חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד
במאמר זה
סיכום
תקציר
כתב יד זה מתאר את היסוד המבוסס על תרבות, הדגירה לגילוי ואפיון של אינטראקציות תחרותיות בין שתי אוכלוסיות בקטריאלי. שיטה זו מעסיקה פלמידים יציבים המאפשרים לכל אוכלוסיה להיות מתויג באופן מובהק עם יכולות עמידות לאנטיביוטיקה ברורים וחלבונים פלורסנט לבחירה ואפליה חזותית של כל אוכלוסיה, בהתאמה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ואת הדגירה של זנים vibrio פישרי מתחרה, הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית, וניתוח נתונים כמותיים. גישה זו פשוטה, התשואות תוצאות מהירות, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע אם אוכלוסיה אחת הורגת או מעכבת את התפתחותם של אוכלוסיה אחרת, ואם התחרות מתווכת באמצעות מולקולה מפועלת או מחייבת מגע ישיר לתא הנייד. מכיוון שכל אוכלוסיית חיידקים מבטאת חלבון פלורסנט שונה, האבחנה מאפשרת אפליה מרחבית של אוכלוסיות מתחרות בתוך מושבה מעורבת. למרות השיטות המתוארות מתבצעות עם חיידק סימביוטי V. פישרי באמצעות התנאים אופטימיזציה עבור מין זה, הפרוטוקול יכול להיות מותאם לבודד בקטריאלי ביותר הניתנים לשימוש.
מבוא
כתב יד זה מתאר שיטה מבוססת-תרבות כדי לקבוע אם שני מבודד חיידקי מסוגלים לאינטראקציות תחרותיות. כאשר לומדים אוכלוסיות מעורבות, חשוב להעריך את המידה שבה החיידק מבודד את האינטראקציה, במיוחד אם מבודד מתחרים ישירות באמצעות מנגנוני הפרעה. תחרות ההפרעות מתייחסת לאינטראקציות שבהן אוכלוסיה אחת מעכבת באופן ישיר את הצמיחה או הורגת אוכלוסיית מתחרה1. אינטראקציות אלה חשובות לזיהוי מכיוון שהן יכולות להיות בעלת השפעה מעמיקה על מבנה הקהילה ותפקודו של מיקרוביאלית2,3.
מנגנונים לתחרות מיקרוביאלית התגלו באופן נרחב בתוך גנום של חיידקים מסביבות מגוונות, כולל שני מארחים הקשורים וחייד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. להכין זנים עבור Coincubation
- לבחור זן התייחסות מתאים שישמש כיעד לתחרות חיידקים במהלך שיטת הדגירה. ראה דיון לגבי שיטות עבודה מומלצות בעת בחירת זן הפניה וכיצד מאמץ ההפניה ישפיע על התוצאות. בפרוטוקול זה, V. פישרי זן ES114 ישמש זן התייחסות.
-
קביעת הבחירה ושיטות ההקרנה ישמשו להבחנה בין הבודדת בקובדגירה
- בדרך כלל, זנים שינוי עם פלסטלינה יציבה המכילה גנים שונים עמידות לאנטיביוטיקה (g. kanamycin ' או כלוראמאניול) כדי לבחור עבור כל זן, כמו גם גנים קידוד חלבונים פלורסנט שונים (g. GFP or RFP) עבור ויזואלית מבחין סוגי הזנים בתרבות הcoculture
הערה: השימוש בפלמידים יציבים נדרש מכיוון שאם ....
- בדרך כלל, זנים שינוי עם פלסטלינה יציבה המכילה גנים שונים עמידות לאנטיביוטיקה (g. kanamycin ' או כלוראמאניול) כדי לבחור עבור כל זן, כמו גם גנים קידוד חלבונים פלורסנט שונים (g. GFP or RFP) עבור ויזואלית מבחין סוגי הזנים בתרבות הcoculture
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
על מנת להעריך את האינטראקציות התחרותיות בין אוכלוסיות בקטריאליות, פרוטוקול שיטת הדגירה פותח וממוטב עבור V. פישרי. שיטה זו משתמשת פלמידים יציבים לקודד גנים עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסנט, המאפשר בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן. על-ידי ניתוח הנתונים שנאספו מתוך שיטת הדגירה, ניתן לזהות את התוצאה התחרותית של אינטראקציה ומנגנון האינטראקציה. כדוגמה, הניסויים הבאים בוצעו באמצעות V. פישרי בבודד. זנים מודדתיים המתעמדים אחד משני פלמיונים יציבים: pVSV102 ביטוי התנגדו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת הדגירה שתוארה לעיל מספקת שיטה רבת-עוצמה לגילוי תחרות בין-חיידקית. גישה זו אפשרה לזיהוי של התחרות התוך ספציפי בין V. פישרי מבודד ואפיון של מנגנון תחרותי19. למרות השיטה שתוארה היה אופטימיזציה עבור החיידק הימי V. פישרי, זה יכול להיות שונה בקלות כדי להכיל מינים חיידקיים אחרים, כולל מבודד קליני וסביבתי. חשוב לציין כי מנגנונים תחרותיים לעתים קרובות מוסדר מותנה5,6,23,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
ברצוני להודות לבודקים על המשוב המועיל שלהם. A.N.S. היתה נתמכת על ידי קרן גורדון ובטי מור באמצעות גרנט GBMF 255.03 לקרן המחקר למדעי החיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל | פישר | 05-408-129 | |
| 10 μ פיפטה | |||
| L 100 μ פיפטה | |||
| L 300 μ L פיפטה | |||
| 10 μ L פיפטה | |||
| 20 μ L פיפטה | |||
| 200 μ L פיפטה | |||
| ערוצית 1,000 μ צלחות L פיפטה | |||
| 24 בארות | פישר | 07-200-84 | סטרילי עם מכסה |
| 96 בארות | צלחות VWR | 10062-900 | סטרילי עם מכסה |
| מחשבון | |||
| כלורמפניקול | סיגמא | C0378 | מלאי (20 מ"ג/מ"ל באתנול); ריכוז סופי במדיה (2 μ g/mL LBS) |
| מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי עם מצלמה ותוכנת | |||
| מלקחיים | פישר | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | מלאי (100 מ"ג/מ"ל במים, עיקור מסנן); ריכוז סופי במדיה (1 μ גרם/מ"ל ליברות) |
| ממברנת ניטרוצלולוזה (FS MCE, 25 מ"מ, NS) | פישר | SA1J788H5 | 0.22 μ m קרום ניטרוצלולוזה (pk של 100) |
| צלחות פטרי | פישר | FB0875713 | סטרילי עם מכסה |
| ספקטרופוטומטר | |||
| קובטות חצי מיקרו | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μ L מערכת המתנע | USA Scientific | 1111-3500 | 10 מתלים |
| TipOne 200 μ מערכת המתנע L | USA Scientific | 1111-500 | 10 מתלים |
| TipOne 1000 μ L starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 מתלים |
| מערבולת | |||
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | הערות |
| LBS מדיה | |||
| 1 M Tris Buffer (pH ~ 7.5) | 50 מ"ל 1 מ"ל מאגר מלאי (62 מ"ל HCl, 938 מ"ל DI מים, 121 גרם בסיס Trizma) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 גרם (הוסף רק לצלחות) |
| DI מים | 950 מ"ל | ||
| נתרן כלורי | פישר | S640-3 | 20 גרם |
| טריפטון | פישר | BP97265 | 10 גרם |
| תמצית שמרים | פישר | BP9727-2 | 5 גרם |
מקורות
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
