הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

8.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59800

⸱

31 באוגוסט 2019

 ,  ,  ,  , 
1Organic and Medicinal Chemistry Division, CSIR-Indian Institute of Chemical Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

תקציר

תרבות תא העצב העיקרי היא טכניקה חיונית בתחום המוח. כדי לזכות בתובנות מכניסטיות עמוקות יותר במוח, חיוני להיות בעלי מודל מתורבת שניתן לנצל למחקרים שונים בנוירוביולוגיה. למרות התרבויות הראשיות של תא העצב (כלומר, לטווח ארוך בתרבויות ההיפוקמפוס) סיפקו מדענים עם דגמים, הוא עדיין לא מייצג את המורכבות של רשת המוח לחלוטין. בעקבות מגבלות אלה, מודל חדש התפתחה באמצעות נוירוספירות, אשר נושא דמיון קרוב יותר לרקמת המוח. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ציפוי של צפיפות גבוהה ונמוכה של קליפת המוח המעורב ואת הנוירונים היפוקמאל מבודדים מן העובר של היום העובריים 14-16 החולדות של הג דאוד. זה מאפשר את הדור של נוירוספירות ותרבות תא העצב העיקרי לטווח ארוך כמו שתי פלטפורמות עצמאיות לבצע מחקרים נוספים. תהליך זה הוא פשוט מאוד חסכוני, כפי שהוא ממזער מספר שלבים וריאגנטים שנחשבו בעבר חיוני לתרבות העצב. זהו פרוטוקול יציב עם דרישות מינימליות שניתן לבצע עם תוצאות השגה ושימוש נוסף עבור מגוון של מחקרים הקשורים למדעי המוח.

מבוא

המוח הוא מעגל מורכב של תאים עצביים ולא עצביים. במשך שנים, מדענים מנסים. להשיג תובנה במכונות המורכבות האלה כדי לעשות זאת, מדענים נוירו, בתחילה נקטו בקווים שונים של תאי עצב מבוססי העצבים לחקירות. עם זאת, חוסר היכולת של הקווים האלה תא שבטים ליצור קשרים סינפטית חזקים ואקסונים הנכון או דנדטים העבירו עניין מדעי לתרבויות תא העצב העיקרי1,2. ההיבט המרגש ביותר של תרבות תא העצב העיקרי הוא שזה יוצר הזדמנות להתבונן ולתפעל נוירונים חיים3. כמו-כן, היא מורכבת פחות לעומת רקמת העצבים, מה שהופך אותו למועמד אידיאלי לחקר התפקוד וההובלה של חלבונים עצביים שונים. לאחרונה, מספר התפתחויות בתחומים של מיקרוסקופ, גנומיקה, ו פרוטאומניקס יצרו הזדמנויות חדשות עבור נוירומדענים לנצל את תרבויות תא העצב4.

התרבויות הראשיות הרשו לנוירומדענים לחקור את המנגנונים המולקולריים שמאחורי ההתפתחות העצבית, לנתח מסלולים שונים של אותות עצביים, ולפתח הבנה ברורה יותר של synapsis. למרות שמספר שיטות דיווחו על תרבויות מפני הנוירונים הראשוניים (בעיקר ממקור ההיפוקמאל5,6,7), פרוטוקול אחיד עם מדיום מוגדר כימית המאפשר תרבות ארוכת טווח של נוירונים הוא עדיין צריכים עם זאת, נוירונים מצופה בצפיפות נמוכה מתבוננים בדרך כלל, אשר לא לשרוד לטווח ארוך, כנראה בשל חוסר תמיכה הזנה8 כי הוא סיפק את הנוירונים הסמוכים תאים גליה. שיטות מסוימות אפילו הציע co-culturing של הנוירונים העיקריים עם תאים גליה, שבו התאים גליה משמשים כשכבת ממזין9. עם זאת, תאים גליה להוות הרבה בעיות עקב צמיחת יתר שלהם, אשר לפעמים לעקוף את הצמיחה עצבי10. מכאן, בהתחשב בבעיות לעיל, חובה פשוטה וחסכונית יותר הפרוטוקול העיקרי התרבות העצבית נדרשת, אשר ניתן להשתמש הן נוירוביולוגים והן נוירוכימאים לחקירות.

