מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרבות תא העצב העיקרי היא טכניקה חיונית בתחום המוח. כדי לזכות בתובנות מכניסטיות עמוקות יותר במוח, חיוני להיות בעלי מודל מתורבת שניתן לנצל למחקרים שונים בנוירוביולוגיה. למרות התרבויות הראשיות של תא העצב (כלומר, לטווח ארוך בתרבויות ההיפוקמפוס) סיפקו מדענים עם דגמים, הוא עדיין לא מייצג את המורכבות של רשת המוח לחלוטין. בעקבות מגבלות אלה, מודל חדש התפתחה באמצעות נוירוספירות, אשר נושא דמיון קרוב יותר לרקמת המוח. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ציפוי של צפיפות גבוהה ונמוכה של קליפת המוח המעורב ואת הנוירונים היפוקמאל מבודדים מן העובר של היום העובריים 14-16 החולדות של הג דאוד. זה מאפשר את הדור של נוירוספירות ותרבות תא העצב העיקרי לטווח ארוך כמו שתי פלטפורמות עצמאיות לבצע מחקרים נוספים. תהליך זה הוא פשוט מאוד חסכוני, כפי שהוא ממזער מספר שלבים וריאגנטים שנחשבו בעבר חיוני לתרבות העצב. זהו פרוטוקול יציב עם דרישות מינימליות שניתן לבצע עם תוצאות השגה ושימוש נוסף עבור מגוון של מחקרים הקשורים למדעי המוח.
מבוא
המוח הוא מעגל מורכב של תאים עצביים ולא עצביים. במשך שנים, מדענים מנסים. להשיג תובנה במכונות המורכבות האלה כדי לעשות זאת, מדענים נוירו, בתחילה נקטו בקווים שונים של תאי עצב מבוססי העצבים לחקירות. עם זאת, חוסר היכולת של הקווים האלה תא שבטים ליצור קשרים סינפטית חזקים ואקסונים הנכון או דנדטים העבירו עניין מדעי לתרבויות תא העצב העיקרי1,2. ההיבט המרגש ביותר של תרבות תא העצב העיקרי הוא שזה יוצר הזדמנות להתבונן ולתפעל נוירונים חיים3. כמו-כן, היא מורכבת פחות לעומת רקמת העצבים, מה שהופך אותו למועמד אידיאלי לחקר התפקוד וההובלה של חלבונים עצביים שונים. לאחרונה, מספר התפתחויות בתחומים של מיקרוסקופ, ג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסיוניים הכרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים של CSIR-הודי מכון לביולוגיה כימית (IICB/AEC/פגישה/אפריל/2018/1).
1. הכנה מגיב ומדיה
- פתרון ליזין-D (PDL): להכין פתרונות PDL בריכוזים של 0.1 mg/mL במים מוכי ובחנות ב 4 ° צ' עד השימוש.
- מדיום דיסוציאציה: ל-1 L של מים סטריליים, מסוננים מסונן, לשלב את הרכיבים הבאים בריכוזים המתאימים: נתרן כלוריד (8 מ"ג/mL), אשלגן כלוריד (0.4 mg/mL), אשלגן פוספט חד-בסיסי (0.06 mg/mL), D-גלוקוז (1 מ"ג/mL), נתרן פוספט dibasic (0.479 מ"ג/mL), ו 1 M הפסי [4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה; 10 מ"מ]. מערבולת כל המרכיבים כדי לסייע ערבוב נכון ולאחסן 4 ° צ' ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרוטוקול זה הובהר אסטרטגיה פשוטה שבה מתקבלים צפיפות תאים משתנה משתי פלטפורמות שונות של הקרנה עצבית. איור 1A,B ממחיש את הדבקות של תאים לאחר 4 h של ציפוי הנוירונים בתאים גבוהים ומצופים צפיפות נמוכה, בהתאמה. על התבוננות נכונה של הנוירונים כפי שמוצג באיור 1, מדיום הציפוי הוחלף באמצעי תחזוקה בכל אחת מהבארות, ובכך, חזר לחממה ב 37 ° c. הדבקות התא יחסית יותר נצפתה בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. לאחר 24 שעות של ציפוי, בצפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר כיצד על ידי שינוי צפיפויות הציפוי של תאים של נוירונים ראשוניים, שני פלטפורמות עצבי משתנה מתקבלים. למרות זאת היא שיטה פשוטה, כל צעד צריך להתבצע בקפדנות כדי להשיג את התוצאות הרצויות. שיטות קודמות אחרות דיווחו על תרביות נוירונים בטווח הארוך או בתרבויות נוירוספירה. רוב הפרוטוקולים הראשוניים של תרבות העצב יש לערב את culturing של נוירונים היפוקמאל עבור 3-5 שבועות, אבל רובם נכשלו, כמו הנוירונים למות ו לנבול בשל אובדן של חיבורים. יתרון נוסף של הפרוטוקול הוא כי הנוירונים יכולים להיות מתורבתים ללא צורך בכל שכבת ממ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים CSIR-IICB מתקן בעלי חיים. ד. נ. תודה ICMR, J. K. ו-V. G תודה שעון השראה, ו D. M. תודה DBT, הודו עבור המלגות שלהם. ס. ג. באדיבות מודה סרבית (EMR/2015/002230) הודו למתן תמיכה כספית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אנטי-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| אנטי-נסטין | אבקאם | AB92391 | |
| אנטי-O4 | Millipore | MAB345 | |
| אנטי-טאו | אבקאם | AB76128 | |
| אנטי-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 סרום ללא תוסף | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life טכנולוגיות | Countess II FL | |
| CO2 אינקובטור | אפנדורף | גלקסי 170 R | |
| D-גלוקוז | SDFCL | 38450-K05 | |
| אתנול | Merck Millipore | מיקרוסקופ | |
| אולימפוס | IX83 דגם | ||
| פורמלדהיד | סיגמא אולדריץ' | 47608 | |
| תוסף GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG פלואור | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| סרום סוסים | HiMedia | RM10674 | |
| חומצה הידרוכלורית | Rankem | H0100 | |
| קולט אדים למינרי | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle' s עם ארל' s BSS | סיגמא אולדריץ' | M-2279 | |
| מיקרוסקופ | Dewinter | ניצחון | |
| מדיום נוירובזאלי | Gibco | 21103-049 | |
| כלי פלסטיק (צלחת 24 בארות, מסנני תאים וצלחות הדבקה נמוכות) | BD Falcon | 353047, 352350 ו-3471 | |
| 90 מ"מ פטרידיש | Himedia | PW001 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | |
| פולי-D-ליזין | Millipore | A.003.E | |
| אשלגן כלורי | פישר סיינטיפיק | BP366-500 | |
| אשלגן פוספט מונובסיסי | Merck | MI6M562401 | |
| נתרן כלורי | Qualigem | 15918 | |
| נתרן פוספט דו-בסיסי | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar דגם | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
מקורות
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
