הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59845

⸱

5 בנובמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול להכין תרביות פרוסות חופשיות מן המוח האנושי המבוגר מוצג. הפרוטוקול הוא וריאציה של שיטת תרבות הפרוסה הנפוצה בשימוש באמצעות מוסיף ממברנה. זה פשוט, חסכוני, ומומלץ להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של נוירוניוון מאחורי הגיל הקשורים מחלות המוח.

תקציר

תרבויות אורגנוטיפקס, או פרוסות, הועסקו באופן נרחב בהיבטים של מערכת העצבים המרכזית הפועלת בתחומי החוץ הגופית. למרות הפוטנציאל של תרבויות הפרוסה במדעי המוח, מחקרים המשתמשים ברקמת העצבים הבוגרת כדי להכין תרבויות כאלה עדיין נדירים, בעיקר אלה מתוך הנתינים האנושיים. השימוש ברקמת האדם המבוגר להכנת תרבויות הפרוסה אטרקטיבי במיוחד כדי לשפר את ההבנה של הנוירולוגיה האנושית, כאשר הם מחזיקים במאפיינים ייחודיים האופייניים למוח האנושי הבוגר חסר בפרוסות מכרסמים (בדרך כלל בעלי חיים) רקמת העצבים פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ברקמת המוח שנאספו מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מחדש כדי להכין את התרבויות לטווח קצר, בחינם צף תרביות פרוסה. הליכים לתחזוקה וביצוע ביולוגיה ביוכימית ובביולוגיה סלולרית מוצגים גם הם. התוצאות הייצוגיות מדגימות כי הדבקת קליפת הגוף האנושית הטיפוסית נשמרת בפרוסות לאחר 4 ימים במבחנה (DIV4), עם הנוכחות הצפויה של סוגי התא העצבי הראשי. יתר על כן, פרוסות ב DIV4 לעבור מוות תאים חזקים כאשר מאותגרים עם גירוי רעיל (H2O2), המציין את הפוטנציאל של מודל זה לשמש פלטפורמה במוות תאים assays. שיטה זו, חלופה פשוטה וחסכונית לפרוטוקול בשימוש נרחב באמצעות מוסיף ממברנה, מומלץ בעיקר להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של ניוון שמאחורי הגיל מחלות המוח הקשורות. לבסוף, למרות הפרוטוקול מוקדש באמצעות רקמה קורטיקלית שנאסף מחולים שהוגשו טיפול כירורגי של אפילפסיה האונה הרקתית הטמפורלית, זה נטען כי הרקמה שנאספו מאזורים אחרים במוח/תנאים צריך גם להיות נחשבים למקורות להפקת תרביות פרוסה חופשיות דומות.

מבוא

השימוש בדגימות אנושיות במחקר הוא באופן חד-משמעי אפשרות גדולה ללמוד פתווגיות המוח האנושי, טכניקות מודרניות פתחו דרכים חדשות לניסויים חזקים ומוסריים באמצעות רקמת החולה הנגזר. שיטות כמו תרבויות אורגאוטימית/פרוסה שהוכנו ממוח אנושי מבוגר שימשו יותר ויותר בתבניות כגון אלקטרואופטיקה1, אלקטרופיזיולוגיה2,3,4,5, פלסטיות 6,7,8,9, רעילות נוירו/הגנהעצבית 10,11,12,13, טיפול בתאים14, הקרנת סמים15,16,17, גנטיקה, ועריכת גנים12,18,19,20, בין היתר, כאסטרטגיה לטוב יותר הבנת מחלות נוירולוגיות במהלך הבגרות.

הבנת המנגנונים המשמשים לפתווגיות המוח האנושי תלויה באסטרטגיות נסיוניות הדורשות מספר רב של נושאים. לעומת זאת, במקרה של תרבויות פרוסה, למרות הגישה לדגימות אנושיות עדיין קשה, את האפשרות של הפקת עד 50 פרוסות ממדגם קליפת גוף אחת באופן חלקי הדרישה של גיוס מתנדבים מרובים על ידי הגדלת ה מספר המשכפלת והביצוע המתבצע לפי רקמה21.

