גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

סיכום

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגרימת הכבד שלפוחית השומן בתאי HepaRG עם חומצות שומן מלח נתרן לרדוף ולהעסיק שיטות זיהוי וכימות של הצטברות שומנים בדם, כולל anti-סטוקס קוהרנטי פיזור ראמאן (מכוניות) מיקרוסקופ, ניתוח ציטופלוורימטרי, שמן אדום כתמים ו-qPCR.

תקציר

סטרומטוזיס הכבד מייצגת תפקוד מטבולי הנובע מהצטברות של שומנים בטריגליצרידים המכילים טיפות השומנים ב hepatocytes. הצטברות שומן מוגזמת מוביל מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים (NAFLD), אשר עשוי הפיך עלול להתפתח שאינם אלכוהוליים steatohepatitis (נאש) ובסופו של דבר שחמת ו hepatocellular קרצינומה (HCC). המנגנון המולקולרי המקשר הצטברות השומנים ב hepatocytes עם ההתקדמות לנאש, נזק כבד בלתי הפיך, פיברוזיס, שחמת, ואפילו HCC עדיין נשאר ברור. לשם כך פותחו מספר מvivo ובדגמים מסוימים כדי להבהיר את התהליכים הפתולוגיים הגורמים לNAFLD. במחקר הנוכחי, אנו מתארים מודל הסלולר עבור אינדוקציה של הכבד שלפוחית השומן המורכבת של DMSO-הבדיל האנושי הכבד HepaRG תאים שטופלו עם חומצת שומן מלח נתרן לאואט. אכן, נתרן oleate התייחס התאים HepaRG לצבור טיפות השומנים בציטופלסמה ולהראות תכונות טיפוסיות של steatosis. זה במודל אנושי מתורבת מייצג חלופה רבת ערך לדגמי עכברים vivo, כמו גם לגוף הפטוציטים האנושי העיקרי. אנו מציגים גם השוואה של מספר שיטות עבור כימות והערכה של הצטברות שומן בתאי HepaRG, כולל שמן אדום כתמים, ציטופלוורימטרית מדידה Bodipy, ביטוי גנים מטבולית ניתוח ידי qPCR, ואנטי-סטוקס קוהרנטי פיזור ראמאן (מכוניות) מיקרוסקופ. הדמיה מכוניות משלבת את הספציפיות הכימי של ספקטרוסקופיית ראמאן, טכניקת ניתוח כימי הידוע היטב ביישומים המדע, עם היתרונות של במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה לא ליניארי מmicroscopies כדי לאפשר מדויק קוונפיקציה של הצטברות השומנים ו-droplet השומנים. הקמתה של מודל מתורבת יעיל עבור אינדוקציה של שלפוחית העין, לצד שיטה מדויקת עבור כימות ואפיון של הצטברות שומנים בדם, יכול להוביל לפיתוח של אבחנה בשלב מוקדם של nafld דרך ה זיהוי של סמנים מולקולריים, וליצירת אסטרטגיות טיפול חדשות.

מבוא

סטרומטוזיס הכבד מוגדר הצטברות שומן תוך-הכבד, בתוך הטריגליצרידים המכיל טיפות השומנים, של לפחות 5% ממשקל הכבד. אחסון ממושך השומנים הכבד הוא תהליך הפיך פוטנציאלי, אולם, זה יכול להוביל לתפקוד מטבולית בכבד, דלקת וצורות מתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (nafld), הגורם השולט של מחלת כבד כרונית בחלקים רבים של העולם^1,2. Nafld היא מחלה רב עצרת אשר עשוי להתפתח אגרסיבי יותר שאינם אלכוהוליים steatohepatitis (נאש), אשר בתורו יכול להתקדם שחמת, באחוז קטן של חולים, כדי קרצינומה של hepatocellular (HCC)^1,3. טיפול לא מאושר זמין כרגע כטיפול ספציפי עבור nafld ושילוב של ....

פרוטוקול

1. הכנת מדיה תרבותית וריאגנטים

1. בינוני מתרבים: תוספת בינונית E של ויליאם עם גלוטמקס, 10% סרום של שור עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 5 μg/mL אינסולין ו-0.5 μM הידרוקורטיזון המיסופיאט.
2. לבידול בינוני: תוספת בינונית E של ויליאם עם גלוטמקס, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 5 μg/mL אינסולין, 50 μM הידרוקורטיזון מיסותמאטה ו 2% DMSO.
3. הקפאת בינוני: תוספת מתרבים בינונית עם 10% DMSO.
4. נתרן oleate: לפזר 99% מתנול בריכוז 100 מ"מ, מערבבים O/N, ולאחסן ב-20 ° c.
5. שמן אדום O: להכין פתרון מלאי. שוקלים 0.35 g של שמן אדום O ומתמוסס ב 100 מ ל של איזופנול. מערבבים O/N, מסנן (0.2 μm), ולאחסן ב-RT. הכינו פתרון עובד: מערבבים 6 מ ל של מניו....

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה כדי לגרום ולאפיין את הסטירומטוזיס בתאי ה-dmso-בונות heparg על ידי נתרן אולאט הטיפול (איור 1א).

הבידול בתאי HepaRG.
כדי לגרום ביעילות לבידול, תאים מתרבים חייב להיות נזרע בצפיפות נמוכה (2.5 x 10⁴ תאים/cm²) במדיום התפשטות. כאשר הזרע בצפיפות נמוכה, התאים באופן פעיל להפריד ולרכוש מורפולוגיה מוארך (איור 1B). התאים צריכים להיות שמאל לצמוח .......

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין תאי heparg וכיצד לגרום למצב של שלפוחית השתיקה על ידי נתרן אולאט הטיפול (איור 1א). ואכן, לעומת התאים האחרים קרצינומה של hepatocellular (HCC) קווי תא, קו התאים heparg מציג תכונות של האדם בוגרים hepatציטים, המייצג חלופה בעלת ערך ל ex vivo טיפח האדם הראשי hepatציטים^{13,14 ,15}. קו התאים heparg שימש באופן נרחב עבור לימודי הכבד, מטבוליזם התרופות, ומחקרי ויר.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Hyclone HyClone שיבוט עוברי II	GE Healthcare	SH30066
וויליאם' s E בינוני עם GlutaMAX	תרמופישר	32551087
פניצילין/סטרפטומיצין	SIGMA	P4333
אינסולין	SIGMA	I9278
הידרוקורטיזון המיסוקסינט	SIGMA	H2270
DMSO, דימתיל סולפוקסיד	SIGMA	D2438
נתרן אולאט	SIGMA	O7501
מתנול	SIGMA	179337
איזופרופנול	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
תמיסת פורמלדהיד	SIGMA	252549
ללא RNAse DNAseI	Promega	M198A
כלים עם תחתית זכוכית	Willco Wells	GWST-5040
תמיסת שמן אדומה	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR שם אוליגו	Sequence
ACACB עבור	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
acacb rev	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
β-actin FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
β-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
אלבומין	ל-TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 עבור	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 CYP2E1 CYP2E1
REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 עבור	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 עבור	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 עבור	ACAGACAGGAAACCACCACCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 עבור	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 עבור	AATGAGTTGGAGGGGGGGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCTCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCTCCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S עבור	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCCTC