פרוטוקול להכין תרביות פרוסות חופשיות מן המוח האנושי המבוגר מוצג. הפרוטוקול הוא וריאציה של שיטת תרבות הפרוסה הנפוצה בשימוש באמצעות מוסיף ממברנה. זה פשוט, חסכוני, ומומלץ להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של נוירוניוון מאחורי הגיל הקשורים מחלות המוח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרבויות אורגנוטיפקס, או פרוסות, הועסקו באופן נרחב בהיבטים של מערכת העצבים המרכזית הפועלת בתחומי החוץ הגופית. למרות הפוטנציאל של תרבויות הפרוסה במדעי המוח, מחקרים המשתמשים ברקמת העצבים הבוגרת כדי להכין תרבויות כאלה עדיין נדירים, בעיקר אלה מתוך הנתינים האנושיים. השימוש ברקמת האדם המבוגר להכנת תרבויות הפרוסה אטרקטיבי במיוחד כדי לשפר את ההבנה של הנוירולוגיה האנושית, כאשר הם מחזיקים במאפיינים ייחודיים האופייניים למוח האנושי הבוגר חסר בפרוסות מכרסמים (בדרך כלל בעלי חיים) רקמת העצבים פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ברקמת המוח שנאספו מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מחדש כדי להכין את התרבויות לטווח קצר, בחינם צף תרביות פרוסה. הליכים לתחזוקה וביצוע ביולוגיה ביוכימית ובביולוגיה סלולרית מוצגים גם הם. התוצאות הייצוגיות מדגימות כי הדבקת קליפת הגוף האנושית הטיפוסית נשמרת בפרוסות לאחר 4 ימים במבחנה (DIV4), עם הנוכחות הצפויה של סוגי התא העצבי הראשי. יתר על כן, פרוסות ב DIV4 לעבור מוות תאים חזקים כאשר מאותגרים עם גירוי רעיל (H2O2), המציין את הפוטנציאל של מודל זה לשמש פלטפורמה במוות תאים assays. שיטה זו, חלופה פשוטה וחסכונית לפרוטוקול בשימוש נרחב באמצעות מוסיף ממברנה, מומלץ בעיקר להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של ניוון שמאחורי הגיל מחלות המוח הקשורות. לבסוף, למרות הפרוטוקול מוקדש באמצעות רקמה קורטיקלית שנאסף מחולים שהוגשו טיפול כירורגי של אפילפסיה האונה הרקתית הטמפורלית, זה נטען כי הרקמה שנאספו מאזורים אחרים במוח/תנאים צריך גם להיות נחשבים למקורות להפקת תרביות פרוסה חופשיות דומות.
מבוא
השימוש בדגימות אנושיות במחקר הוא באופן חד-משמעי אפשרות גדולה ללמוד פתווגיות המוח האנושי, טכניקות מודרניות פתחו דרכים חדשות לניסויים חזקים ומוסריים באמצעות רקמת החולה הנגזר. שיטות כמו תרבויות אורגאוטימית/פרוסה שהוכנו ממוח אנושי מבוגר שימשו יותר ויותר בתבניות כגון אלקטרואופטיקה1, אלקטרופיזיולוגיה2,3,4,5, פלסטיות 6,7,8,9, רעילות נוירו/הגנהעצבית 10,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מבוגרים לחיות רקמות המוח הושגו מחולים שעברו כירורגי resective לטיפול של אפילפסיה האונה הרקתית הטמפורלית (איור 1א). כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מבית החולים לקליניקות בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו (17578/2015), וחולים (או האדם האחראי עליהם) הסכימו וחתמו על תנאי ההסכמה המוודעים. אוסף של הרקמה נעשתה על ידי צוות נוירוכירורגיה במרכז לכירורגיה אפילפסיה (CIREP בית החולים בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו, אוניברסיטת סאו פאולו, ברזיל).
1. סטריליזציה של חומרים
הערה: כל החומרים והפתרונות חייבים להיות מעוקרים לפני השימוש.
