מאמר שיטה

גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

8.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59843

⸱

18 ביולי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, Sapienza University, 2Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, 5INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, 6Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

במאמר זה

סיכום

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגרימת הכבד שלפוחית השומן בתאי HepaRG עם חומצות שומן מלח נתרן לרדוף ולהעסיק שיטות זיהוי וכימות של הצטברות שומנים בדם, כולל anti-סטוקס קוהרנטי פיזור ראמאן (מכוניות) מיקרוסקופ, ניתוח ציטופלוורימטרי, שמן אדום כתמים ו-qPCR.

תקציר

סטרומטוזיס הכבד מייצגת תפקוד מטבולי הנובע מהצטברות של שומנים בטריגליצרידים המכילים טיפות השומנים ב hepatocytes. הצטברות שומן מוגזמת מוביל מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים (NAFLD), אשר עשוי הפיך עלול להתפתח שאינם אלכוהוליים steatohepatitis (נאש) ובסופו של דבר שחמת ו hepatocellular קרצינומה (HCC). המנגנון המולקולרי המקשר הצטברות השומנים ב hepatocytes עם ההתקדמות לנאש, נזק כבד בלתי הפיך, פיברוזיס, שחמת, ואפילו HCC עדיין נשאר ברור. לשם כך פותחו מספר מvivo ובדגמים מסוימים כדי להבהיר את התהליכים הפתולוגיים הגורמים לNAFLD. במחקר הנוכחי, אנו מתארים מודל הסלולר עבור אינדוקציה של הכבד שלפוחית השומן המורכבת של DMSO-הבדיל האנושי הכבד HepaRG תאים שטופלו עם חומצת שומן מלח נתרן לאואט. אכן, נתרן oleate התייחס התאים HepaRG לצבור טיפות השומנים בציטופלסמה ולהראות תכונות טיפוסיות של steatosis. זה במודל אנושי מתורבת מייצג חלופה רבת ערך לדגמי עכברים vivo, כמו גם לגוף הפטוציטים האנושי העיקרי. אנו מציגים גם השוואה של מספר שיטות עבור כימות והערכה של הצטברות שומן בתאי HepaRG, כולל שמן אדום כתמים, ציטופלוורימטרית מדידה Bodipy, ביטוי גנים מטבולית ניתוח ידי qPCR, ואנטי-סטוקס קוהרנטי פיזור ראמאן (מכוניות) מיקרוסקופ. הדמיה מכוניות משלבת את הספציפיות הכימי של ספקטרוסקופיית ראמאן, טכניקת ניתוח כימי הידוע היטב ביישומים המדע, עם היתרונות של במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה לא ליניארי מmicroscopies כדי לאפשר מדויק קוונפיקציה של הצטברות השומנים ו-droplet השומנים. הקמתה של מודל מתורבת יעיל עבור אינדוקציה של שלפוחית העין, לצד שיטה מדויקת עבור כימות ואפיון של הצטברות שומנים בדם, יכול להוביל לפיתוח של אבחנה בשלב מוקדם של nafld דרך ה זיהוי של סמנים מולקולריים, וליצירת אסטרטגיות טיפול חדשות.

מבוא

סטרומטוזיס הכבד מוגדר הצטברות שומן תוך-הכבד, בתוך הטריגליצרידים המכיל טיפות השומנים, של לפחות 5% ממשקל הכבד. אחסון ממושך השומנים הכבד הוא תהליך הפיך פוטנציאלי, אולם, זה יכול להוביל לתפקוד מטבולית בכבד, דלקת וצורות מתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (nafld), הגורם השולט של מחלת כבד כרונית בחלקים רבים של העולם1,2. Nafld היא מחלה רב עצרת אשר עשוי להתפתח אגרסיבי יותר שאינם אלכוהוליים steatohepatitis (נאש), אשר בתורו יכול להתקדם שחמת, באחוז קטן של חולים, כדי קרצינומה של hepatocellular (HCC)1,3. טיפול לא מאושר זמין כרגע כטיפול ספציפי עבור nafld ושילוב של דיאטה ושינויים בסגנון חיים נשאר העמוד של הניהול nafld ו נאש4,5,6.