תרבות תא העצב העיקרית היא למעשה צורה של תרבות דו-ממדית ואינה מייצגת את הפלסטיות, השלמות המרחבית, או הטרוגניות של המוח. זה נתן את הצורך במודל תלת-ממד אמין יותר בשם נוירוספירות11,12. נוירוספירות להציג פלטפורמה רומן מדענים נוירו, עם דמיון קרוב יותר למציאות, במוח vivo13. נוירוספירות הם לא מחסיד אשכולות תלת-ממד של תאים עשירים בתאי גזע עצביים (NSCs), בתאי מחולל קדמון (NPCs), נוירונים, ו astrocytes. הם מקור מצוין עבור בידוד של תאי גזע עצביים ותאים מחולל קדמון, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד בידול לתוך שונים עצביים ושאינם עצביים. שוב, השונות בתוך תרבויות נוירוספירה המיוצר באמצעות הפרוטוקולים שדווחו קודם לכן מציג מחסום לניסוח של פרוטוקול נוירוספירה מאוחדת התרבות14.

כתב יד זה מציג פרוטוקול שבו ניתן ליצור הן 2D ו-3D פלטפורמות על ידי הציפוי תאים מתחלפים משולב של קליפת המוח מעורב היפוקמאל. הוא ציין כי בתוך 7 ימים חופשי-צפה נוירוספירות מתקבלים מפני נוירונים בצפיפות גבוהה מצופה מבודדים מ-E14-E16 ספראג העובר עכברוש דטרלי, אשר על תרבות נוספת, גשרים טופס והתקשרויות באמצעות הרחבות מדומה glial-. באופן דומה, בצפיפות נמוכה מצופה נוירונים, תרבות תא העצב העיקרי שניתן לשמור עד 30 ימים מושגת על ידי שינוי המדיום תחזוקה פעמיים בשבוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים הכרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים של CSIR-הודי מכון לביולוגיה כימית (IICB/AEC/פגישה/אפריל/2018/1).

1. הכנה מגיב ומדיה

  1. פתרון ליזין-D (PDL): להכין פתרונות PDL בריכוזים של 0.1 mg/mL במים מוכי ובחנות ב 4 ° צ' עד השימוש.
  2. מדיום דיסוציאציה: ל-1 L של מים סטריליים, מסוננים מסונן, לשלב את הרכיבים הבאים בריכוזים המתאימים: נתרן כלוריד (8 מ"ג/mL), אשלגן כלוריד (0.4 mg/mL), אשלגן פוספט חד-בסיסי (0.06 mg/mL), D-גלוקוז (1 מ"ג/mL), נתרן פוספט dibasic (0.479 מ"ג/mL), ו 1 M הפסי [4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה; 10 מ"מ]. מערבולת כל המרכיבים כדי לסייע ערבוב נכון ולאחסן 4 ° צ' עד השימוש.
    הערה: השתמש באמצעי הדיסוציאציה בצורת קרח קר במהלך הדיסוציאציה, אך בטמפרטורת החדר (RT) לכביסה ולמטרות אחרות.
  3. ציפוי בינוני: ציפוי בינונית מורכב מהפעולות הבאות: בינוני חיוני מינימלי (הגברת) של נשר עם פתרון מלח מאוזן של ארל (BSS; 88.4%), D-גלוקוז (0.6%), סרום סוסים (10%), ופניצילין/סטרפטומיצין (1%). לשלב את הרכיבים ביחס המתאים ולבצע את ההליך בתוך ברדס תחת תנאים סטריליים.
    הערה: השתמש תמיד במדיום ציפוי טרי כדי למנוע השפלה של כל רכיב.
  4. תחזוקה בינונית: להכין את המדיום תחזוקה על ידי שילוב הבאים ביחס המתאים: neurobasal סיס מדיום (97%), 0.5 mM מסחרי מדגם גלוטמין, B27 סרום ללא תשלום (2%), ו פניצילין/סטרפטומיצין (1%). לשלב את הרכיבים ביחס המתאים ולבצע את ההליך בתוך ברדס תחת תנאים סטריליים. ודא כי כל הרכיבים מוכנים טרי.

2. הכנת שמיכות

  1. קח בקוטר 12 מ"מ שמיכות זכוכית עגול ולהשרות אותו בחומצה הידרוכלורית 1 M (HCl) עבור 4 h.
  2. להעביר את הכיסויים במים מזוקקים באמצעות זוג מלקחיים מערבולת בעדינות כדי להיפטר חומצה לחלוטין.
  3. העבר את הכיסויים שנשטפו עבור סיבוב נוסף של ניקוי בגביע המכיל 100% אתנול.
  4. לפני השימוש הכיסויים, לייבש אותם היטב במכסה המנוע על ידי שמירה עליהם על נייר טישו.

3. הכנת צלחות פולי-ליזין מצופות לתרבות תא העצב

  1. קח 2 24 צלחות טוב: אחד לציפוי בצפיפות גבוהה ואחר ציפוי צפיפות נמוכה. פתח את המנות הסטריליות רק בתוך המכסה המנוע.
  2. להעביר את 12 מ"מ של שמיכות זכוכית סטרילי ב 24 לוחות היטב.
  3. יוצקים 300 μL של פתרון PDL (0.1 mg/mL במים מוכי) בכל טוב, כך שהוא מכסה באופן מלא את פני השטח של שמיכות.
  4. עוטפים את הצלחות עם רדיד אלומיניום כדי למנוע ייבוש ולשמור אותו ב-CO2 חממה בלילה.
  5. למחרת (לפני ציפוי), מטפי את הפתרון PDL ולשטוף כראוי עם 300 μL של מים מעוקרים סטרילי פעמיים עד שלוש פעמים.
  6. הוסיפו 200 μL של מדיום ציפוי טרי והחזר את הצלחות לחממה עד לציפוי.

4. הסרת ועריפת ראשו של העובר

הערה: לעקר את כל כלי הניתוח הארוזים ברדיד אלומיניום ב-121 ° צ' (15 psi) במשך 30 דקות. זה כולל זוג מספריים בוטה-קצה, מלקחיים, מלקחיים עדינים, שני מספריים עדינים, ומלקחיים עורק אחד לכל ההליך כולו.

  1. ליצירת נוירונים וכדורים נוירו, השתמש בעכבר בזמן ההריון בזמן הריון ולסמן את היום עם זיהוי תקע הנרתיק כמו E0.
    הערה: יש לבצע את התרבות בין E14-E16.
  2. ביום התרבות, מניחים צלחת פטרי זכוכית סטרילית על הקרח ולמלא אותו עם פתרון מלח קר מאוזנת של האנק (HBSS).
  3. הE14-E16 עכברוש בהריון עם הזרקה של הצפק (כיתה) של 90 מ"ג קטמין/ק ג של משקל הגוף 10 מ"ג xylazine/ק"ג, ואז להקריב על ידי ביצוע פריקה צוואר הרחם.
    הערה: ניתן לקבל חולדות גם על ידי מנת יתר של פנטוברביטל או מנת יתר של קטמין עם xylazine או דיאזפם.
  4. לחטא את הבטן של הסכר על ידי ריסוס 70% אתנול ולעשות חיתוך בצורת V באזור הבטן באמצעות מלקחיים סטרילית וזוג מספריים קהה-קצה.
  5. קחו את השקי העובריים בזהירות על צלחת פטרי עם פתרון HBSS קר.
    הערה: אין להשתמש באותם מלקחיים ומספריים ששימשו רק לצורך העור, שכן הדבר יזהם את האברים הפנימיים. השתמש בערכה שונה של מספריים/מלקחיים עבור האיברים הפנימיים.
  6. קח את העוברים מתוך השקי העובריים בתוך הHBSS הטרי והקר.
  7. . ערוף את ראשו במספריים סטריליים