מספר פרוטוקולים לתרביות ממוח/פרוסה מתוארים, החל בטיוטות קלאסיות של האוליים22,23 לצינור רולר24,25,26, ממברנות למחצה , ממשק27,28,29,30. ופרוסות חופשיות31,32 בהתאם לקצוות של תכנון ניסיוני, לכל טכניקה יש יתרונות וחסרונות משלה. לטווח קצר, תרבויות חופשיות צפה מהמוח האנושי הוא במקרים מסוימים יתרון על השיטה בשימוש על ידי Stoppini ואח '27, אם בהתחשב בעובדה כי למרות הישרדות תאים ארוכי טווח בתוך מבחנה היא בדרך כלל דאגה עיקרית בעת הערכת שיטת תרבות, בניסויים רבים רק פרקי זמן קצרים בתרבות נדרשים12,31,32,33,34,35. בתנאים אלה, השימוש בתרבויות חופשיות-צף מציג את היתרון של להיות פשוט יותר וחסכוני יותר, כמו גם מדויק יותר הדומה למצב רקמת האדם המקורי מאשר פרוסות שנשמרו בתרבות במשך 2-3 שבועות.

למרות הפוטנציאל של תרבויות הפרוסה למדעי המוח, מחקרים המשתמשים ברקמת העצבים הבוגרת להכנת התרבויות הללו עדיין נדירים, בעיקר מנושאים אנושיים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להשתמש ברקמת המוח שנאסף מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מחדש כדי להכין תרבויות הפרוסה צף חופשי. הליכים לתחזוקה ולביצוע ביולוגיה ביוכימית ובביולוגיה תאית מפורטים באמצעות התרבויות הללו. פרוטוקול זה הוכח ערך לניתוח כדאיות ותפקוד עצבי בחקירות על מנגנונים של נוירופתוגיות המקושרים לבגרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מבוגרים לחיות רקמות המוח הושגו מחולים שעברו כירורגי resective לטיפול של אפילפסיה האונה הרקתית הטמפורלית (איור 1א). כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מבית החולים לקליניקות בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו (17578/2015), וחולים (או האדם האחראי עליהם) הסכימו וחתמו על תנאי ההסכמה המוודעים. אוסף של הרקמה נעשתה על ידי צוות נוירוכירורגיה במרכז לכירורגיה אפילפסיה (CIREP בית החולים בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו, אוניברסיטת סאו פאולו, ברזיל).

1. סטריליזציה של חומרים

הערה: כל החומרים והפתרונות חייבים להיות מעוקרים לפני השימוש.

  1. לחטא את כל כלי הניתוח והרטט חומר חיתוך (מחזיק סכין, מדגם דיסק, מגש מאגר) בתנור חיטוי יבש עבור 4 h ב 180 ° c.
  2. לחטא חומרים רגישים לטמפרטורה או ציוד באמצעות הקרנה אולטרא-סגול או גמא.
  3. לעקר מדיה ופתרונות על ידי אוטוקלבציה או סינון דרך ממברנות 0.22 יקרומטר הנקבוביות.

2. הכנת פתרונות

  1. להכין 15-20 mL של פתרון התחבורה: 50% v/v הנקס מאוזנת פתרון המלח (HBSS) pH 7.4, 50% v/v בסיס הבסיס עבור תחזוקה של לאחר לידה ונוירונים במוח למבוגרים (טבלת חומרים), שיושלם עם 10 מ"מ 4-(2-הידרוקסיל)-1- חומצה בלתי מצויה (Hepes), 3 מ"ג/מ"ל גלוקוז, ו 33 μg/mL gentamicin.
    הערה: הפתרון התחבורתי חייב להיות מקורר ומחמצן (מבעבע עם גז קרבוסג'ן) לפחות 20 דקות לפני איסוף המדגם.
  2. להכין 300 mL של הפתרון לחתוך (HBSS בתוספת עם 10 מ"מ HEPES ו 3 מ"ג/mL גלוקוז) ומצננים אותו במקפיא עד לנקודה של היווצרות גביש הראשונית.
  3. הכינו 20 מ ל של התרבות הבינונית: בינונית בסיס לתחזוקת לאחר לידה ונוירונים במוח בוגרים (טבלת חומרים) שיושלם עם 1% L-גלוטמין נגזרת (טבלת חומרים), 2% תוספת עבור תרבות עצבית (שולחן של חומרים), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 0.25 μg/mL אמפוריטיצין B.