המנגנונים המולקולריים שהובילו להתפתחות הסטירומטוזיס הכבד בפתוגנזה של NAFLD עדיין נשארים להסבר7. בהקשר זה, מודלים העכבר פותחו כדי ללמוד התקדמות המחלה מחלת האדם. מספר רב של דגמים שונים קיימים, ולכל אחד יש יתרונות וחסרונות, כולל מודלים גנטיים, תזונתיים וכימיים שונים המשלבים גישות שונות. עכברים ששונו גנטית (הטרנסגניים או הנוק-אאוט) לפתח באופן ספונטני מחלת כבד. עם זאת, יש לציין כי מוטציות אלה הם נדירים מאוד בבני אדם, מחיקה או ביטוי מעל של גן אחד (g., ob/ob העכבר) לא יכול לחקות את האטיולוגיה של מחלת האדם multifactorial ברמה המולקולרית8,9. כמו כן, המחלה שנרכשה על ידי עכברים לאחר מניפולציה תזונתיים או תרופתי לא יכול לחקות את ההשפעות של דיאטות אדם הקשורים לפיתוח של NAFLD באדם8. עם זאת, מודלים בעלי חיים הקלו התפתחויות בהבנת NAFLD וגישה זו היא כיום האסטרטגיה הנפוצה ביותר במחקר במעבדה. עם זאת, השכפול בבני אדם של תוצאות שהתקבלו במודלים של בעלי חיים נכשל שוב ושוב, דבר שגרם לתרגום עני למרפאה10.

לכן, במודלים של חוץ גופית של NAFLD עשוי לשחק תפקיד בסיסי בהסבר מנגנונים מולקולריים של התקדמות NAFLD, והם מייצגים כלי רב ערך למסך מספר גדול של תרכובות. תרביות תאים ראשוניים, קווי תאים מונצח וביופסיות כבד שימשו בהרחבה למטרות מחקר11. הרופא הראשי האדם הראשוני דומה מאוד לתנאים קליניים אנושיים, אבל יש מספר מוגבל של תורמים, ותרבויות התא הראשי להראות מהווה המסכן העניים בשל השונות של התאים. תצפיות אלה, יחד עם סוגיות אתיות ולוגיסטיות, הביאו לשימוש בתאי ההיפטציטים הראשיים האנושייםבגיל 12. כך, קווי הכבד בתאי מייצגים חלופה נוחה, שיש יתרונות חיוניים מספר על התרבות העיקרית, כמו קווי הכבד בתאי לצמוח בהתמדה, יש תוחלת חיים כמעט בלתי מוגבל, יש פנוטיפים יציבה. יתר על כן, קווי התא נגישים בקלות, תנאי התרבות של קווי תא הכבד הם פשוטים יותר מאשר אלה של hepatocytes הראשי הם סטנדרטיים בין מעבדות שונות.

כאן, אנו מתארים בפירוט מודל מבוסס תא מבחנה של הכבד המבוסס על שלפוחית הצער, מיוצגת על ידי בתאי HepaRG כתית שטופלו עם חומצת שומן נתרן oleate. קו התאים HepaRG הוקם מחולה נקבה מושפע דלקת הפטיטיס C וכיתה אדמונדסון אני מבדיל היטב גידול בכבד14. קו הטלפון HepaRG הוא קו מחולל אנושי בעל עוצמה אנושית המסוגל להבדיל באמצעות חשיפה ל-2% diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כלפי שני פנוטיפים סלולריים שונים: כגון המרה ותאים המרופציט. הבדיל התאים HepaRG (dHepaRG) לשתף כמה תכונות ומאפיינים עם heparg מבוגרים ולהחזיק את היכולת לבטא גנים ספציפיים לכבד כגון אלבומין, Aldol, ציטוכרום P450 2E1 (CYP2E1), ו ציטוכרום P450 3A4 (CYP3A4)13 (שלב 3). הטיפול בתאים dHepaRG עם מלח חומצת שומן נתרן אולאט (250 μm) עבור 5 ימים להוביל לדור של טיפות השומנים cytoplasmic, מחקה את ההשפעות של כבד שומני14,15,17,18 ( שלב 4). הצטברות של טיפות שומנים בדם ניתן לזהות בקלות על ידי שמן אדום כתמי O (שלב 5), שומן lysochrome לצבוע מסיסים הכתמים טריגליצרידים נייטרלית ושומנים אדום כתום. כדי לכמת ביעילות שומנים ב dHepaRG שומן, כאן אנו ממחישים ניתוח ציטופלוורימטרית לאחר הצביעת עם 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-טטרמתיל-4-בורה-3a, 4a-di,-s-indacene (bodipy 505/515) (שלב 6), ליפול ב כדי תאיים גופי השומנים המשמש תווית טיפות השומנים19. יתר על כן, כאן אנו מראים כיצד להעריך הסטרומטוזיס על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותי (שלב 7) הביטוי הגנטי רגולציה של כמה גנים מטבוליים בתאי dHepaRG. כדי לאפיין עוד ולכמת את הצטברות של טיפות שומנים לאחר הטיפול נתרן אולאט, אנו ביצעו בעקביות אנטי סטוקס מיקרוסקופית פיזור (מכוניות) מיקרוסקופ (שלב 8), טכניקה חדשנית המאפשרת הדמיה וכימות של טיפות השומנים ללא תיוג20,21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה תרבותית וריאגנטים