- לחטא את כל כלי הניתוח והרטט חומר חיתוך (מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
היבט קריטי כדי להעריך את האיכות והבריאות של פרוסות המתורבתות היא הנוכחות והמבנה האופייני של סוגי תאים עצביים צפוי, נוירונים, ותאי גליה. האדריכלות הטיפוסית של הדבקת קליפת הגוף האנושית נצפתה בפרוסה ב-DIV4, שנחשפה על ידי אימונוולטילינג עצבי (איור 2ד). בנוסף, הנוכחות הצפויה של מיקרוגלייה ו אסטרוגליה (איור 2ב, ג) נצפתה גם. תוצאות אלה מציגות שארכיטקטורת רקמות אינה מושפעת באופן משמעותי מתהליך הניתוח/דגימת העיבוד או לפי התקופה הקצרה בתו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה להפקת תרבות פרוסה בחינם, לטווח קצר, היא שיטה חלופית לפרוסות בוגרות של האדם האנושי. פרוטוקול כזה עבור תרבויות פרוסה עשוי להיות קל למחקרים על (אבל לא מוגבל) אלקטרואופטיקה1,44,45, אלקטרופיזיולוגיה2,3,4,5 , לטווח קצר הפלסטיות46,47, לטוו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי FAPESP (גרנט 25681-3/2017 ל-AS), גלימות (פוסט דוקטורט מלגת PNPD/INCT-HSM כדי A.F. ו-דוקטורט מלגת N.D.M.) ו FAEPA. G.M.A. מחזיקה מלגת מאסטר מ FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. מחזיקה מלגת מחקר CNPq. אנו מודים למטופלים ולמשפחותיהם על תרומת הרקמה החוזרת למחקר זה. היינו רוצים להכיר בתמיכה של תושבים, אחיות, טכנאים, וצוות CIREP, מבית החולים הקליני בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו, אוניברסיטת סאו פאולו, מי עזר בשלבים שונים של התהליך.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-פרופנול | Merck | 1096341000 | |
| אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, תמיסה של 30% | סיגמא אולדריץ' | A3449 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| אמוניום פרסולפט | Sigma | A3678-25G | |
| אמפוטריצין B | Gibco | 15290-018 | |
| נוגדן נגד ERK 2 (ארנב) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | דילול 1:1,000 ב-BSA 2.5% |
| נוגדנים נגד pERK (עכבר) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | דילול 1:1,000 ב-BSA 2.5% |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
| בקר סרום אלבומין | סיגמא אולדריץ' | A7906 | |
| ברדפורד 1x מגיב צבע | BioRad | 500-0205 | |
| EDTA | Sigma | T3924 | בשימוש במאגר RIPA |
| גלוקוז | Merck | 108337 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| מלחים מאוזנים של האנק | סיגמא אולדריץ' | H1387-10X1L | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| חומצה הידרוכלורית | Merck | 1003171000 | |
| מי חמצן (H2O2)Vetec | 194 | ||
| Mouse IgG, Ab שלם מקושר HRP (נגד עכברים) | GE | NA931-1ML | |
| NaCl | Merck | 1064041000 | בשימוש במאגר RIPA |
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| חלב יבש ללא שומן (Molico) | Nestlé | משמש לחסימת ממברנה | |
| PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | סיגמא אולדריץ' | P4333 | |
| אשלגן כלורי | Merck | 1049361000 | |
| פריים ווסטרן מגיב לזיהוי כתמים | GE | RPN2232 | |
| ארנב IgG, AB שלם מקושר HRP (אנטי ארנב) | GE | NA934-1ML | |
| SDS | Sigma | L5750 | בשימוש במאגר RIPA |
| TEMED | GE | 17-1312-01 | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
| Tris | Sigma | T-1378 | בשימוש במאגר RIPA |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | בשימוש במאגר RIPA |
| Ultrapure Water | Millipore | מים סטריליים, שמקורם במערכת טיהור המים MiliQ | |
| <חזקים>ציוד וחומרים | |||
| צלחות 24 בארות | Corning | CL S3526 | תחתית שטוחה עם מכסה |
| אמרשם פוטרן פרימיום (קרום ניטרוצלולוזה) | GE | 29047575 | |
| תערובת קרבוגן | מרטינס | 95% O2, 5% CO2 | |
| CO2 חממה | ניו ברונסוויק סיינטיפיק | CO-24 | דגירה של פרוסות 5% CO2, 36º C |
| Microplate Reader | מכשירים | ||
| מיקרו צינורות | גריינר | 001608 | 1,5 מ"ל מיקרו-צינור |
| עלי ממונע | קימבל צ'ייס | ||
| כפית | גודל של כף קינוח | ||
| סכין גילוח | ביק | כרום פלטינה, המשמש לחיתוך עם | |
| להב | אזמל ויברטוםבקטון דיקינסון (BD) | מספר 24 | משמש לחיתוך רקמות; מומלץ באותו גודל או קטן יותר |
| Superglue (Loctite Super Bonder) | הנקל | : Etilcianoacrilato; חומצה 2-פרופנואית; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; הומופולימר | |
| Vibratome | Leica | 14047235612 - VT1000S | |
| <חזק>שם החומר/ציוד לאימונוהיסטוכימיה | |||
| נוגדנים נגד NeuN (עכבר) | Millipore | דילול MAB377 | 1:1,000 בנוגדני חוצץ פוספט |
| אנטי-GFAP (עכבר) | Merck | MAB360 | דילול 1:1,000 בנוגדני חוצץ פוספט |
| אנטי-IBA1 (ארנב) | Abcam | EPR16588 - ab178846 | דילול 1:2,000 במאגר פוספט |
| נוגדן IgG נגד עכבר ביוטיניל (H+L) | וקטור | BA-9200 | |
| DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
| Entellan | Merck | 107960 | |
| אתנול | Merck | 1.00983.1000 | |
| ג'לטין | סינת' | 00G1002.02.AE | משמש לציפוי שקופיות |
| Microtome | Leica | SM2010R | מצויד בשלב הקפאה (BFS-10MP, Physiotemp), מוגדר ל-40º C |
| סרום חמור רגיל | ג'קסון מחקר חיסוני | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| ארנב IgG, שרירי בטן שלמים מקושרים HRP (נגד ארנב) | GE | NA934-1ML | |
| שקופיות (כוכב פרוסט) | Knittel Glaser | שקופיות מצופות ג'לטין | |
| סוכרוז | Vetec | 60REAVET017050 | |
| ערכת Vectastain ABC HRP (פרוקסידאז, סטנדרטי) | וקטור | PK-4000, ערכה סטנדרטית | |
| קסילן | סינתיסייזר | 01X1001.01.BJ |
מקורות
- Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
- Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophy....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