5. הסרת המוח והניתוח של הקליפה עם ההיפוקמפוס

  1. לפני שמתחילים, ממלאים 90 מ"מ מנות פטרי סטרילי, עם HBSS קר וסטרילי.
  2. להעביר את הראשים בכלים סטרילי באמצעות מלקחיים ההלבשה סטרילי, בוטה הסתיימה.
  3. תחת stereomicroscope, להחזיק את הראש מאזור החוטם עם מלקחיים סטרילי, משונן ולהסיר את המוח על ידי חיתוך העור והגולגולת פתוח.
  4. לאסוף את כל המוח העובר באותו אופן בפתרון HBSS.
  5. להסיר את כל מקרום המוח מהאונות ומידות על ידי החזקת גזע המוח.
  6. להסיר בזהירות את האונות ללא שינוי דמוי פטריות כמוסות המכילות את ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח.
  7. לאסוף את האונות המכילה את קליפת ההיפוקמפוס בשלמותו בצינור 15 מ ל חרוט המכיל 10 מ ל של מדיום הדיסוציאציה.

6. דיסוציאציה של רקמה קורטיקלית והיפוקמאל לנוירונים בודדים

  1. הרשו לרקמות שנאספו להתיישב ולחלק את מדיום הדיסוציאציה, ומשאירים 5%-10% מהמדיום.
  2. הוסיפו 10 מ ל של מדיום דיסוציאציה טרייה לרקמה, וחזרו על שלב 6.1 פעמיים.
  3. הוסף 4.5 mL של הדיסוציאציה בינונית ו 0.5 mL של 0.25% (1x) טריפסין EDTA (אתילן הטטראצטט) פתרון.
  4. שמרו את הרקמה בחממה ב-37 ° c למשך 20 דקות כדי שתהיה העיכול להמשיך.
  5. מנושף את המדיום ומוסיף 10 מ ל לדיסוציאציה ולציפוי מדיום ברציפות לרקמות הממעוטות.
  6. הרשו לרקמות העיעוטות להתיישב ולהוריד את מדיום הדיסוציאציה. להוסיף 2.5 mL של ציפוי בינוני ולשפוך לתוך הבסיס של 90 מ"מ צלחת סטרילית.
  7. Triturate את הרקמות מתעכל בבסיס הפינה של המנה באמצעות טיפ 1,000 μL הצנרת לכבוש את נפח מינימלי.
  8. להעביר את ההשעיה התא המתקבל דרך מסננת תא 70 יקרומטר, למעט כל נתחי רקמות.
  9. קבע את צפיפות התאים הניתנים לשימוש בשיטת האי-הכללה של הצבע הכחול וספור את מספר התאים במונה תאים אוטומטיים.
    1. עבור טרימין כחול שיטת הדרה, לקחת 10 μL של ההשעיה התא ו 10 μL של 0.4% טרימין כחול כתם, לערבב ביסודיות, ולהוסיף 10 μL של התערובת באחד משני התאים הסגורים של השקופיות קאמרית חד פעמיות.
    2. הכנס את השקופית המכילה את התערובת לתוך מונה התא וקבל את הקריאה.
      הערה: שיטת ההדרה של הצבע הכחול מתבססת על העיקרון שתאים חיים (בשל הקרומים האחרים שלהם) לא יכללו את הצבע הכחול, ומכאן יראו ציטופלסמה ברורים, בהשוואה לתא שאינו בר קיימא, שייקח בקלות להשתלט על הכחול ויופיע כחול ב . בצבע15
  10. לדלל את מספר התאים המתקבלים צלחת 1.5 x 105 תאים/ml עבור צפיפות גבוהה ו 20,000 תאים/mL עבור צפיפות נמוכה בשני צינורות נפרדים המכילים 30 מ ל כל אחד המדיום ציפוי.
  11. מנושף את בינונית ציפוי שנוספו בעבר מכל טוב צלחת 500 μL של תאים התפזרו במדיום ציפוי בכל טוב.
  12. לאחר מכן להחזיר את הצלחות לחממה ב 37 ° c ו 5% CO2 עבור 4 h.
  13. בדקו את התאים לדבקות מתחת למיקרוסקופ 4 שעות הציפוי.
  14. אם יש הדבקות הנכון של התאים בשתי הצלחות, להחליף את המדיום בכל טוב עם 500 μL של תחזוקה ומדיום בינוני טרי ב 37 ° c.
  15. תרבות אלה הנוירונים גדלו בצפיפות נמוכה עבור 30 ימים על ידי שינוי המדיום תחזוקה 2x בשבוע.
  16. תרבות הנוירוספירות המתקבלות מנוירונים מצופים בצפיפות גבוהה באותו מדיום תחזוקה על ידי העברתם ללוחות המצורפים האולטרה-נמוכים.