  1. בינוני מתרבים: תוספת בינונית E של ויליאם עם גלוטמקס, 10% סרום של שור עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 5 μg/mL אינסולין ו-0.5 μM הידרוקורטיזון המיסופיאט.
  2. לבידול בינוני: תוספת בינונית E של ויליאם עם גלוטמקס, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 5 μg/mL אינסולין, 50 μM הידרוקורטיזון מיסותמאטה ו 2% DMSO.
  3. הקפאת בינוני: תוספת מתרבים בינונית עם 10% DMSO.
  4. נתרן oleate: לפזר 99% מתנול בריכוז 100 מ"מ, מערבבים O/N, ולאחסן ב-20 ° c.
  5. שמן אדום O: להכין פתרון מלאי. שוקלים 0.35 g של שמן אדום O ומתמוסס ב 100 מ ל של איזופנול. מערבבים O/N, מסנן (0.2 μm), ולאחסן ב-RT. הכינו פתרון עובד: מערבבים 6 מ ל של מניות שמן אדום O פתרון עם 4 מ ל של ddH2O. בואו לשבת בטמפרטורת החדר (RT) עבור 20 דקות, ולאחר מכן לסנן עם מסנן 0.2 יקרומטר. סינון נאות מומלץ מאוד לצביעת מוצלח כדי להימנע מרקע.
  6. Bodipy (505/515): לפזר את Bodipy (505/515) לצבוע ב-DMSO בריכוז 100 מניות μM, החנות ב-20 ° c בחושך, ולהשתמש ב גמר 100 ריכוז nM.
  7. רוכשים מנות עם תחתית זכוכית שקופה לניסויים במכוניות.

2. התאגף, הגברה והקפאה בתאי HepaRG

  1. ההפשרה הקפאת החנקן בתאי HepaRG על ידי הפשרת אצווה באמבט 37 ° c עד מופשר. בחר אצוות מעבר נמוכה (< 20). תאי HepaRG זמינים מסחרית.
  2. במהירות להעביר את התאים לתוך 15 מ ל צינור המכיל 10 מ ל של בינוני מתרבים צנטריפוגה עבור 5 דקות (200 x g, 4 ° c).
  3. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את התאים עם 5 מ ל של בינוני מתרבים.
  4. לספור את התאים ולדלל כדי לוחית 2.5 x 104 תאים/cm2.
  5. לחדש את המדיום כל 2 או 3 ימים. תאים מתרבים עם זמן הכפלה של כ 24 שעות.
  6. ניתוק תאי HepaRG כאשר ב 80% שטף ידי 3-5 דקות דגירה עם טריפסין פתרון 0.05%. לאסוף את התאים בינוני מתרבים צנטריפוגה עבור 5 דקות (200 x g, 4 ° c).
  7. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את התאים עם 5 מ ל של בינוני מתרבים.
  8. לספור את התאים ולדלל כדי לוחית 2.5 x 104 תאים/cm2.
  9. בשלב זה, להגביר את התאים על ידי חוזר שלבים 2.5-2.8 כדי להגיע למספר המתאים של תאים כדי להתחיל ניסויים, או cryopreserve כמו בשלב 2.10.
  10. כדי הקפאת בתאי HepaRG, לנתק את התאים 24 שעות לאחר ציפוי על ידי 3-5 דקות דגירה עם טריפסין פתרון 0.05%. לאסוף את התאים בינוני מתרבים צנטריפוגה עבור 5 דקות (200 x g, 4 ° c). להיפטר supernatant, להשעות מחדש את התאים 1 מ ל/אצווה של הקפאה בינונית, 1.5 x 106 תאים/אצווה ו cryopreserve הקבוצות בחנקן נוזלי.

