעות העירוי על STM ו-LTM, אותו ניתוח הופעל וכלל נתונים מבדיקה (סעיף 3.2). הוא הראה אינטראקציה משמעותית בין קבוצת התרופות לבלוק הניסוי (F(2, 77.558) = 4.043, p = 0.021), ללא השפעות עיקריות משמעותיות של קבוצת התרופות (F(1, 55.629) = 1.438, p = 0.236) או בלוק הניסוי (F(2, 69.979) = 1.360, p = 0.263). על מנת לבחון באופן ספציפי את הזיכרון, השוואות זוגיות פוסט-הוק עם תיקון Šidák, השוו את ההבדלים בין בלוק הניסוי האחרון של אימון (סעיף 3.1) לבין בלוק הניסוי הראשון של בדיקה (סעיף 3.2) 2 (STM) או 48 שעות (LTM) לאחר מכן. עבור עכברים שהוחדרו לרכב, ההשוואות הראו שימור של הזיכרון האסוציאטיבי הן ב-2 והן ב-48 שעות לאחר האימון (p >-0.05 עבור כל ההשוואות עם ביצועי אימון). עבור עכברים שהוחדרו ל-K252a, בלוק הניסוי הראשון של מבחן השעתיים (STM) לא היה שונה מבלוק הניסוי האחרון של Training (עמ ' > 0.05); עם זאת, ביצועי הזיכרון שלהם היו נמוכים משמעותית לאחר 48 שעות (p = 0.018). בנוסף, הזיכרון במבחן 48 השעות ירד משמעותית בהשוואה לזיכרון במבחן השעתיים (p = 0.009), ולביצועי קבוצת הרכב במבחן 48 השעות (p = 0.006). לא היה הבדל ב-STM בין עכברים שהוחדרו ל-K252a (p = 0.356). יחד, התוצאות מראות כי עיכוב K252a של קולטני Trk בפקעת הריח משבש באופן סלקטיבי זיכרון ריח לטווח ארוך, אך לא לטווח קצר (איור 3).

סט ריחות	ריח 1	ריח 2
1	חומצה פנטנואית	חומצה בוטנואית
	225.1	63.6
2	הקסאנלי	הפטנאל
	11.1	35.3
3	פרופיל אצטט	בוטיל אצטט
	3.1	10.9
4	2-אוקטנון	2-הפטנון
	87.4	28.7
5	פנטנול	הקסאנול
	37.2	127.3

טבלה 1: ערבוב נפחים לערכות ריח. כל שורה מציגה שני ריחות שיכולים לשמש כזוג לשלבים ההתנהגותיים. לדוגמה, כדי להשתמש ב"סט הריחות" הראשון, הכינו את תערובות החומצה הפנטנואית והבוטנואית. המספרים בטבלה מציינים נפח במיקרוליטר לערבוב בשמן מינרלי של 50 מ"ל לריכוז של 1.0 Pa מכל ריח. במהלך האימונים והבדיקות, צלחת פטרי אחת הייתה מבושמת בחומצה פנטנואית, השנייה בחומצה בוטנואית.