3. הגדרת מנגנון הפריסה

הערה: פרוטוקול זה מבוצע באופן אידיאלי בעזרת עמית בעקבות לוגיסטיקה של אוסף דגימות בחדר הניתוח.

  1. בדלי של מלח הוסיף קרח, לתת את הפתרון הפרוסות לנוח תחת התערובת קרבוסבית מבעבע (95% O2, 5% CO2) לפחות 20 דקות לפני השימוש.
  2. להכין בלוק של 3% agarose (כ 2 ס"מ x 2 ס מ x 2 ס מ) ו-להדביק אותו לדיסק המדגם הרטט כדי ליצור תמיכה מכנית נוספת לדגימת רקמות במהלך החיתוך (איור 1E).
  3. הגדר את הרטט לחיתוך: עובי המקטע של 200 μm, תדירות הרטט של 100 Hz, ומהירות החיתוך בין 0.5-1.0 mm/s.
  4. נעל את מגש מאגר הרטט לבסיס הרטט והוסף קרח כדי לשמור אותו בקירור לפני קבלת פתרון הפרוסות והדגימה, ולאורך הליך הפריסה.

4. אוסף דוגמאות

הערה: בפרוטוקול זה נאסף הרקמה הנאוקורטילית האנושית בחדר הניתוח והועבר למעבדה.

התראה: בעת התמודדות עם דגימות אנושיות, בצע את פרוטוקולי הבטיחות המתאימים שנקבעו על-ידי המוסד.

  1. הגדר את מנגנון ההובלה (איור 1ג) זה מורכב: צילינדר גז נייד עם תערובת קרבופלאני מחובר לתוך לחץ/שטף שסתום השולט את תפוקת הגז מחובר אבובים סיליקון המחבר את תפוקת הגז לתחבורה כלי ספינת תובלה, בדרך כלל 50 mL מצנרת צנטריפוגה עם מכסה מחורר עבור קלט גז, המכיל את פתרון התחבורה; וקרח לדגימת קירור במהלך ההובלה.
  2. לאסוף ולהעביר את הדגימה (איור 1B). מיד למעבדה שוטף את הדגימה בתמיסה של הובלה קרה (באופן קבוע מבעבע בתערובת קרבוסדיות).

5. פריסה לפרוסות

  1. העבר את הדגימה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 20 מ"מ) המכילה את פתרון הפרוסות וכלה בכלים כירורגיים משובחים, הסר בזהירות ככל האפשר מהקרומי שנותרו במדגם (איור 1ד).
  2. בחר את הכיוון הטוב ביותר של הדגימה להפקת פרוסות עם מאפיינים מסוימים של העיצוב הניסיוני, עם להב האזמל לא 24, לקצץ משטח שטוח להיות הבסיס דבוק הדגימה הדיסק.
  3. באמצעות כפית פלסטיק חד פעמית ומכחולים עדינים, לאסוף את הרסיס מצלחת פטרי ואת הפתרון העודף יבש באמצעות נייר סינון (יבש על ידי קפילריות ולהימנע מלגעת ברסיס רקמה עם נייר).
  4. באמצעות דבק-על, לחבר את הרקמה לדיסק מדגם הרטט עד שהוא מחובר היטב לדיסק ובמגע עם בלוק agarose (איור 1E).
  5. הניחו את הדיסק הדגימה של הרטט (כאשר הרקמה מחוברת כהלכה) במגש האגירה של הרטט שמולא בפתרון הפרוסות שחייב להיות מבעבע במהלך כל התהליך.
  6. נעל את מחזיק הסכין במקומו עם להב התער מתוקן בחוזקה.
  7. פתרון הפריסה חייב לכסות הן את הדגימה והן את הלהב, רק לאחר מכן להתחיל לחתוך (איור 1F).
  8. חותכים את הדגימה לתוך 200 יקרומטר פרוסות.
    הערה: למרות שחלק מסוגי הרטט חותכים את הדגימות באופן אוטומטי, ההתבוננות הקרובה וההתאמות המשניות במהירות הפרוסות במהלך התהליך עשויות לסייע בהפקת פרוסות טובות יותר. התעלם מפרוסות חריגות ראשוניות.
  9. העבר את הפרוסות ממגש המאגר לצלחת פטרי עם הפתרון לפרוסות ולקצץ קצוות רופפים ומאטר לבן עודף לחלק של סביב 70% קליפה/30% החומר הלבן.

6. תרבות ומין

הערה: בצע שלב זה בארון זרימה למינארי תחת סביבה סטרילית.

  1. הוסף 600 μL של התרבות בינונית לכל היותר (ב 24 צלחת באר) ו מודקת לפחות 20 דקות ב 36 ° צ' ו 5% CO2 לפני ציפוי הפרוסות.
  2. צלחת פרוסה אחת בכל פעם באמצעות מברשת צבע (איור 1G).
  3. אם יש בארות שאינן בשימוש בצלחת, למלא אותם עם 400 μL של מים סטריליים.
  4. מודקת את הצלחת ב 36 ° c, 5% CO2.
    הערה: החלפת בינונית ראשונה חייבת להתבצע בין 8-16 h לאחר הציפוי בהתאם לגודל הפרוסה.
  5. תוספת 10 מ ל של בינוני התרבות הוכנו בעבר עם 50 ng/mL המוח נגזר neurotrophic פקטור (BDNF).
    הערה: במהלך 8-16 h הראשון, הפרוסות מודדות ב-600 μL של בינוני כדי למנוע מניעת מזון וחמצה, מכיוון שצריכת בינונית בשלב זה מואצת. מהשלב הבא, עוצמת הקול של בינונית לטובה מותאמת ל-400 μL.
  6. הסרת 333 μL של המדיום הממוזג מכל באר ולהוסיף 133 μL של מדיום טריים BDNF-בתוספת.
  7. חזור על התהליך של החלפת בינונית כל 24 שעות על ידי החלפת שליש של המדיום הממוזג עם בינוני חדש BDNF-בתוספת.

7. הערכת בריאות, מורפולוגיה ותפקוד בפרוסות מתורבתות

הערה: כדי לגרום למוות בתאים לצורך המחשה בתוצאות הנציג, חלק מהפרוסות הוגשו לטיפול של 24 שעות עם מתח החמצון H2O2. צעדים 7.1.2 ו 7.1.3 לתאר את השימוש H2O2 כדי לגרום למוות תאים.