3. הבידול בתאי HepaRG (יום 0 – 21) (איור 1א)

  1. . היום האפס בתאי HepaRG הזרע בצפיפות נמוכה (2.5 x 104 תאים/ס"מ2) לתוך תרבות מטופלים עם כמות מתאימה של התפשטות בינונית (איור 1B). שתי מנות צריך להיות מצופה עבור כל שיטת (שמן Red O כתמים, ניתוח FACS, qPCR): אחד עבור תאים בקרה אחד עבור תאים oleate שטופלו. אם ביצוע מדידות מכוניות (שלב 8), הזרע את התאים במקביל לתוך מנות התחתית זכוכית שקופה. כפקד, הקציר מאכל אחד מטופל (תאים מתרבים יום 0) כדי לבצע ניתוח ביטוי גנים של גנים בידול סמן (ראה שלב 3.6).
  2. . היום השני והיום הרביעי שנה את המדיום עם עוצמת ההפצה המתאימה והחלק את התאים לצמוח עד למפגש.
  3. . היום השביעי תאים חייבים להיות 100% בעלי שוטפת (איור 1ג). שטוף את התאים פעם אחת עם תמיסת מלח באגירה בעלת 1 x פוספט (PBS). הסר 1x PBS והוסף נפח מתאים של בינוני בידול.
  4. . יום 8, 9, 12, 15, 18  שטוף את התאים פעם אחת עם 1 x PBS. הסר 1x PBS והוסף נפח מתאים של בינוני בידול.
  5. . היום ה -21 להתבונן בתאי HepaRG תחת מיקרוסקופ ולהבטיח כי התאים הם הבדיל תרבויות מובחנת (איור 1ד).
  6. כפקד, הקציר צלחת בקרה אחת (הבדיל תאים יום 21) כדי לבצע ניתוח ביטוי גנים (שלב 7) של גנים סמן בידול (איור 1E).
  7. ביום 21, הבדיל תאים HepaRG ניתן הקפאת השמורים בחנקן נוזלי.

4. אינדוקציה של שלפוחית השמש (יום 21 – 26)

  1. . היום ה -21 לדלל את הנתרן לאואט (100 מ"מ) עם נפח מתאים של בינוני בידול מלא לריכוז הסופי של 250 μM (1:400). הוסף 99% מתנול 1:400 (אותו אמצעי אחסון כמו זה של נתרן oleate) לתוך סדרת מחלקים אחר של בידול בינוני כדי להפוך את הטיפול בקרת רכב. (למשל: הוסף 25 μl של נתרן אולאט ל 10 מ ל של בינוני במקביל להוסיף 25 μl של 99% מתנול ל 10 mL של בינוני). לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 x PBS ולהוסיף רכב או נתרן אולאט בינונית.
  2. . יום 23 ויום 25 שנה את המדיום עם הנפח המתאים של בינוני טרי מוכן כמו בשלב 4.1.
  3. . יום 26 להתבונן על ידי מיקרוסקופ אופטי כי טיפות השומנים להצטבר בתאי הרדוף הנתרן התייחס והם בקלות לראות כמו טיפות שקוף בציטופלסמה כמו באיור 2א.

5. הערכה של שומנים יתר והאינדוקציה שדררומטוזיס: שמן אדום כתמים

  1. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 x PBS ולהסיר 1x PBS לחלוטין.
  2. הוסף 4% פאראפורמלדהיד (מדולל ב-1x PBS) ו הדגירה עבור 15 דקות ב RT.
    זהירות: פאראפורמלדהיד הוא רעיל, כך ששלב זה חייב להתבצע בתוך מכסה המנוע, עם ציוד הגנה, כולל כפפות, חלוק מעבדה ומסכה.
  3. להסיר פאראמפורמלדהיד ולשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS. ניתן לשמור את התאים ב-1x PBS ב-4 ° c לכמה ימים לפני הצביעת. לעטוף עם parafilm ולכסות עם רדיד אלומיניום כדי למנוע את התאים מייבוש.
  4. הסר 1x PBS. דגירה את התאים עם 60% איזופנול עבור 5 דקות ב RT.
  5. הסר איזופנול והשאר את התאים יבשים לחלוטין ב-RT.
  6. הוסף שמן אדום O פתרון עבודה דגירה ב RT עבור 30 דקות. הנפח של פתרון העבודה הנדרש עבור כל דוגמה מתאים לנפח המדיה המשמש לעיבוד התאים.
  7. הסרת שמן אדום הפתרון ולהוסיף מיד ddH2o. לשטוף את התאים 4 פעמים עם ddh2o.
  8. השיגו תמונות מתחת למיקרוסקופ לניתוח (איור 2ב').
  9. כדי לצבוע את השמן האדום או דיו: להסיר את כל המים ולאפשר יבש; להוסיף 1 mL של 100% איזופנול ו דגירה עבור 10 דקות עם טלטול עדין ב RT.
  10. ללטף את האיזופנול עם לצבוע שמן אדום או למעלה ולמטה מספר פעמים, להבטיח כי כל שמן אדום O הוא בפתרון. העבר את הפתרון לקובט. למדוד OD500 nm על ידי ספקטרופוטומטר ולהשתמש 100% איזופנול כריק (איור 2ג).

6. הערכה של שומנים יתר והאינדוקציה שדררומטוזיס: בודיפיה כתמים ואנליזה ציטופלוורימטרית

  1. שטוף את התאים פעם אחת עם 1 x PBS. דגירה עם 100 ננומטר של Bodipy מדולל 1x PBS בחושך עבור 40 דקות ב 37 ° c. שליטה בלתי מוכתמת צריכה להיכלל במידות הזרימה של סיילנסה. מנקודה זו, להגן על דגימות מהאור כמה שיותר.
    הערה: הנפח של פתרון הצביעת הנדרש עבור כל דוגמה מתאים לנפח המדיה המשמש לתאי culturing.
  2. הסר פתרון כתמים ושטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS. המשך לצעדים 6.3-6.6. עבור FACS (מיון תאים פלואורסצנטית מופעל) ניתוח או לשלב 6.7 עבור דימות מיקרוסקופ.
  3. מגרדים בעדינות את התאים באמצעות 1x PBS ומעבירים אותו לשפופרת של 15 מ ל. צנטריפוגה עבור 10 דקות (200 x g, 4 ° c).
  4. הסר בעדינות את הסופרנטנים מבלי להפריע את כדורי ולשטוף עם 3 מ ל של 1x PBS. צנטריפוגה עבור 5 דקות (200 x g, 4 ° c).
  5. הסר את הסופרנטנים והשהה מחדש ב-300 μL של 1x PBS, ולאחר מכן העבר לתוך צינור FACS.
  6. מיד למדוד את עוצמת הקרינה של Bodipy על ידי ניתוח ציטופלוורימטרי עם עירור/פליטת אורכי גל של 505/515 ננומטר (איור 3A, B).
  7. שטוף את התאים פעם אחת ב-1x PBS ולהסיר PBS לחלוטין.
  8. הוסף 4% פאראפורמלדהיד (מדולל ב-1x PBS) ו הדגירה עבור 15 דקות ב RT.
    זהירות: פאראפורמלדהיד הוא רעיל, כך ששלב זה חייב להתבצע בתוך מכסה המנוע, עם ציוד הגנה, כולל כפפות, חלוק מעבדה ומסכה.
  9. הסרת פאראפורמלדהיד ולשטוף את הדגימות 3x עבור 5 דקות ב-PBS. ניתן לשמור את התאים ב-1x PBS ב-4 ° צ' או בתמונה מיידית (איור 3ג). לאחסון, לעטוף עם parafilm ולכסות עם רדיד אלומיניום כדי למנוע את התאים מייבוש.

7. הערכת עומס יתר ליפיד והשראה סטרומטוזיס: qPCR

  1. שטוף את התאים פעם אחת עם 1 x PBS. גרד את התאים באמצעות 1x PBS, צנטריפוגה ב 200 x g, ולמחוק את supernatant. בשלב זה, התאים ניתן לקצור ב-80 ° צ' או מעובד כמו בשלב 7.2.
  2. לבצע בידוד RNA הכולל על ידי שיטות סטנדרטיות באמצעות ריאגנטים מסחרי לאחר הוראות היצרן.
  3. להעריך את הריכוז RNA על ידי מדידה spectrophotometric UV, להבטיח כי טוהר RNA הוא גבוה (קרוב ל-2.0) מבוסס על A260/A280 קריאה.
  4. סנתז cDNA מ 1 μg של RNA כולל עם ערכת סינתזה cDNA סטנדרטית.
  5. לדלל cDNA לאחרונה 50 μL הכרך עם H2O.
  6. לנתח כל מדגם cDNA ב טרילקאט על ידי qPCR: להכין מיקס אחד qPCR בסיס (שולחן 1) כי הוא מספיק עבור התגובות הדרושות עבור כל פריימר, כולל מיוחד לשלושה גנים משק הבית כפקדים: גליראלדד-3-פופורה (ראה טבלת חומרים לרצפים פריימר), אקדירוגנאסי (החלק החומרי):
  7. לחלק 18 μL של ערבוב מאסטר בכל טוב בצלחת מרובת הקיר PCR.
  8. הוסף 2 μL של דגימת cDNA בכל באר. . סגור את הלוחית
  9. הפעל את הדגימות בהתאם להוראות הציקלאה התרמית.

8. הערכת עומס יתר של שומנים ושסטרומטוזיס אינדוקציה: מכוניות

  1. תקן את התאים שהוכנו קודם לכן על מנות עם תחתית זכוכית, כמתואר בשלבים 5.1-5.3.
  2. החלף על מערכת לייזר פעמו מסחרית פורק לספק, כוונון זה כדי להשיג שתי תפוקות של אורכי גל שונים. הפרש התדר בין התפוקות חייב להיות 2,840 ס מ-1 כדי ליצור את האות מכוניות אינטנסיבי האור המתאים מתיחה סימטרית מתילן; עבור פלט באורך גל קבוע ב 1,064 nm ("סטוקס" אור), אורך הגל השני צריך להיות מכוון 817 nm ("משאבת" אור).
  3. ודא את 817 ננומטר הפלט הוא מרחב ו באופן זמני עם פלט ננומטר 1,064: השימוש מראה דיקרואיק מתאים (כלומר, עם חתך בין 817 ו 1,064 nm) כדי מרחב לשלב את הקורות ולהשתמש קו השהיה אופטי כדי להשיג חפיפה הזמני של הלייזר פולסים.
  4. ודאו ששתי הקורות הנקוטים הן מקבילות ושהקטרים שלהם כוללים ערכים דומים המתאימים למערכת האופטית בתוך המיקרוסקופ שיתמקדו אותם על המדגם; במידת הצורך, הדבר משלב בנפרד את הקורות לפני המראה הדיקרואיק שמשלב אותם.
  5. הפעל על מערכת מיקרוסקופ הפוכה מסחרי, אשר צריך לכלול יחידת סריקת לייזר אינפרא אדום ויחידה כפולה אדום/ירוק לזיהוי אפינפרין וליישר את קרני לייזר copropagating לתוך יחידת הסריקה.
  6. פתיחת יחידת הזיהוי אפינפרין-channel כפול, להסיר את קוביית הפילטר ולהחליף את מסנן הזיהוי של הגל האדום שלה עם מסנן bandpass שיכול לבחור את האות 2,840 ס"מ-1 מכוניות ממורכז ב 663 nm עבור 817/1064 nm משאבת/סטוקס הריגוש ערכת. מסנן רוחב פס צר (20 ננומטר) מועדף כדי למנוע את האוסף של רמות גבוהות של אותות רקע פלורסנט.
  7. מניחים צלחת על הבמה של מיקרוסקופ מכוניות הפוכה, ובאמצעות 100x המטרה טבילה בשמן, להזיז את המיקום האנכי של המטרה להתמקד על התאים.
  8. להגדיר את תוכנת מיקרוסקופ כדי לאסוף ברזולוציה גבוהה (1024 x 1024 פיקסלים) תמונות מעל שדה של תצוגה הפורש 127 יקרומטר x 127 יקרומטר.
  9. הגדר את תוכנת המיקרוסקופ ברציפות לרכוש ולהציג תמונות של 127 יקרומטר x 127 יקרומטר שדה התצוגה לבדוק את התמונות המוצגות תוך אופטימיזציה של הפרמטרים אוסף התמונה. ודא שכוחות הלייזר מאוזנים לצורך איסוף תמונה מהירה ונזק מינימלי, הוספת מסנני דחיסות נייטרלית מתאימים בנתיבי הקרן בהתאם לצורך, ובחר בפיקסל לשכון זמן המאפשר את אוסף התמונות עם צליל לרעש טוב יחס מתחת לתנאי צריכת החשמל בלייזר שנבחרו.
  10. לרכוש ולשמור תמונות של שדות מספר שונים של תצוגה בתוך המנה תחת התנאים האופטימליים. באופן אופציונלי, תמונות מרובת פוטון הפוטונים, שנוצר על ידי פליטה ירוק-גל (בעיקר משני הפוטון עירור ב 817 ננומטר), ניתן לאסוף בו דרך גלאי האפינפרין אחרים. חזור על שלבים 8.7-8.10 עבור כל מנה.
  11. לניתוח תמונות מכוניות, הדפסת תמונות באמצעות הטמעת היישום של ImageJ. הפעל את הפונקציה הדאכקלה (או כלי מעבר דומה) על כל תמונה לפני ניתוח נוסף כדי לשפר את יחסי האות לרעש ללא אובדן פרטים.
  12. השתמש בפיג כדי לבחור תאים באופן ידני ולאחר מכן באופן אוטומטי לספור טיפות השומנים בתוך תאים בודדים מקוטע כדי לייצר נתונים סטטיסטיים על אזורי droplet ליפיד ומספרים עבור כל תא ועבור כל ערכת הנתונים של התמונה עבור כל מנה.

