אנחנו לשכפל ולנתח גנים עיתונאי יצירת RNAs מעגלית. גנים כתבת אלה גדולים יותר מאשר בנייה כדי לנתח שחבור ליניארי ולהכיל Alu אלמנטס. כדי לחקור את RNAs מעגלית, המבנים הם מנותחים לתוך תאים וכתוצאה מכך RNA מנותח באמצעות RT-PCR לאחר הסרת RNA ליניארי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית
במאמר זה
סיכום
תקציר
בנוסף mrnas ליניארי, הרבה גנים איקריוטית ליצור rnas מעגלית. מרבית ה-RNAs המעגלי מופקים על-ידי הצטרפות לאתר של 5 ' אחוי עם אתר אחוי במעלה 3 ' בתוך מקדם-mRNA, תהליך הנקרא שחבור חזרה. מעגליות זה עשוי לסייע על ידי מבנים משניים ב-pre-mRNA המביאים את האחוטים לקרבת מקומות. בגנים האנושיים, alu אלמנטס נחשבים לקידום אלה מבנים RNA משני, כמו alu אלמנטס הם שופע בסיס התצוגה משלימה אחד עם השני כאשר נוכח הכיוונים הנגדיים ב pre-mrna. כאן, אנו מתארים את הדור ואת הניתוח של גדול, Alu אלמנט המכיל גנים עיתונאי היוצרים rnas מעגלית. באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקולי שיבוט, גנים עיתונאי עם עד 20 kb אורך להוסיף ניתן ליצור. הניתוח שלהם בניסויים מאפשר זיהוי של גורמי רגולציה. כך, שיטה זו יכולה לזהות רצפי RNA ורכיבים סלולריים המעורבים במערך RNA מעגלי.
מבוא
RNAs מעגלית
RNAs מעגלית (circRNAs) הם סגורים בודד שנתקע יחיד RNAs אשר מבוטא ברוב האורגניזמים. הם מופקים על ידי הצטרפות במטה 5 ' אחוי אתר לאתר במעלה 3 ' אחוי, תהליך הנקרא שחבור חזרה (איור 1א)1. רצפים של pre-mRNA כי התערוכה בסיס משלימה קצר כמו 30-40 nt להביא החזרה האתר ליישור הנכון עבור מערך circRNA2. בבני אדם, Alu אלמנטס1, המייצג כ -11% של הגנום3, טופס נרחב כפול תקוע מבנים RNA ב pre-mrna בשל העצמיות העצמית שלהם4,5 ובכך לקדם את היווצרות circrn....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. עיצוב המבנים
- השתמש בדפדפן UCSC הגנום24 לזהות אלמנטים חוזרים הדרושים עבור היווצרות RNA מעגלי ולשלב אותם במבנים. חשוב ביותר, התחל הגברה של הצורך להיות מחוץ ליסודות החוזרים.
- הדבקת רצף ה-RNA המעגלי (איור משלים 1 הוא רצף מבחנים) לתוך https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start ובחר את האורגניזם הנכון. שלח את הרצף ועבור לתצוגת דפדפן, הקטן את המרחק של 1.5 x או מתאים (איור 2א).
הערה: רצף החיפוש מופיע בשורה העליונה (איור 2א, 1).....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
גנים עיתונאי לאפשר נחישות של גורמים הרגולציה המשפיעים על היווצרות RNA מעגלי. עם זאת, גנים כתבת אלה הם גדולים ומכילים אלמנטים חוזרים כי לעתים קרובות לעשות בנייה DNA לא יציב. בשל גודלם הגדול, לעתים קרובות יש צורך למחוק חלקים של introns, אשר מושגת על ידי הגברה של חתיכות גנומית המכילה exons וחלקים קטנים האגפים. אלה יצירות DNA התאספו באמצעות אנזימטי, המאפשר בנייה ללא אנזימים הגבלה.
הדוגמה של RNA מעגלי שנוצר מתוך מיקרוכדורית טאו החלבון המשויך (MAPT) מראה יישום של הגישה minigene לנתח RNAs מעגלית. הטא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באופן כללי, RNAs מעגלית נמוך1שופע, אשר מסבך את המחקר של התפקוד שלהם ואת המבנה. בדומה RNAs ליניארי13, השימוש של מיניגנים הכתב מאפשר זיהוי של העמים וגורמים טרנס משחק המסדירים את היווצרות rnas מעגלית. לפיכך, גישה זו יוצרת השערות שניתן לבחון עוד יותר באמצעות הגנים האנדוגניים.
הצעד הקריטי ביותר הוא העיצוב של הגן של העיתונאי. ההרכבה האנזימטית של שברי הדנ א ("שיבוט גיבסון"27) מקלה על עיצוב זה, שכן היא מאפשרת בנייה של גנים כתבת גד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. אין מה לגלות
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי משרד ההגנה משרד הביטחון מענק AZ180075. סטפן סטאם, תודה לז של ז'קלין נונן אנה פאולוצ'ין נתמכת על ידי ה-DAAD, התוכנית האקדמית הגרמנית, ג'סטין R. Welden היה מקבל את הפרס של אוניברסיטת קנטקי מקס סטקלר.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| כלי בונה | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | של קלייר מחקר | ||
| NEB | E2621S | ||
| ערכת ניקוי ג'ל ו-PCR | Promega | A9282 | |
| גליקו כחול | תרמו פישר | AM9516 | |
| pcDNA3.1 אתר שיבוט | אתר | שיבוטhttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA פולימראז |
| פולימראז 2 | Biorad | 1725310 | פולימראז לטווח ארוך (NEB), iproof (BioRad) |
| פולימראז 2 | Qiagen | 206402 | ערכת פולימראז לטווח ארוך Qiagen |
| Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
| ערכת בידוד RNA | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| תאים מוכשרים יציבים | NEB | C3040H | NEB תאים יציבים |
| שיבוט סטנדרטיים | NEB | C2988J | NEB5-alpha |
| כלי אינטרנט מוכשר לעיצוב פריימרים | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| חישובי טמפרטורה מבוססי אינטרנט | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
מקורות
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
