מאמר שיטה

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

DOI:

10.3791/59821

⸱

26 בספטמבר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעי הוא הבית למספר הגדול ביותר של תאים חיסוניים בגוף. המעי קטן וגדול מערכת חיסונית המשטרה חשיפה לאנטיגנים אקסוגני ולווסת את התגובות החזק מיקרוביואלי החיסון הנגזרות. מסיבה זו, המעי הוא אתר היעד העיקרי של חוסר תקנה חיסונית ודלקת במחלות רבות, כולל אבל, לא מוגבל למחלות מעיים דלקתיות כגון מחלת קרוהן כיבית קוליטיס, השתל-מול-מארח מחלה (GVHD) לאחר העצם השתלת מח עצם (BMT), ומצבים אלרגיים וזיהומיות רבים. מודלים murine של דלקת במערכת העיכול ו קוליטיס משמשים בכבדות כדי לחקור סיבוכים GI ו-קלינית מיטוב אסטרטגיות למניעה וטיפול. נתונים שנאסף מן המודלים האלה באמצעות בידוד וניתוח פנוטימית של תאים חיסוניים מן המעי הוא קריטי כדי הבנה חיסונית נוספת שניתן להחיל על מערכת העיכול שפר הפרעות דלקתיות מערכתית. דו ח זה מתאר פרוטוקול אפקטיבי ביותר לבידוד של תאים מוננועיים (MNC) מהמעי הגס באמצעות ממשק מעבר הדרגתי מעורב בדחיסות מבוססת סיליקה. שיטה זו בונה מבודד מספר משמעותי של לוקיציטים קיימא תוך מזעור פסולת מזהם, ומאפשר פנוטיפים החיסונית הבאים על ידי הזרימה cy, try או שיטות אחרות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות מערכת העיכול (GI) במערכת מוקדש בעיקר עיבוד וספיגה חוזרת של חומרים מזינים מזון, במערכת GI גם שומר על תפקידים מרכזיים ביושרה של כלי הדם, הלימפה, והעצבים של איברים רבים אחרים באמצעות המערכת החיסונית שלה submucosal1. מערכת החיסון GI יש תפקיד רב השפעה הן בריאות המערכת העיכול ומערכתית בשל החשיפה המתמדת שלו אנטיגנים זרים ממזון, בקטריה של הקומנדנט, או פולשים פתוגנים1,2. לכן, מערכת החיסון GI חייב לשמור על איזון עדין שבו היא סובלנית אנטיגנים שאינם פתוגניים תוך התגובה בהתאם אנטיגנים פתוגניים1,2. כאשר האיזון של סובלנות והגנה מופרת, מקומי או מערכתית החיסונית חוסר תקנה ודלקת יכול להתרחש כתוצאה מספר עצום של מחלות1,2,3.

המעי נמלים לפחות 70% של כל תאי הלימפה בגוף4. האינטראקציות הראשוניות ביותר במערכת החיסונית כרוכות לפחות באחת משלוש תחנות החיסון במעי: 1. כתמים של Peyer, 2) לימפוציטים האפיתל (אל-על) ו-3) לימפוציטים באופן מרכזי (LPL). כל אלה מורכב רשת מורכבת מחוברים של תאים חיסוניים המגיבים במהירות לאתגרים החיסונית נורמלי בבטן5. מוגבל לסטרומה מעל המוסקולריס mucosae, מובנה לאמינה מובנית היא רקמת החיבור של רירית הבטן וכולל פיגומים על הוויאוס, הוזוקולטורה, ניקוז הלימפה, מערכת העצבים mucosae, כמו גם מולדים רבים ומערכת המשנה החיסונית. האדפטיבית6,7,8,9 LPL הם מורכבים CD4+ ו CD8+ T תאים ביחס משוער של 2:1, תאים פלזמה ותאים השושלת המייאלואידית כולל, תאים דנדריטים, התורן תאים, אאוזיפרפילים ו מקרופאגים6.