  17. אפיון הנוירונים והנוירוספירות על-ידי חיסוני מכתים אותם עם סמנים חשובים. עבור האימונוציטוכימיה, ראשית לתקן את התאים/נוירוספירות באמצעות 4% פורמלדהיד עבור 30 דקות על הצלחת עצמה, ולאחר מכן לחלחל את התאים עם 0.1% שאינם יוניים לניקוי עבור 10 דקות.
  18. הוסף נוגדנים עיקריים עבור הנוירונים הן (anti-Tuj1, GFAP, O4, טאו) ו נוירוספירות (אנטי Nestin, GFAP, Tuj1) ב פוספט-מלוחים באגירה (PBS) ב 1:300 ריכוזי ו-דגירה לילה ב 4 ° c16.
    הערה: Tuj1 (השלישי III β-טובולין) ו-הטאו הם סמנים חיוביים עבור הנוירונים העיקריים, בעוד gfap (glial fibrillary חלבון חומצי) ו O4 (אוליגודנדרוציטים סמן) הם סמנים שליליים עבור נוירונים ראשוניים17,18. במקרה של נוירוספירות, Tuj1, gfap, ו nestin כולם לשמש סמנים חיוביים19,20.
  19. למחרת, לשטוף את התאים עם PBS פעם או פעמיים ולהוסיף נוגדנים משניים המתאים PBS ב 1:600 ריכוזים ב RT עבור 2 h.
    הערה: הנוגדנים המשניים נגד העכבר או נגד הארנב נבחרים בהתאם למינים המארחים של הנוגדן העיקרי הוסיף. יש לזכור כי על הנוגדנים המשניים להיות מצומנת לנגזרות של זריחה המתאימה למטרות המיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
  20. שטוף את התאים שוב פעם או פעמיים.
    1. בצע כתמים גרעיניים של התאים עם Hoechst 33258 (1 מ"ג/mL פתרון מניות במים מוהים). הכן 0.1% הפתרון ב-PBS מתוך פתרון המניה ולהוסיף אותו לתאים.
    2. מודיית את התאים עם 0.1% הפתרון עבור 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף שוב עם PBS.
  21. הוסף 20 μL PBS (או הרכבה בינונית) בשקופית והבהר באיטיות את הכיסויים המכילים את התאים המוכתמים על אזור השקופית המכילה את ה-PBS. סגרו את שולי הכיסויים בפוליסטירן מוקצף שמנת (DPX).
  22. בצע הדמיה של התאים הקבועים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 10x ו-40x.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בפרוטוקול זה הובהר אסטרטגיה פשוטה שבה מתקבלים צפיפות תאים משתנה משתי פלטפורמות שונות של הקרנה עצבית. איור 1A,B ממחיש את הדבקות של תאים לאחר 4 h של ציפוי הנוירונים בתאים גבוהים ומצופים צפיפות נמוכה, בהתאמה. על התבוננות נכונה של הנוירונים כפי שמוצג באיור 1, מדיום הציפוי הוחלף באמצעי תחזוקה בכל אחת מהבארות, ובכך, חזר לחממה ב 37 ° c. הדבקות התא יחסית יותר נצפתה בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. לאחר 24 שעות של ציפוי, בצפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד על ידי שינוי צפיפויות הציפוי של תאים של נוירונים ראשוניים, שני פלטפורמות עצבי משתנה מתקבלים. למרות זאת היא שיטה פשוטה, כל צעד צריך להתבצע בקפדנות כדי להשיג את התוצאות הרצויות. שיטות קודמות אחרות דיווחו על תרביות נוירונים בטווח הארוך או בתרבויות נוירוספירה. רוב הפרוטוקולים הראשוניים של תרבות העצב יש לערב את culturing של נוירונים היפוקמאל עבור 3-5 שבועות, אבל רובם נכשלו, כמו הנוירונים למות ו לנבול בשל אובדן של חיבורים. יתרון נוסף של הפרוטוקול הוא כי הנוירונים יכולים להיות מתורבתים ללא צורך בכל שכבת ממ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים CSIR-IICB מתקן בעלי חיים. ד. נ. תודה ICMR, J. K. ו-V. G תודה שעון השראה, ו D. M. תודה DBT, הודו עבור המלגות שלהם. ס. ג. באדיבות מודה סרבית (EMR/2015/002230) הודו למתן תמיכה כספית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי-GFAPAbcamAB7260
