כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
איונים הלבלב מהווים תאים אנדוקריניים עם דפוסי ביטוי הורמונים ייחודיים. התאים האנדוקריניים מציגים הבדלים פונקציונליים בתגובה לתנאים נורמליים ופתולוגיים. המטרה של פרוטוקול זה היא להפיק נתונים באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של כל סוג תא האנדוקרינית עם שימוש של מיקרופלואידיc מבוססי-droplet המבוססת על טכנולוגיית הרצף RNA של תא יחיד. נתונים אלה יכולים להיות מנוצל כדי לבנות את הפרופיל ביטוי גנים של כל סוג תא האנדוקרינית בתנאים נורמליים או ספציפיים. התהליך דורש טיפול זהיר, מדידה מדויקת ובקרת איכות קפדנית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים מפורטים עבור האדם הלבלב, ברצף וניתוח נתונים. תוצאות הנציג של כ 20,000 האדם תאים איון יחיד להפגין את היישום המוצלח של הפרוטוקול.
מבוא
איולי הלבלב לשחרר הורמונים אנדוקרינית לווסת את רמות הגלוקוז בדם. חמישה סוגי תאים אנדוקרינית, אשר שונים מבחינה פונקציונלית מורפולוגית, מעורבים תפקיד חיוני זה: α-תאים לייצר glucagon, β-תאים אינסולין, δ-תאים סוסטטין, PP תאים הלבלב polypeptide, ו ε-תאים גרלין1. ביטוי גנטי פרופיל הוא גישה שימושית כדי לאפיין את התאים האנדוקרינית בתנאים נורמליים או ספציפיים. היסטורית, כל ביטוי גנים איון פרופיל נוצר באמצעות microarray הדור הבא RNA רצף2,3,4,5,6,7 ,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. לדיסוציאציה של איון האדם
- השג איונים אנושיים מבודדים מתורמים איברים של גוויות של שני המין, הגילאים בין 15-80 שנים, ללא מחלות טרום קיימים, אלא אם כן האיים מתורמים עם דמוגרפיה ספציפית נדרשים למטרת המחקר.
- לאחר בידוד, יש איונים מבודדים שנשמרו במתקן תרבות הרקמה במשך 2-3 ימים על הספק. לעתים קרובות לוקח יותר מיום אחד נזקים איון להיות גלוי.
- מניחים את איונים בבקבוק לטבול אותו לחלוטין במדיום איון. . קח את זה למעבדה במשלוח לילה
- להשיג את הכמות המקבילה איון (IEQ) של האיים הנשלחים מן הספק איון.
- לשחזר איים מהמשלוח ביום ההגעה איון. לבצע צעד זה באמצעות ברדס כדי למזער את הסיכוי לזיהום.
- מגניב מדיה איון שלם (CMRL-10....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
זרימת העבודה ברצף RNA של התא היחיד מורכבת משלושה שלבים: השעיית האיים האנושיים שלמים להשעיה של תא בודד, לכידת תאים בודדים באמצעות הטכנולוגיה מבוססת droplet, וניתוח של נתוני RNA-seq (איור 1). ראשית, האיים האנושיים הנרכשים. הוכנסו לפני הלילה האיים שלמים נבדקו תחת המיקרוסקופ (איור 2 א). היושרה של תאים שאינם מונתק מאומת באמצעות הזריחה של RNA ב היברידיזציה באתרו (RNA-FISH). כפי שמוצג באיור 2B, הנתק α-ו-β-ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכנולוגיות חד-תאי שפותחו בשנים האחרונות מספקות פלטפורמה חדשה לאפיון סוגי תאים וטרוגניות מולקולרית לחקר באיים הלבלב האנושי. אימצנו פרוטוקול של מיקרופלואידיג בידוד תא בודד וניתוח נתונים כדי ללמוד איונים אנושיים. הפרוטוקול שלנו הפיק בהצלחה נתונים רצפי RNA של למעלה מ 20,000 תאים איון יחיד האדם עם וריאציות קטנות יחסית באיכות רצף אפקטים אצווה.
במיוחד, שני שלבים הם קריטיים בפרוטוקול זה עבור תוצאות באיכות גבוהה. היזהרו צריך להילקח כאשר מנתק את האיים האנושיים. . חשוב לא לעכל את האיונים חלוקה למחיצות של.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים הם עובדים ובעלי מניות של Regeneron פרמצבטיקה, Inc.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 30 ומיקרו; m מסנני הפרדה מוקדמת | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | מסננת תאים |
| 8 חדרים שקופיות | Chemometec | 102673-680 | Dell ספירת שקופיות בדיקת |
| ביואנלייזר ערכת DNA רגישות גבוהה | Agilent | 5067-4626 | עבור QC |
| סרום בקר אלבומין | Sigma-Aldrich | A9647 | מדיה תאית בודדת |
| כרום תא יחיד 3' ספרייה & ערכת חרוזי ג'ל v2, 16 rxns | 10X גנומיקה | 120237 | ריאגנטים תאים בודדים |
| כרום תא יחיד ערכת שבב v2, 48 rx (6 שבבים) | 10X גנומיקה | 120236 | שבבים מיקרופלואידיים |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | מדיה מלאה של אי |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | מאגר אלוטיון |
| צלחת PCR Eppendorf twin-tec, 96 בארות, כחול, חצי חצאית | VWR | 47744-112 | צלחת תחליב |
| סרום בקר עוברי | ThermoFisher | 16000-036 | מדיה מלאה |
| לאיים אנושיים Prodo | Labs | HIR | איים אנושיים מבודדים |
| L-גלוטמין (200 מ"מ) | ThermoFisher | 25030-081 | מדיית אי מלאה |
| ערכת הכנת ספריית DNA Nextera (96 דגימות) | Illumina | FC-121-1031 | ריאגנטים להכנה |
| הבאSeq 500/550 ערכת תפוקה גבוהה v2.5 (75 מחזורים) | Illumina | FC-404-2005 | רצף |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | מדיה אי שלם |
| Qubit רגישות גבוהה dsDNA ערכת | טכנולוגיות חיים | Q32854 | לפתרון QC |
| 18 | Chemometec | 103011-420 | בדיקת ספירת תאים מגיב |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | חרוזי טיהור |
| כלי תרבית רקמות (10 ס"מ) | VWR | 10861-594 | לתרבית איים |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | פתרון דיסוציאציה של תאים |
| Zymo DNA Clean & רכז -5, 50 תגובות | VWR | 77001-152 | עמודות ניקוי ספרייה |
מקורות
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