9. שיטת הכדאיות של תא MTT

  1. הצלחת הבדיל התאים HepaRG לתוך צלחת 96-באר עם צפיפות של 1 x 105 תאים/גם בהיקף הסופי 100 μl של מדיום תרבות בידול.
  2. 24 שעות לאחר זריעה, לטפל בתאים עם 99% מתנול (רכב) עם 100 μm, 250 μm ו500 μm נתרן אולאט ו נתרן palmitate מדולל ב 100 μl של בידול תרבות בינונית/גם ב טרילקאט.
  3. לשנות את המדיום עם 99% מתנול ו עם 100 μm, 250 μm ו500 μm נתרן אולאט נתרן palmitate מדולל ב 100 μl של בידול תרבות בינונית/גם כל 24 h.
  4. 96 h לאחר הטיפול מתנול/נתרן הרדוף/נתרן palmitate, לטפל בתאים עם 2 μM דוקסורוביצין מדולל ב 100 μL של בידול תרבות בינונית/גם בטרילקאט כפקד.
  5. 18 h לאחר הטיפול doxorubucin, לשנות את המדיום עם 100 μL של בידול תרבות בינונית.
  6. Pipet 20 μL של 3-(4, 5-דימתיל thiazol-2-yl)-5-(3-carboxyמתיונין)-2-(4-sulfophenyl)-2H-טטרזולה (שולחן החומרים) לתוך כל באר של 96-היטב הצלחת המכיל את התאים ב 100 μl של תרבות בינונית בינוני . כלול בקרת רקע על ידי ליטוף 20 μL של מגיב לתוך שליטה היטב ללא תאים בשנת 100 μL של בידול התרבות בינונית בטרילקאט.
  7. מודקת את הצלחת ב 37 ° c בתוך מחולל לחות, 5% CO2 האווירה.
  8. לאחר הדגירה של 30, 60, ו 90 דקות עם מגיב MTT הטטריום, להקליט את ספיגת בשנת 490 nm באמצעות קורא הצלחת 96-באר. הפחת את ספיגת הרקע של בארות הבקרה ללא תאים מערכי הספיגה של הדגימות האחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה כדי לגרום ולאפיין את הסטירומטוזיס בתאי ה-dmso-בונות heparg על ידי נתרן אולאט הטיפול (איור 1א).