איור 1: מיקום קנולציה ומנגנון התנהגותי. (A) מראה את המיקום היחסי של הצינורית, מכסה המלט הדנטלי והברגים לראש העכבר. שימו לב שמחטי הצינורית מגיעות לשתי נורות הריח, הכן עצמו מוטבע במכסה המלט הדנטלי. הברגים ממוקמים בשני חורים שנקדחו לתוך הגולגולת מעל תצורת המוח הקטן. הברגים אינם נוגעים במוח עצמו, אך הם משמשים כעוגן זנב לכובע המלט הדנטלי. האיור מציג את הגודל היחסי לייצור מכסה המלט. (B) מראה את המנגנון ההתנהגותי שהורכב. הגוף הוא כלוב ביתי טיפוסי לעכברים. מכסים עם חורים לאוויר היו עשויים מפרספקס. המחיצה המרכזית עשויה גם מפרספקס שחור. המכסים צריכים להיות עשויים מפרספקס כבד מספיק כדי שיוכלו לשמש כמסילה להרמה והנחת המחיצה המרכזית במהלך הניסויים. (C) מראה צד אחד של המנגנון ההתנהגותי. שימו לב שהמחיצה המרכזית מעט גבוהה יותר מהכלוב כדי להקל על ההרמה. ניתן להניח צלחות פטרי של חול לאורך הקצה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תכנון המחקר ותוצאות הלמידה. (A) מציג את הסכימה של עיצוב המחקר. שימו לב שקבוצות STM ו-LTM היו עצמאיות (כלומר קבוצות שונות של עכברים). הסמלים בתחילת הבלוקים מציינים את הזמן שבו ניתנו עירויים. (B) מציג את היחס הנכון עבור ניסויים 1-20 במהלך האימון. התוצאות מצביעות על כך שקבוצות K252a והרכב לא היו שונות בקצב הלמידה שלהן (שיפוע הקווים). קווי שגיאה ייצגו את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). כוכביות מראות עלייה משמעותית בפרופורציה הנכונה בהשוואה ל-TB1 הן עבור קבוצת הרכב והן עבור קבוצת K252a (עמ ' ≤ 0.001 עבור כל ההשוואות). איור זה נלקח מ-Tong et al. 2018 באישור³. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השפעות דיפרנציאליות של חסימת קולטן Trk על STM ו-LTM. מציג את הפרופורציה הנכונה עבור בלוק ניסוי 4 של אימון ובלוק ניסוי 1 של בדיקות STM ו-LTM. כלומר, נעשה שימוש במודל מעורב ליניארי כדי להשוות את הפרופורציה הנכונה במהלך בלוק הניסוי האחרון של שלב האימון (איור 2; Training-TB4) לאלה במהלך בלוקי הניסוי הראשון (Testing-TB1) של מבחן זיכרון לטווח קצר (שעתיים) ולטווח ארוך (מבחן 48 שעות). למודל המעורב הליניארי היו שתי השפעות קבועות: קבוצת תרופות וחסימת ניסוי (Training-TB4, STM-TB1, LTM-TB1). האפקטים האקראיים היו עכברים וריחות מקוננים בתוך העכבר. השוואות פוסט-הוק מצאו כי עכברי K252a פגעו באופן משמעותי ב-LTM (בהשוואה לאימון TB4; p = 0.018) אך לא STM (p > 0.05). ביצועי LTM על ידי עכברים שהוחדרו ל-K252a היו גם נמוכים משמעותית מה-STM של עכברים שהוחדרו ל-K252a (p = 0.009), ונמוכים יותר מ-LTM של עכברי רכב (p = 0.006). קווי שגיאה ייצגו את ה-SEM. איור זה נלקח מ-Tong et al. 2018 באישור³. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים: תחביר המשמש לניתוח הסטטיסטי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

התניה של פחד בניסוי אחד היא פרוטוקול התנהגותי רב עוצמה לחקר הדינמיקה המולקולרית והתאית של הזיכרון, אבל חלק גדול מהלמידה הטבעית הוא הדרגתי ומעוצב בצורה הטובה ביותר באמצעות פרדיגמה כמו זו שתוארה לעיל. העיכוב של קולטני Trk ב-OB מנע את גיבוש זיכרון הריח בפרדיגמת למידה מעוררת תיאבון מרובת ניסויים כפי שהוצג קודם לכן על ידי קבוצה³ שלנו. הממצא פותח אפיקים חדשים למחקר על התזמון הדיפרנציאלי של מנגנונים מולקולריים, כמו נוירוטרופין, בלמידה מעוררת תיאבון ורתיעה.

ניסוי זה כלל שני חלקים קריטיים: (1) הקנולציה ו-(2) משימת ההבחנה האסוציאטיבית (מחולקת לעיצוב, אימון ובדיקה). נסיינים יכולים להתאים את הפרוטוקול הזה לשאלת המחקר הספציפית שלהם. לדוגמה, התענייננו בעיקר ב-OB וניתן ליישם את הפרוטוקול המבוסס הזה בקלות על מחקרי OB אחרים. עבור נסיינים עם תחומי עניין אחרים, יהיה חשוב לאמת את אתרי העירוי במחקר פיילוט. ייתכן שהנסיינים יצטרכו גם לשקול את קצב הדיפוזיה, החדירה המרחבית ומשך הפעילות הביולוגית של מה שהם מזריקים.

שלבי העיצוב המתוארים בפרוטוקול שימשו רבות על ידי מחברי פרוטוקול זה. נראה כי היצמדות אליהם כמתואר חשובה כדי שהעכברים ילמדו את המשימה בזמן. תוך שימוש בלוחות זמנים אחרים, המחברים הבחינו בשונות רבה יותר בין העכברים בהיכרותם עם המשימה ומשמעות הדבר הייתה הכשרה נוספת כדי להביא את כל העכברים לקריטריון לבדיקה עם ריחות ניסיוניים. לצורך הכשרה ובדיקה, לחוקר יש גמישות, בהתאם לתחומי העניין המחקריים שלו, עם מספר הניסויים, ריכוז הריחות הניסיוניים והדמיון של הריחות זה לזה. אנו ממליצים להשתמש בערכות ריח מרובות במידת האפשר, כפי שתיארנו, על מנת להפחית את מספר בעלי החיים המשמשים לניסוי. עיין בסעיף ניתוח סטטיסטי לקבלת הדרכה כיצד להסביר את השימוש בערכות הזמנות מרובות בניתוח הסופי. באופן עקרוני, ניתן לגוון את הדמיון של זוג הריחות כדי להתאים את קושי האפליה. במחקר שפורסם בעבר מקבוצה³ שלנו, זוגות הריחות מורכבים משני ריחות מאותה קבוצה פונקציונלית אך נבדלים זה מזה באורך פחמן אחד. הבחנות אלה קשות יותר מזוגות הנבדלים זה מזה בשני אורכי פחמן או יותר, אך קלות יותר מאננטיומרים (למשל, (+)-לימונן ו-(-)-לימונן). ריחות מקבוצות פונקציונליות שונות שונים מאוד מבחינה תפיסתית. קלילנד ואחרים¹³ דנים בשינויים נוספים בגירוי ובהשפעתם על פרמטרי למידה ספציפיים.

מגבלה עיקרית אחת של פרוטוקול זה היא שלוקח זמן רב יותר לביצוע בהשוואה למשימות למידה אסוציאטיביות אוטומטיות שבהן ניתן לבחון מספר בעלי חיים במקביל. עבור בדיקה נתונה, ייקח לחוקר אחד לפחות 20 דקות להשלים 20 ניסויים עבור עכבר אחד. עם זאת, היעדר האוטומציה הזה הוא שאומר שהפרוטוקול נגיש יותר מבחינה כלכלית, בראש סדר העדיפויות של מוסדות רבים. חשוב לציין, במקרה של ניסוי זה, נמצא כי פרוטוקול זה ניתן לביצוע ויעיל מאוד להכשרת חוקרים לתואר ראשון בעלי עניין במדעי המוח ההתנהגותיים. בפרט, סטודנטים אלה מפתחים מיומנויות חזקות לטיפול בבעלי חיים בנוסף ליתרונות הרגילים של השתתפות במחקר.