יש עניין הולך וגובר בהבנת הדיסתקנה החיסונית ודלקת הבטן כפי שהיא מתייחסת למצבי מחלה שונים. תנאים כגון מחלת קרוהן ו קוליטיס כיבית כל מניפסט רמות שונות של דלקת במעי הגס10,11,12. בנוסף, חולים עם הפרעות ממאירות או שאינן ממאירות של מח או מערכת החיסון אשר עוברים השתלת מח עצם allogeneic (allo-BMT) יכול לפתח צורות שונות של קוליטיס כולל 1) רעילות ישירה מתוך התניה משטרי לפני bmt, 2) זיהומים נגרמת על ידי דיכוי חיסוני לאחר bmt ו 3) השתל-מול-מארח מחלה (gvhd) מונע על ידי מסוג התורם תאים T מגיב התורם allo-אנטיגנים ברקמות לאחר bmt13,14,15. כל אלה post-bmt סיבוכים לגרום שינויים משמעותיים בסביבה החיסונית של המעיים16,17,18. השיטה המוצעת מאפשרת הערכה מהימנה של הצטברות תאים חיסוניים במעי הגס של העכבר, כאשר מוחל על הנמענים murine לאחר BMT, מקלה על היכולת היעילה של שני התאים החיסוניים של התורם והנמען המעורבים סובלנות השתלה19 ,20. גורמים נוספים לדלקות בטן כוללים ממאירות, אלרגיה למזון, או שיבוש מיקרובידום המעיים. פרוטוקול זה מאפשר גישה של תאים מונוליניים המעיים מן המעי הגס, עם שינויים, לוקיציטים של המעי הדק בכל אחד מדגמי murine אלה טרום קלינית.

חיפוש בתוך באמצעות מונחי החיפוש "המעי והתא החיסונית ובידוד" חושף מעל 200 פרסומים המתארים שיטות עיכול קטן כדי לחלץ תאים חיסוניים. עם זאת, החיפוש ספרות דומה לתשואות המעי הגס לא היטב פרוטוקולים המציין בידוד של תאים חיסוניים מן המעי הגס. זה יכול להיות בגלל המעי הגס יש יותר שרירי וביניים בשכבות, עיבוד זה קשה יותר לעכל לחלוטין מאשר המעי הדק. בניגוד לפרוטוקולים קיימים, פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי בקולאגנאז E מתוך קלוסטרידיום hiסטוליום ללא הקולגן האחרים בקטריות (קולאגנאז D/קולאגנאז I). אנו מדגימים כי, באמצעות פרוטוקול זה, העיכול של רקמת המעי הגס ניתן להשיג תוך שמירה על איכות הבטן מבודדים תאים חיסוניים ברורים (MNC) ללא תוספת של ריאגנטים נגד החלקה כגון נתרן versenate (EDTA), Dispase השני, ו ביטול הכרה i (dnase)21,22,23. פרוטוקול זה הוא ממוטב כדי לאפשר הפקת חזקה מיותרת של MNC קיימא מן הנקודתיים murine עבור מחקרים מכוונים נוספים צריך להשאיל את עצמו למחקר של אימונולוגיה של המעי הגס או (עם שינויים) את המעי הדק24, . עשרים וחמש

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים נערכו תחת פרוטוקולי מחקר מכרסמים שנסקרו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי מילר בית הספר לרפואה, אשר עונה על הסטנדרטים הוטרינרים שנקבעו על ידי האגודה האמריקנית עבור מדע בעלי חיים במעבדה (AALAS).