אנטי-נסטיןאבקאםAB92391
אנטי-O4MilliporeMAB345
אנטי-טאואבקאםAB76128
אנטי-Tuj1MilliporeMAB1637
B27 סרום ללא תוסף Gibco17504-044
Cell CounterLife טכנולוגיותCountess II FL
CO2 אינקובטוראפנדורףגלקסי 170 R
D-גלוקוז SDFCL38450-K05
אתנולMerck Milliporeמיקרוסקופ
אולימפוסIX83 דגם
פורמלדהידסיגמא אולדריץ'47608
תוסף GlutaMax-IGibco35050-061
GtXMs IgG פלואורMilliporeAP1814
GtXMs IgG (H+L)MilliporeAP124C
HEPESSRL16826
Hoechst 33258Calbiochem382061
סרום סוסים HiMediaRM10674
חומצה הידרוכלוריתRankemH0100
קולט אדים למינריBioBaseBBS-V1800
MEM Eagle' s עם ארל' s BSS סיגמא אולדריץ'M-2279
מיקרוסקופDewinterניצחון
מדיום נוירובזאלי Gibco21103-049
כלי פלסטיק (צלחת 24 בארות, מסנני תאים וצלחות הדבקה נמוכות)BD Falcon353047, 352350 ו-3471
90 מ"מ פטרידישHimediaPW001
פניצילין/סטרפטומיצין Gibco15140-122
פולי-D-ליזיןMilliporeA.003.E
אשלגן כלורי פישר סיינטיפיקBP366-500
אשלגן פוספט מונובסיסי MerckMI6M562401
נתרן כלורי Qualigem15918
נתרן פוספט דו-בסיסי MerckMI6M562328
StereomicrosopeDewinterZoomstar דגם
Triton-X 100SRL2020130
Trypan Blue SolutionGibco15250-061
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-072
פלואורסצנטי 100983 דגם

מקורות

  1. Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
  2. Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
  3. Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
  4. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
  5. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
  6. Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797(2016).
  7. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703(2014).
  8. Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
  9. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  10. Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
  11. Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
  12. Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
  13. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  16. Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
  17. Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
  18. Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  19. Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
  20. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
  21. Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449(2014).
  22. Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
  23. Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
  24. Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467(2015).
  25. Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
  26. Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

יצירת נוירוספירותתרבית נוירונים ראשוניתנוירונים קורטיקליים היפוקמפלייםצפיפות זריעת תאיםעיכול באמצעות Trypsin EDTAבדיקת חיוניות באמצעות Trypan Blueבדיקת חיוניות MTTאפיון באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימיתגרעינים בצביעת Hoechst 33258
הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.