חוקרים המעוניינים לאמץ פרדיגמה זו יכולים להשתנות במספר פרמטרים. ככל הנראה, מניפולציות פרמקולוגיות של מנגנונים הן מגוונות, וניתן להשתמש בפרוטוקול התנהגותי זה בטכניקות כימוגנטיות או בדרכים שונות אחרות למניפולציה של מסלולים מולקולריים ותאיים (למשל אופטוגנטיקה). ניתן להתאים את הפרדיגמה עצמה כדי לשנות את סוג הלמידה והזיכרון הנבדק. לדוגמה, חוקרים יכולים להתאים את הדמיון בין שני הריחות המוצגים על מנת לשלוט בקצב הלמידה. במחקר שלנו³, זוגות הריחות מורכבים משני ריחות מאותה קבוצה פונקציונלית אך נבדלים זה מזה באורך פחמן אחד. הבחנות אלה קשות יותר מזוגות הנבדלים זה מזה בשני אורכי פחמן או יותר, אך קלות יותר מאננטיומרים (למשל (+)-לימונן ו-(-)-לימונן). ריחות מקבוצות פונקציונליות שונות שונים מאוד מבחינה תפיסתית. קלילנד ואחרים¹³ דנים בשינויים נוספים בגירוי ובהשפעתם על פרמטרי למידה ספציפיים, והגיעו למסקנה שקשה יותר להבחין בריחות דומים יותר ולכן לוקח יותר זמן ללמוד¹⁴. מניפולציות אלה ישפיעו גם על חוזק הזיכרונות. ברוח זו, חוקרים עשויים להיות מעוניינים לבחון זיכרון בנקודות זמן שונות לאחר הלמידה. לדוגמה, שני מחקרים^15,16 בחנו את תפקידו של BDNF בהתמדה ב-LTM עבור משימת למידה מרתיעה של ניסוי אחד. BDNF הוא ליגנד של TrkB. המחקרים הראו כי עירוי אוליגונוקלאוטיד אנטי-BDNF אנטיסנס בהיפוקמפוס 12 שעות לאחר הלמידה חסם LTM 7 ימים לאחר מכן, אך לא יומיים לאחר מכן. מחקר זה מראה כי ציר הזמן של מנגנונים מולקולריים לאחר למידה ראשונית ממלא תפקידים מעניינים, ועדיין לא מובנים, ב-LTM. מאמר זה מתאר פרוטוקול התנהגותי שיאפשר לחקור את טווחי הזמן הללו. פרמטרים אחרים המעניינים ליישום עתידי כוללים את מודל העכבר בו נעשה שימוש. לדוגמה, יהיה מעניין להחליף עכברים זכרים (שיש להם נוירוביולוגיה שנחקרה טוב יותר באופן משמעותי)¹⁷ בעכברים נקבות במחקרים עתידיים כדי לבחון שינויים בקצב הלמידה, STM ו-LTM, שכן ליונקים נקבות יש רגישות וסלקטיביות גבוהות יותר לריחות מאשר ליונקים זכרים¹⁸. כמובן שניתן להשתמש ביעילות גם במודלים של מכרסמים של מחלות עם פרוטוקול זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורית מדריך כפול	PlasticsOne	C235GS-5-1.5/SPC	הזמנה מותאמת אישית
(-)-לימונן	Sigma-Aldrich	218367-50G
(+)-לימונן	Sigma-Aldrich	183164-100ML
2-hetanone	Sigma-Aldrich	537683
2-octanone	Sigma-Aldrich	O4709
5mg כדורי סוכרוז	בדיקת דיאטה	1811560	גודל מותאם אישית. משמש לתגמולים
חומצה בוטנואית	סיגמא-אולדריץ'	B103500
בוטיל אצטט	סיגמא-אולדריץ'	402842
אבקת צמנט דנטלי (אלמוגים)	A-M Systems	525000
ממס צמנט דנטלי	A-M Systems	526000
מכלול מחבר כפול	PlasticsOne	C232C
דמה כפולה צינורית	פלסטיק One	C235DCS-5 / SPC דמה dbl	הזמנה מותאמת אישית
מזרק כפול	פלסטיק One	C235IS-5 / SPC	הזמנה מותאמת אישית
מקדחה	Kopf מכשירים	דגם 1474 מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה	מקדחה זו דורשת חתיכת "מתאם" נוספת על מנת להתאים למקדחים מסוימים. אנו מתמודדים עם בעיה זו על ידי עטיפת המקדח בסרט מעבדה כדי להגדיל את היקף המקדחה כך שיתאים לו. ייתכן שזו לא אופציה לניתוחים הדורשים טכניקה סטרילית.
משחת			רכישה מבית מרקחת מקומי
איור 1 תוכנת איור BioRender
heptanal	Sigma-Aldrich	W254002
hexanal	Sigma-Aldrich	115606
hexanol	Sigma-Aldrich	H13303
משאבת עירוי דגם 11	מכשיר הרווארד	4169D	משאבות משומשות זמינות דרך American Instrument Exchange
Isoflurane	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx	מרשם וטרינר דרוש להזמנה
K252a	Sigma-Aldrich	K2015	מעורבב עד 50uM ב-DMSO (5%)
Ketoprofen	Allivet	25920	מרשם וטרינר דרוש להזמנת
לידוקאין	אספקרם		נרכש מאמזון
ברגי הרכבה	פלסטיק אחד	00-96 x 3/32
מסכת הרדמה לעכבר	קופף	דגם 907 מסכת הרדמה לעכבר	בשימוש עם הסטריאוטקסי כדי לאפשר חמצן והרדמה בזמן שעכבר בסטריאוטקס
מתאם אף עכבר	Kopf Instruments	דגם 926 מתאם עכבר	משמש עם הסטריאוטקסי כדי לאפשר אבטחת ראש העכבר.
Novalsan	Jeffers	41375
חומצה פנטנואית	Sigma-Aldrich	240370
פנטנול	Sigma-Aldrich	138975
תחתיות זכוכית צלחת פטרי	VWR	10754-804
בית קפה פוליקרבונטé תחתונים	Ancare	N10PCSEC	השתמש בכלובי דיור רגילים והתאם אישית מסלול באמצע כדי לשמש כמסלול עבור מחיצת פרספקס אטומה
פרופיל אצטט	Sigma-Aldrich	537438
Quikrete Premium Play Sand			רכישה מחנות לחומרי בניין מקומית
Saline	Insight Needles	N/A	תמיסת מלח סטרילית לערבוב תרופות
מכשיר סטריוטקסי	Kopf Instruments	דגם 902 תא בדיקת מכשירים
	Ancare	N10PCSEC	תאי הבדיקה שלנו משתנים באמצעות כלוב הדיור הרגיל של העכברים. כתב היד מפרט את מה שנעשה.
דבק רקמות Vetbond	3M		נרכש מאמזון