1. הכנת פתרונות

  1. כפי שמתואר בטבלה 1, להכין את מאגר המעי הגס, מבוסס סיליקה צפיפות ההפרדה מדיה 100%, סיליקה מבוססי צפיפות ההפרדה מדיה 66%, סיליקה מבוססי צפיפות ההפרדה מדיה 44%, כגון מאגר העיכול E, ו-FACS מאגר.
    1. הכן את מאגר המעי הגס ביום שלפני ההליך ואחסן לילה ב -4 ° c.
    2. להכין 100% סיליקה מבוסס צפיפות מדיה הפרדה ביום לפני ההליך ומאוחסן לילה ב 4 ° c, הצבת טמפרטורת החדר בבוקר של ההליך להפשיר.
    3. הכינו 66% ו-44% מדיית הפרדה מבוססת סיליקה בבוקר הבידוד, באמצעות טמפרטורת החדר 100% מבוסס על דחיסות סיליקה הפרדה מדיה ומאגר קולון.
    4. למדוד את הכמות המתאימה של היסטרידיוםהנגזרים-הנגזרת הקולגן וחנות ב-20 ° c לילה לפני ההליך. למחרת בבוקר, מתמוסס את הנפח המתאים של מאגר המעי הגס לגזור מאגר העיכול קולגן. עבור כל incubations עם מאגר העיכול קולגן ביום ההליך, לחמם מראש את הפתרונות 37 ° c.
  2. עבור כל שלבי הפרוטוקול, לשמור צנטריפוגה אחת ב 20 ° צ' ואת מהירות הסיבוב של 859 x g, עם הבלמים מופעל (0 להאט) עבור הדרגתי צנטריפוגה. הגדר אחר ל -4 ° צ' ומהירות סיבוב של 859 x g, עם ההאטה הסטנדרטית, לשטיפת המדרגות.

2. קצירת המעי הגס

  1. המתת חסד העכבר באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו aalac מאושר confirmatory שיטה.
  2. מניחים את העכבר במצב פרקדן ולרסס את הפרווה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים הרקמה הגדולה, לעשות חיתוך קו האמצע אנכית לחשוף את צפק שלם.
  3. , שימוש במספריים לחיתוך משובח. פתח את הצפק מלקחיים להשתמש כדי להזיז את המעי הקטן בצד אחד ולחשוף את המעי הגס יורד. משוך מעט כלפי מעלה על המעי הגס יורד כדי לחשוף את החלק הרקטלי של המעי הגס. חותכים את הרקטום העמוק באגן ומנתחים ומסירים את המעי הגס כולו כיחידה אחת, מהרקטום המרוחק לכובע cecal.
  4. העבר את המעי הגס ב 20 mL מקורר מאגר קולון בצינור פוליפרופילן 50 mL.

3. ניקוי המעי הגס

  1. מניחים את המעי הגס על מגבת נייר לחלח לחלץ את הצואה מוצק על ידי החלת לחץ קל על קיר המעי עם קצה קהה של מספריים או מלקחיים.
  2. מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי ומרוקן את הבטן עם 10 מ ל של מאגר קולון מקורר באמצעות מזרק 10 מ ל עם 18 גרם מילוי קהה.
  3. העבר את המעי הגס למאגר של מאגר המעי הגס, והסר את המצע המעי והשומן עם הקצה החד של המספריים.
  4. מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי מלא 5-10 mL מקורר מאגר המעי הגס מאוד באופן ידני כדי לשטוף את השאר תוכן חוקן. חזור על 2-3 פעמים.
  5. חותכים את longitudinally המעי הגס מן הקצה שלה שרירי יותר המעי הגס האבובית (יצירת פיסת המעי הגס בודד פתוח מלבני) בצלחת פטרי מלא עם מאגר המעי הגס טרי מקורר. התעלם ממדיה קיימת ומלא מילוי עם מאגר נקודתיים נקי ומקורר.
  6. לשטוף את המעי 3 פעמים על ידי במרץ מתערבל אותו בצלחת פטרי והחלפת 5-10 mL של מאגר קולון מקורר לאחר עם כל כביסה.
  7. מניחים את רקמת המעי הגס המלבנית על מגבת נייר שלחלח מאגר המעי הגס וחותכים אותו על ידי חיתוך אופקי ולאחר מכן לרסיסים קטנים (3 מ"מ x 3 מ"מ סעיפים).
  8. לאסוף את שברי המעי הגס בזהירות באמצעות מלקחיים עדין לתוך 20 מ"ל מקורר מאגר קולון בשפופרת פוליפרופילן 50 mL.
  9. לשטוף את שברי המעי הגס 3 פעמים, כל לשטוף ב 20 מ"ל מאגר המעי הגס, על ידי מתערבל במרץ את הצינור עבור 30 s. בין כל עצבנות, לאפשר שברי הרקמה להתיישב בתחתית הצינור. Decant או ואקום משאוב את supernatant תוך מניעת אובדן של הרקמה בתהליך השאיפה בין כל כביסה.
    הערה: אין צורך לשנות את הצינור לאחר כל כביסה.

