הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

10.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59871

⸱

19 ביולי 2019

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oncology in South China, Collaborative Innovation Center for Cancer Medicine, Sun Yat-sen University Cancer Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות כדי ליצור מודלים של מטופלים שנגזר על המטופל (PDX) ושורות של תאים סרטניים העיקרי מדגימות סרטן הקיבה כירורגית. השיטות מספקות כלי שימושי לפיתוח סמים וחקר ביולוגיה של הסרטן.

תקציר

השימוש במודלים פרה-קליניים כדי לקדם את הבנתנו את הביולוגיה של הגידול ולחקור את היעילות של הסוכנים הטיפוליים הוא מפתח לחקר הסרטן. למרות שיש הרבה מבוססת סרטן קיבה מבוסס קווי ומודלים רבים של העכבר טרנסגניים קונבנציונאלי למחקר טרום קליני, החסרונות של אלה בתוך מבחנה במודלים vivo להגביל את היישומים שלהם. בגלל המאפיינים של מודלים אלה השתנו בתרבות, הם כבר לא מודל הגידול טרוגניות, ואת התגובות שלהם לא הצליחו לחזות את התגובות בני אדם. כך, מודלים חלופיים שמייצגים טוב יותר את טרוגניות הגידול מפותחים. המטופל נגזר מבע (pdx) מודלים לשמר את המראה היסטולוגית של תאים סרטניים, לשמור על טרוגניות intratumoral, וטוב יותר לשקף את הרכיבים האנושיים הרלוונטיים של מיקרוסביבה הגידול. עם זאת, זה בדרך כלל לוקח 4-8 חודשים כדי לפתח מודל PDX, אשר ארוך יותר ההישרדות הצפויה של חולי קיבה רבים. מסיבה זו, הקמת קווי התאים הראשוניים לסרטן עשויה להיות שיטה משלימה אפקטיבית ללימודי תגובה לסמים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להקמת מודלים PDX ושורות של תאים סרטניים העיקרי של סרטן כירורגי הקיבה דגימות. שיטות אלה מספקות כלי שימושי לפיתוח סמים וחקר ביולוגיה של הסרטן.

מבוא

סרטן קיבה הוא החמישי הנפוץ ביותר בעולם הסרטן הגורם המוביל השלישי למוות בסרטן. ב 2018, מעל 1,000,000 מקרים חדשים של סרטן קיבה אובחנו ברחבי העולם, ו מוערך 783,000 אנשים נהרגו על ידי מחלה זו1. השכיחות והתמותה של סרטן הקיבה להישאר גבוה מאוד במדינות אסיה הצפון מזרחי2,3. למרות התקדמות משמעותית בתחום של סרטן therapeutics, הפרוגנוזה של חולים עם סרטן קיבה מתקדם נשאר עני, עם שיעור ההישרדות של חמש שנים של כ 25%4,5,6, 7,. כך, יש צורך דחוף לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לסרטן קיבה

הטיפול בסרטן קיבה הוא מאתגר בשל טרוגניות גבוהה שלה8,9. כך, השאלה כיצד להתמודד עם האתגרים של טרוגניות הגידול כדי להגשים את הרפואה המדויקת היא מרכזית לחקר הסרטן. בתוך מבחנה במודלים vivo לשחק תפקידים מכריעים בהסבר המנגנונים הטרוגנית וביולוגיה של סרטן הקיבה. עם זאת, למרות שיש מספר רב של סרטן קיבה קווי מודלים רבים העכבר הטרנסגניים הקונבנציונלית למחקר טרום קליני, החסרונות של המודלים האלה להגביל את היישומים שלהם10. בגלל המאפיינים של מודלים אלה השתנו בתרבות, הם כבר לא מודל הגידול טרוגניות, ואת התגובות שלהם לא הצליחו לחזות את התגובות בני אדם11. סוגיות אלה מגבילות באופן חמור את האפשרות לזהות קבוצות מסוימות של חולי סרטן שיגיבו לתרופות ממוקדות. התרבות לטווח קצר של גידולים ראשוניים מספק דרך מהירה יחסית ואישית כדי לחקור את התכונות הפרמקולוגית של סרטן, אשר צפוי להיות סימן ההיכר של טיפול בסרטן אישית.

המטופל-xenografts (PDXs) מעדיפים כמודל טרום-קליני חלופי לפרופיל תגובת התרופה12. בנוסף, מודלים pdx מציעים כלי רב עוצמה עבור לימוד ייזום והתקדמות של סרטן13,14. Pdx מודלים לשמר את המראה היסטולוגית של תאים סרטניים, לשמור על intrאטומוראלית טרוגניות, וטוב יותר לשקף את הרכיבים האנושיים הרלוונטיים של מיקרוסביבה הגידול15,16. עם זאת, המגבלה של מודלים בשימוש נרחב PDX הוא שיעור ההצלחה הנמוכה להקמת והפצת באופן סדרתי גידולים מוצק אנושי. במחקר זה, שיטות מוצלחות מאוד להקמת דגמי PDX וקווי התא הראשי מתוארים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

זה מחקר אנושי אושרה על ידי האתיקה המוסדית הוועדה של אוניברסיטת סון יאט-סן סרטן המרכז (SYSUCC, גואנגג'ואו, סין). המחקר בעלי חיים אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש של אוניברסיטת סון יאט-סן. הערה: כל הניסויים בוצעו בהתאם לחוקים הרלוונטיים ולהנחיות המוסדיים, כולל ההנחיה להגנה על החשיפה התעסוקתית מפני פתוגנים הנישאים בדם.