  1. כדאיות תאית
    הערה: שיטה פשוטה ופשוטה להערכת נוירוטוקסיט/נוירו-הגנה בתרבויות הפרוסה התיגר היא 3-(4, 5-diמתילתיול -2-yl)-2, 5-diפניליום (MTT)ה36, אשר מודד את אחוז התאים הפעילים מטבולית בתנאים נורמליים בהשוואה לדגימות שטופלו.
    1. בארון הזרימה המבינארי, החליפו שליש מהמדיום במדיום טרי.
    2. מ 30% H2o 2 הפתרון במלאי, להוסיף נפח של H2o2 לכל טוב כדי להגיע לריכוז הסופי המיועד (30 מ"מ או 300 מ"מ).
      הערה: H2O2 נוספה לאחר השינוי היומי של המדיום כדי להבטיח את האספקה הנכונה של חומרים מזינים טריים לפני האתגר.
    3. מודקת צלחת 24 שעות ב 36 ° c, 5% CO2.
      הערה: לאחר H2O2 טיפול (או תמריצים רעילים אחרים), השלבים הבאים מתארים את קביעת הכדאיות בתאים על-ידי שיטת mtt.
    4. הוסף 40 μL של פתרון MTT לריכוז הסופי של 0.5 mg/mL לכל טוב בצלחת.
    5. מודקת את הצלחת ב 36 ° c, 5% CO2 עבור 3 שעות.
    6. רוחצים את הפרוסות בתמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS) ומעבירים למיקרו-צינורית.
    7. הסר בזהירות את הפתרון שנותר על ידי ליטוף.
    8. שוקלים את המיקרוצינורות המכילים את הפרוסות כדי לקבוע את המסה של כל פרוסה (זהו המפתח לנרמול הקריאות שהושגו).
      הערה: במידת הצורך, ניתן להקפיא דגימות (-20 ° c) בשלב זה לעיבוד מאוחר יותר.
    9. הומוגון הפרוסות ב-200 μL של איזופנול/HCl באמצעות מנועי ממונע.
    10. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 דקות ב 2600 x g.
    11. אספו את הסופרנטאנט ומדדו את הספיגה ב-540 ננומטר.
  2. הנגרמת כתוצאה מלחץ עצבי
    הערה: זירחון המופעל חלבון קינאז (MAPK) איתות חלבון מדורגים, ואחריו בלוק המערבי, ניתן להשתמש בקוונפיקציה של התגובה העצבית ל-KCl-המושרה depolarization37 .
    1. בארון הזרימה, החלף את מדיום התרבות על-ידי 300 μL של HBSS לפני 36 ° c.
    2. החלף את HBSS עם 300 μL של HBSS טריים בעבר בשפה 36 ° c.
    3. מודקת את הצלחת ב 36 ° c, 5% CO2 עבור 15 דקות.
    4. החלף את HBSS עם HBSS טרי או עם הפתרון 80 mM KCl הקיטוב (הן ב 36 ° c) ו דגירה ב 36 ° c, 5% CO2 עבור 15 דקות.
    5. העבירו את הפרוסות מהצלחת למיקרוצינורות. בשלב זה ניתן לאחסן פרוסות ב-20 ° c לעיבוד מאוחר יותר.
    6. הכנת תמציות רקמות ב-150 μL של radioimmunoprecipitation מאגר (ריפה) המאגר (50 mM טריס-HCl; 150 מ"מ הנאל; 1 מ"מ EDTA; 1% nonionic הסטנט; 0.1% נתרן dodecyl סולפט; pH 7.5). צנטריפוגה מחלצת ב 4 ° c עבור 10 דקות ב 16000 x g, לאסוף supernatant, ולקבוע ריכוז החלבון הכולל באמצעות שיטת ברדפורד.
    7. טעינה 30 μg של חלבון מוחלט על 12% נתרן dodecyl סולפט פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-עמוד).
    8. לאחר האלקטרופורזה, להעביר את התוכן ג'ל קרום ניטרוצלולוזה.
    9. לאחר חסימת הקרום עם 5% חלב יבש ללא שומן ב-TBS פלוס 0.1% רצף, הדגירה עם העכבר נגד הטבה (1:1000) עבור 16 h ב 4 ° c. לאחר כביסה, מודטה עבור 2 h ב RT עם ארנב anti-ERK1/2 (1:1000).
    10. דגירה עם הנוגדן המתאים HRP מצומשני ב RT עבור 1 h.
    11. לחשוף עם המצע HRP המועדפת.
  3. הערכה מורפולוגית
    הערה: בנוסף הערכות הישרדות ופונקציונליות התאים, חשוב לנתח מורפולוגיה רקמות. להיות מודעים לכך שניסוח מחדש של הפרוסה התרבותית הוא צעד חשוב להפקת חומר באיכות גבוהה ככל האפשר לניתוח מורפולוגיים.
    1. תיקון, הקפאה והקפאת הפרוסות
      1. להעביר את הפרוסות מן הבארות עם בינוני התרבות לצלחת חדשה 24 טוב המכיל PBS.
      2. הוצא את ה-PBS והוסף 1 מ ל של 4% פאראמפורמלדהיד (בתחתית). חשוב לשמור על הפרוסות שטוחות לפני הוספת המטה. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