4. קולגן העיכול 1

  1. הוסף 20 מ ל של מאגר העיכול קולגן כדי שברי המעי הגס שטוף בצינור 50 mL פוליפרופילן חרוט.
  2. מניחים את הצינור הסגור 50 mL ב 37 ° c בתוך שייקר מסלולית מודחטת עם קצב הסיבוב להגדיר ב 2 x g עבור 60 דקות. להבטיח את שברי הרקמה בתנועה מתמדת במהלך עצבנות; במידת הצורך, הגדילו את קצב הסיבוב בהדרגה כדי להבטיח שרסיסי רקמות לא יתיישבו לתחתית הצינורית.

5. הכנת מעברי צבע סיליקה מבוססי מדיה הפרדה

  1. הכינו 66% ו 44% מבוסס על דחיסות סיליקה מדיה הפרדה, באמצעות 100% מבוסס סיליקה צפיפות מדיה הפרדה ב 20 ° צ' (טמפרטורת החדר) ומאגר קולון.
  2. יוצקים 5 מ ל של 66% מבוסס סיליקה דחיסות הפרדה מדיה לתוך כל אחד 3 שונים 15 מ ל צינורות פוליפרופילן. להכין 3 צינורות לכל המעי הגס. פעולה זו מהווה את בסיס הצפיפות הגבוהה יותר של פרוצדורת הבידוד של מעבר הצבע, שאליה מדיה הפרדה בצפיפות נמוכה יותר תהיה שכבתית כדי ליצור את מעבר הצבע של ההפרדה.
  3. החנות ב -20 ° c עד השימוש.

6. אוסף של סופרנטאנט מעיכול 1

  1. לאסוף רק את supernatant באמצעות צינורות 25 מ ל ולסנן את supernatant באמצעות הנקבוביות 40 יקרומטר מסננת תא בד הממוקם לתוך צינור נקי של פוליפרופילן 50 mL, לאחר העיכול מקולגן 1 הושלמה. להיזהר לא לאכול כל שברי רקמה קיימים.
    הערה: שמור את כל חלקי הרקמה הגלויים בצינור. אלה יעברו העיכול השני הקולגן (שלב 8).

7. קוצ'ינג מאגר העיכול

  1. למלא את צינור פוליפרופילן 50 mL לחלוטין עם מאגר קולון מקורר.
    הערה: קולאגנאז פעיל ב 37 ° c; מכאן מאגר מקורר מפעיל את האנזים.
  2. צנטריפוגה את הצינור ב 4 ° צ' ב 800 x g עבור 5 דקות.
    1. השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום. לשטוף תאים עם 25 מ ל של מאגר קולון טריים צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות.
    2. השהה מחדש את הגלולה בפחות מ-1 מ ל של מאגר קולון טרי מקורר.
    3. מניחים את שפופרת פוליפרופילן 50 mL על קרח.

8. מיכל העיכול 2

  1. חזור על שלב 4 (עיכול 1) עם שברי הרקמה הנותרים שנשמרו משלב 6.1.