הבידול בתאי HepaRG.
כדי לגרום ביעילות לבידול, תאים מתרבים חייב להיות נזרע בצפיפות נמוכה (2.5 x 104 תאים/cm2) במדיום התפשטות. כאשר הזרע בצפיפות נמוכה, התאים באופן פעיל להפריד ולרכוש מורפולוגיה מוארך (איור 1B). התאים צריכים להיות שמאל לצמוח ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין תאי heparg וכיצד לגרום למצב של שלפוחית השתיקה על ידי נתרן אולאט הטיפול (איור 1א). ואכן, לעומת התאים האחרים קרצינומה של hepatocellular (HCC) קווי תא, קו התאים heparg מציג תכונות של האדם בוגרים hepatציטים, המייצג חלופה בעלת ערך ל ex vivo טיפח האדם הראשי hepatציטים13,14 ,15. קו התאים heparg שימש באופן נרחב עבור לימודי הכבד, מטבוליזם התרופות, ומחקרי ויר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים לפרופ ' כריסטיאן טרפו (INSERM U871, ליון, צרפת), שסיפק באדיבות תאי HepaRG. אנחנו אסירי תודה לריטה אפודיה. לעזרה ניהולית עבודה זו נתמכת על ידי MIUR-Ministero dell, האוניברסיטה הרומית (FIRB 2011 – 2016 RBAP10XKNC) ו Sapienza אוניברסיטת רומא (פרוט. C26A13T8PS; פרוט. C26A142MCH; פרוט. C26A15LSXL).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Hyclone HyClone שיבוט עוברי II GE HealthcareSH30066
וויליאם' s E בינוני עם GlutaMAX תרמופישר32551087
פניצילין/סטרפטומיצין SIGMAP4333
אינסולין SIGMAI9278
הידרוקורטיזון המיסוקסינטSIGMAH2270
DMSO, דימתיל סולפוקסידSIGMAD2438     
נתרן אולאטSIGMAO7501 
מתנולSIGMA179337
איזופרופנולSIGMA278475
BODIPY 505/515ThermofisherD3921
PBSThermofisher14190-250
תמיסת פורמלדהידSIGMA252549
ללא RNAse DNAseIPromegaM198A 
כלים עם תחתית זכוכיתWillco WellsGWST-5040
תמיסת שמן אדומהSIGMAO625
CellTiter 96 AQueous One SolutionPromega G3582
q-PCR שם אוליגוSequence
ACACB עבורCAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
acacb revCCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
β-actin FORGCACTCTTCCAGCCTTCCT
β-actin REVAGGTCTTTGCGGATGTCCAC
אלבומיןל-TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REVAAGGCAAGCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FORGCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOB REVTAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FORCCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 עבורCTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REVGGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FORTCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REVGCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 CYP2E1 CYP2E1
REVCGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 עבורCTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REVTCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FORTGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REVAGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FORTCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REVATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 עבורCCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REVACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 עבורACAGACAGGAAACCACCACCAC
PDK4 REVTGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 עבורTTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REVCCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 עבורAATGAGTTGGAGGGGGGGGGGGACATC
PLIN4 REVGGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FORTCTAGCTCTCTATACCACCACCA
SCD REVTCGTCTCCAACTTATCTCTCCC
SLC2A1 FORTGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REVCCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S עבורCGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REVTTGGCAAATGCTTTCCTC

מקורות

  1. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  2. Byrne, C. D., Targher, G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology. 62 (1), Suppl 47-64 (2015).
  3. Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis. Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).
  4. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  5. Banini, B. A., Sanyal, A. J. Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).
  6. Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).
  7. Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
  8. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).
  9. Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).
  10. Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).
  11. Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes. Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).
  12. Gómez-Lechón, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
  13. Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies. Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).
  14. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  15. Anthérieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells. Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).
  16. Rouge, A., et al. PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).
  17. Belloni, L., et al. Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model. Scientific Reports. 8, 13638(2018).
  18. Nunn, A. D. G., et al. The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells. Scientific Reports. 6, 28025(2016).
  19. Donato, M. T., et al. Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells. Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).
  20. Hellerer, T., Axäng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).
  21. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), 51092(2012).
  22. Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  23. Nelson, L. J., et al. Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).
  24. Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  25. Pusl, T., et al. Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).
  26. Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).
  27. Mei, S., et al. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes. Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).
  28. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).
  29. Moravcová, A., Červinková, Z., Kučera, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotková, H. The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture. Physiological Research. 64, Suppl 5 627-636 (2015).
  30. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).
  31. Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., Müller, M. Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy. Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).
  32. Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination. Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).
  33. Jüngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy. Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).
  34. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), Pt B 1260-1272 (2017).
  35. Cohen, S. Lipid droplets as organelles. International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).
  36. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Oil Red OBodipyCARSNAFLD In Vitro

מאמרים קשורים