      3. הסר בזהירות את הפתרון בלחצי הראשון והוסף 1 מ ל 30% סוכרוז פתרון. מודטה עבור 48 h ב 4 ° c.
      4. הגדר את ההקפאה מיקרוטומה ל-40 ° c.
      5. הכינו בסיס סוכות על השלב המיקרוטום שבו יש להניח את הפרוסות (איור 2א). הניחו לו לקפוא לחלוטין ולחתוך בזהירות חלק מהסוכות הקפואות כדי לייצר משטח שטוח עליו הפרוסה תמוקם.
      6. מניחים כל פרוסה בסרט פלסטיק נמתח ומשתמשים במכחול כדי לשטוח את הרקמה.
      7. העבר את הפרוסה הנמתחת לבסיס סוכות הקפוא במהלך אחד בודד.
        הערה: לא ניתן להזיז את הפרוסה ברגע שהיא מעבר לבסיס הקפוא של הסוכרוז. בצע צעד העברה זה בזהירות.
      8. תנו לפרוסה לנוח 5-10 דקות. להקפאה הנכונה
      9. חותכים את הפרוסה למקטעים של 30 יקרומטר.
      10. העבר את הסעיפים 30 יקרומטר לצלחת פטרי המכילה את ה-PBS.
      11. המשך לפרוטוקול היסטולוגיה יותר הולם את התכנון הניסיוני.
        הערה: הסעיפים 30 יקרומטר ניתן להשתמש בקלות עבור אימונוהיסטוכימיה בחינם צף, רכוב על שקופיות מיקרוסקופ עבור היסטולוגיה נוסף או מאוחסן בתמיסה נגד קיפאון ב-20 ° c.
    2. אימונוהיסטוכימיה
      הערה: אימונוהיסטוכימיה ומנגנוני החיסונית של פרוטוקולים סטנדרטיים משתנים בין מעבדות. לקבלת גירסה מפורטת של הפרוטוקול שבשימוש כאן, עיין בהורטה ואח '38. נוגדנים ראשוניים המשמשים לאחסון חיסוני הציג באיור 2 כוללים גרעיני עצבי (neun), מרקר בריא בוגר תא העצב, חלבון חומצי glibrillary (gfap), הסמן astorcytes, מתאם סידן כריכת כריכה (רשות-1), ו מיקרוגלייה סמן.
      1. מודדת את הפרוסות בתמיסה חוסמת (למשל, 2% סרום חמור רגיל ב-PBS) עבור 40 דקות.
      2. דגירה הלילה עם הנוגדן העיקרי תחת עצבנות קלה ב 4 ° c.
      3. לאחר כביסה עם PBS, דגירה עבור 120 דקות עם נוגדן משני biotinylated תחת עצבנות קלה ב RT.
      4. לאחר כביסה עם PBS, דגירה ב RT עבור 120 דקות עם avidin-peroxidase המשלים (טבלת חומרים).
      5. לחשוף עם קמצוץ + 0.04% ניקל אמוניום.
      6. הר הכתמים על שקופיות מיקרוסקופ מצופה ג'לטין ולתת להם אוויר יבש. מייבשים באתנול, diaphanize ב xylene, לסיים עם הרכבה בינונית (טבלה של חומרים), לכסות עם שמיכות, ותמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היבט קריטי כדי להעריך את האיכות והבריאות של פרוסות המתורבתות היא הנוכחות והמבנה האופייני של סוגי תאים עצביים צפוי, נוירונים, ותאי גליה. האדריכלות הטיפוסית של הדבקת קליפת הגוף האנושית נצפתה בפרוסה ב-DIV4, שנחשפה על ידי אימונוולטילינג עצבי (איור 2ד). בנוסף, הנוכחות הצפויה של מיקרוגלייה ו אסטרוגליה (איור 2ב, ג) נצפתה גם. תוצאות אלה מציגות שארכיטקטורת רקמות אינה מושפעת באופן משמעותי מתהליך הניתוח/דגימת העיבוד או לפי התקופה הקצרה בתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה להפקת תרבות פרוסה בחינם, לטווח קצר, היא שיטה חלופית לפרוסות בוגרות של האדם האנושי. פרוטוקול כזה עבור תרבויות פרוסה עשוי להיות קל למחקרים על (אבל לא מוגבל) אלקטרואופטיקה1,44,45, אלקטרופיזיולוגיה2,3,4,5 , לטווח קצר הפלסטיות46,47, לטוו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי FAPESP (גרנט 25681-3/2017 ל-AS), גלימות (פוסט דוקטורט מלגת PNPD/INCT-HSM כדי A.F. ו-דוקטורט מלגת N.D.M.) ו FAEPA. G.M.A. מחזיקה מלגת מאסטר מ FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. מחזיקה מלגת מחקר CNPq. אנו מודים למטופלים ולמשפחותיהם על תרומת הרקמה החוזרת למחקר זה. היינו רוצים להכיר בתמיכה של תושבים, אחיות, טכנאים, וצוות CIREP, מבית החולים הקליני בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו, אוניברסיטת סאו פאולו, מי עזר בשלבים שונים של התהליך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-פרופנולMerck1096341000
אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, תמיסה של 30%סיגמא אולדריץ'A3449 
AgaroseSigma AldrichA9539
אמוניום פרסולפטSigmaA3678-25G
אמפוטריצין BGibco15290-018
נוגדן נגד ERK 2 (ארנב)Santa Cruz Biotecnologysc-154דילול 1:1,000 ב-BSA 2.5%
נוגדנים נגד pERK (עכבר)Santa Cruz Biotecnologysc-7383דילול 1:1,000 ב-BSA 2.5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
בקר סרום אלבומיןסיגמא אולדריץ'A7906
ברדפורד 1x מגיב צבעBioRad500-0205
EDTASigmaT3924בשימוש במאגר RIPA
גלוקוזMerck108337
GlutamaxGibco35050-061
מלחים מאוזנים של האנקסיגמא אולדריץ'H1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
חומצה הידרוכלוריתMerck1003171000
מי חמצן (H2O2)Vetec194
Mouse IgG, Ab שלם מקושר HRP (נגד עכברים)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000בשימוש במאגר RIPA
Neurobasal AGibco10888-022
חלב יבש ללא שומן (Molico)Nestléמשמש לחסימת ממברנה
PBS Buffer pH 7,2Laborclin590338
פניצילין/סטרפטומיציןסיגמא אולדריץ'P4333
אשלגן כלוריMerck1049361000
פריים ווסטרן מגיב לזיהוי כתמיםGERPN2232
ארנב IgG, AB שלם מקושר HRP (אנטי ארנב)GENA934-1ML
SDSSigmaL5750בשימוש במאגר RIPA
TEMEDGE17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378בשימוש במאגר RIPA
Triton x-100SigmaX100בשימוש במאגר RIPA
Ultrapure WaterMilliporeמים סטריליים, שמקורם במערכת טיהור המים MiliQ
<חזקים>ציוד וחומרים
צלחות 24 בארותCorningCL S3526תחתית שטוחה עם מכסה
אמרשם פוטרן פרימיום (קרום ניטרוצלולוזה) GE29047575
תערובת קרבוגןמרטינס95% O2, 5% CO2
CO2 חממהניו ברונסוויק סיינטיפיקCO-24דגירה של פרוסות 5% CO2, 36º C
Microplate Readerמכשירים
מיקרו צינורותגריינר0016081,5 מ"ל מיקרו-צינור
עלי ממונעקימבל צ'ייס
כפיתגודל של כף קינוח
סכין גילוחביקכרום פלטינה, המשמש לחיתוך עם
להבאזמל ויברטוםבקטון דיקינסון (BD)מספר 24משמש לחיתוך רקמות; מומלץ באותו גודל או קטן יותר
Superglue (Loctite Super Bonder)הנקל: Etilcianoacrilato; חומצה 2-פרופנואית; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; הומופולימר
Vibratome Leica14047235612 - VT1000S
<חזק>שם החומר/ציוד לאימונוהיסטוכימיה
נוגדנים נגד NeuN (עכבר)Millipore דילול MAB3771:1,000 בנוגדני חוצץ פוספט
אנטי-GFAP (עכבר)MerckMAB360דילול 1:1,000 בנוגדני חוצץ פוספט
אנטי-IBA1 (ארנב)AbcamEPR16588 - ab178846דילול 1:2,000 במאגר פוספט
נוגדן IgG נגד עכבר ביוטיניל (H+L)וקטורBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
אתנולMerck1.00983.1000
ג'לטיןסינת'00G1002.02.AEמשמש לציפוי שקופיות
MicrotomeLeicaSM2010Rמצויד בשלב הקפאה (BFS-10MP, Physiotemp), מוגדר ל-40º C
סרום חמור רגילג'קסון מחקר חיסוני017-000-121
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
ארנב IgG, שרירי בטן שלמים מקושרים HRP (נגד ארנב)GENA934-1ML
שקופיות (כוכב פרוסט)Knittel Glaserשקופיות מצופות ג'לטין
סוכרוזVetec60REAVET017050
ערכת Vectastain ABC HRP (פרוקסידאז, סטנדרטי)וקטורPK-4000, ערכה סטנדרטית
קסילןסינתיסייזר01X1001.01.BJ
לבן מולקולריים פלסטיק הרכב

מקורות

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20(2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103(2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002(2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

שכובתיות קליפת המוחבדיקות ביוכימיותבדיקות ביולוגיה של התאאימונוהיסטוכימיהחיתוך בויברטוםאתגר מימן-פרוקסידבדיקת רדוקציית MTTזכרפוספוריליזציה של ERK
לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.