9. מצבור רקמות לאחר העיכול 2

  1. ריקון שברי הרקמה הלוך ושוב בין הצינור ומזרק 10 מ ל דרך מחט 18 G קהה-end.
  2. חזור על רצף זה למינימום של 7-8 מעברים מלאים, והמשך עד שלא ניתן לראות שברי רקמה ברוטו או פסולת.

10. סנן תאים

  1. להעביר את הבולם את הרקמה השעיה דרך מסננת מ40 μm-הנקבוביות תא בדים במרקם לתוך שפופרת נקי של פוליפרופילן 50 mL.
  2. לשטוף את הסינון תא בד מסננת עם 10 mL מקורר מאגר קולון כדי לשחזר את כל התאים הנסנרות במסנן.

11. קוצ'ינג קולינג העיכול

  1. ממלאים את צינור 50 mL פוליפרופילן חרוט לחישוק עם מאגר קולון מקורר.
    הערה: הטמפרטורה של מאגר המעי הגס הוא קריטי כדי להבטיח מקוצ'ינג של פעילות הקולגן.
  2. ספין ב 4 ° צ' ו 800 x g עבור 5 דקות.
  3. השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום.
  4. לשטוף על ידי השעיית מחדש 25 מ ל של מאגר קולון טרי מקורר, ואחריו צנטריפוגה ב 4 ° צ', 800 x g עבור 5 דקות.
  5. השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום.
  6. הבריכה את הגלולה מושעה מ העיכול הקולגן 1 (שלב 7) לצינור המקביל שלה משלב 11.4.
  7. חזור על שלב 11.4 (שטוף וצנטריפוגה).

12. הפרדת מדיה בצפיפות סיליקה מבוססת הפרדה

הערה: בצע את שלבים 12-18 במהירות האפשרית, כדי להבטיח מהירות מהירה של פעילות הקולגן.

  1. לאחר שלב 11.7, השהה מחדש כל גלולה ב-24 מיל סך של 44% מדיית הפרדה בדחיסות מבוססת סיליקה לכל נקודתיים.
  2. שכבה איטית 8 מ ל של התקשורת משלב 12.1 על כל אחד משלושת הצינורות המוכנים בשלב 5.2 (המכיל 66% הפרדה בצפיפות ההפרדה מדיה), באמצעות צינורות 10 מ"ל. שמור על זרימה יציבה ואיטית של 44% מדיית הפרדת הצפיפות באמצעות שכבות המילוי על מנת למנוע הפרעה של הממשק.
  3. איזון בזהירות כל הצינורות בתוך דליי צנטריפוגה באמצעות קנה מידה או שיווי משקל.
  4. ספין את הצינורות 20 דקות ב 859 x g בצנטריפוגה ללא בלם ב 20 ° c. אפשר לרוטורי להגיע למנוחה מוחלטת לפני הסרת הצינורות, ומטפלים לא לשבש את התאים בממשק מעבר הצבע.

13. לאסוף תאים מונמונומנט מתוך ממשק מעבר צבע

  1. המחש את ממשק מעבר הצבע (קרוב ל-5 מ"ל), שם בדרך כלל להקה לבנה בעובי 1-2 מ"מ (המכילה MNC) קיימת.
    הערה: אחד יכול או לא יכול לראות להקה לבנה. עם זאת, MNC יהיה בממשק זה, צריך לענן את הבהירות של ממשק מעבר הצבע.
  2. ואקום משאוב ולהשליך את העליון 7 מ ל של מעבר הצבע העליון כדי לאפשר הפיפטה קל גישה לממשק.
  3. באמצעות יניקה ידני שאיבה רציפה תנועה יציבה מסתובבת, לאסוף את שכבת הממשק של תאים לתוך צינור נקי 50 mL פוליפרופילן חרוט. לאסוף עד הממשק בין 2 הדרגתיות הוא ברור ו שבירה (ניקוי של תאים).
  4. ממלאים את צינור האוסף עם 50 mL של מאגר FACS מקורר. ספין ב 4 ° צ', 800 x g עבור 5 דקות.
  5. לשאוב את הסופר באמצעות שאיפה ואקום ולהשעות את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר FACS.
  6. לספור את התאים על הומוציטוטומטר בדילול 1:2 באמצעות שיטות אי הכללה של תא מת מתאים.
  7. המשך לצביעת FACS או מספר אחר עם המעי הגס מבודד טרי MNC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר עובדים עם מחלת המעי הגס מודל מודלים, זה מועיל להיות מסוגל להעריך הן לכמת באיכות איכותית, בין MNC של המעי הגס, מספר קבוצות מערכות החיסון מעורב בתהליך דלקתי. השעיית תא יחיד של MNC שהושג באמצעות היישום של פרוטוקול זה מאפשר אפיון פנוסטילי כזה בצורה איתנה וללא שימוש. כהוכחה לעיקרון היישום של שיטת בידוד זו תחת הגדרות ניסיוני מגוונות, החזרנו את המעי הגס באמצעות שיטה זו וביצעו מרובת פרמטרים זרימה cy, לנסות על תאים מבודדים מעכברים עם (איור 1 ו

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול חזותי זה מתאר שיטות נסבל היטב עבור בידוד של תאים מוננועיים במעי הגס כולל לימפוציטים קיננה (LPL). בהינתן כי פרוטוקול זה היה אופטימיזציה בהערכת חמור לאחר השתלת מודלים העכבר כאשר ציטוקינים דלקתיים ופציעה רקמות להשאיל את עצמם הכדאיות הירודה של MNC התאושש, אנו מצפים כי שיטות אלה ניתן לתרגם לאחרים יישומים המחייבים ניתוח פנוסטימית של חוקן MNC. אלה כוללים אך, אינם מוגבלים להערכת דלקת המעי הגס במודלים של העכבר של מחלת המעי הגס, מחקרים של תגובות החיסונית של טיפול קוליטיס ממוקד, קוליטיס המיוצר על ידי פתוגנים זיהומיות. בנוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים #1K08HL088260 ו #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., ח, S.J.), ואת הקרן Batchelor למחקר ילדים (D.M., ח, S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 ו-BALB/c עכברים המשמשים במחקר זה היו מונולדו במתקן שלנו או שסופקו על ידי מעבדות ג'קסון או Taconic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
60 מ"מ פטרי DIshתרמו מדעי150288
1x PBSקורנינג21-040-CV
10x PBSLonza BioWhittakerBW17-517Q
10 מ"ל חד פעמי פיפטה סרולוגיתקורנינג4100
10 מ"ל מזרקבקטון דיקינסון302995
15 מ"ל צינורות חרוטיים לא סטרילייםTruLineTR2002
18 גרם מחט קההבקטון דיקינסון305180
25 מ"ל חד פעמי פיפטה סרולוגיקורנינג4250
40 μ m גודל נקבוביות מסננת תאיםקורנינג352340
50 מ"ל פלקוןצינור קורנינג21008-951
אלבומין סרום בקר (BSA)SigmaA4503-1KG
מאגר קיבועBiolegend420801
E. coli קולגנאז E מ- Clostridium histolyticumSigmaC2139
EDTA, 0.5 M סטרילי פתרוןAmrescoE177-500ML
סרום בקר עובריתרמו / פישר סיינטיפיק -HyCLoneSV30014.03
HEPESGE Healthcare-HyCloneSH30237.01
PercollGE Healthcare-Life Sciences1708901
RPMI בינוניקורנינג17-105-CV
נתרן אזידVWR מדעי החיים אמרסקו97064-646
טריפן כחוללונזה ביו-ויטאקר17-942E

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114(2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EFACS

מאמרים קשורים