1. הכנה לדוגמא

  1. להשיג רקמות סרטן קיבה (P0 = מעבר 0) ישירות מהפעולה. הדגימה צריך להיות גדול יותר מ 0.5 ס"מ3.
  2. הכינו 3-4 mL של פתרון מניות: לדוגמה, RPMI-1640 בינונית (1x) שיושלם עם 10% סרום פרה עוברי (FBS), 100 U/mL ו 0.1 mg/mL סטרפטומיצין.
  3. הכניסו את הדגימה הטרייה של הגידול בתמיסה המניה ב -4 ° c במשך לא יותר מ -4 שעות.

2. הקמת מודל PDX (איור 1)

  1. כדי להבטיח אזור כירורגי סטרילי, לחטא את כל החומרים עם אור אולטרה סגול עבור יותר מ 30 דקות לפני העברת לתוך המעבדה בעלי חיים.
    הערה: חדר המבצע צריך להיות מחוטא עם אור אולטרה סגול עבור 30 דקות, לפני שאנחנו לנקות את השולחן עם החומצה של dichloro isocyanuric חטא נתרן. ואז povidone-יוד משמש כדי לחטא את העור.
  2. באמצעות מלקחיים ומספריים, בזהירות לנתח את רקמות הגידול לקצץ אותם לכמה חתיכות קטנות (כ 1 מ"מ3 קוביות) בתנאים סטרילי.
  3. האישה הזאת, 5 עד 7 שבועות בנוד-SCID-IL2rg (NSG) עכברים על ידי חשיפה ל -1-1.5% isofלוריאן עם מכונת הרדמה.
    1. הניחו את העכבר עד שיפסיק להיאבק, אך תחזק אפילו נשימה.
      הערה: שפופרת 50 mL הוא ציוד פשוט שמתפקד דומה למכונה הרדמה. השימוש במשחה העין הוטרינרית כדי למנוע יובש אינו נחוץ עקב זמן פעולה קצר.
  4. לעשות חתך 1 ס מ על שני האגפים באמצעות מספריים סטרילי, והשתל פיסת הגידול אחד לתוך כל אגף של העכבר.
    1. כדי להבטיח את פיסת הגידול לא להחליק החוצה, השתמש מלקחיים סטרילי לשבש את הרקמה התת עורית. ואז, לחתוך פיסת רקמת הגידול, ולמקם אותו לתוך האתר העמוק.
  5. סגור את אזור השתל על ידי תפר תת עורית עם מחטים תפר כירורגי, ולסמן את האוזניים עם תגי האוזן מתויג
  6. . חטא את הפצע ביוד
  7. בעדינות למקם את העכברים בכלוב ריק לאחר הניתוח תוך שמירה על שכיבה משנית. שימו לב למצב העכברים; הם מתעוררים ומתחילים ללכת כ 3-4 דקות מאוחר יותר. הניחו עכברים שעברו ניתוח בכלוב חדש אחר הופרדו מאלו שלא נחשפו לניתוח.
  8. להעריך את גודל הגידול על ידי. מישוש של אתר ההשתלה למדוד את הגידולים עם קליבר פעמיים בשבוע.
  9. לאחר הגידול מגיע 10 מ"מ בקוטר, מצב בעלי חיים מחמיר, או הגידול כיבית, המתת החסד של העכבר עם שיטת IRB אושרה. השתלה מחדש שנקטפו שברי הגידול טרי לתוך 2 עכברים חדשים עבור passaging, או באופן זמני לאחסן את הדגימות ב-PBS על הקרח לבידוד של קווי התא הראשי.

3. הקפאה רקמות

הערה: חלק זה מתייחס בעיקר לשיטות הפעולה של ערכת רקמות חי. הקיטים והציוד העיקריים מפורטים בטבלת החומרים.

  1. המתת חסד העכברים עם שיטת IRB שאושרו כאשר הגידול גדול מ 10 מ"מ בקוטר.
  2. באמצעות מלקחיים ומספריים סטריליים, לבודד באיטיות את הגידול מן העכברים.
  3. לשטוף את רקמות הגידול עם DPBS בצלחת 10 ס מ. לנתח ולהסיר שטחים נקרופטיים, רקמת שומן, קרישי דם ורקמת חיבור עם מלקחיים ומספריים.
  4. חותכים את רקמות הגידול לעובי 1 מ"מ מקסימום עם עובש.
  5. לשטוף את הפרוסות עם DPBS בצלחת 10 ס מ.
    הערה: התהליך הויטריפיקציה כרוך בשימוש בצינורות המסומנים ב-V1/V2/V3 בשלבים 3.6-3.8. המרכיבים העיקריים הם DMSO ו סוכרוז.
  6. להעביר את הפרוסות לתוך הצינור V1 עם מלקחיים, ו לדגירה את הצינור ב 4 ° c עבור 4 דקות. לגלגל ולהפוך את הצינור בקצרה, ולמקם אותו ב 4 ° c עבור 4 דקות נוספות.
  7. יוצקים את הפתרון V1 ופרוסות לתוך 10 ס מ צלחת. העבר את הפרוסות לתוך הצינור V2 עם מלקחיים, ו-הרכבת התחתית מודטה V2 ב-4 ° c עבור 4 דקות. לגלגל ולהפוך את הצינור בקצרה, ולמקם אותו ב 4 ° c עבור 4 דקות נוספות.
  8. יוצקים את הפתרון V2 ופרוסות לתוך צלחת 10 ס מ. להעביר את הפרוסות לתוך הצינור V3 עם מלקחיים, ו מודג את הצינור ב 4 ° c עבור 5 דקות. לגלגל ולהפוך את הצינור בקצרה, ולמקם אותו ב 4 ° c עבור לפחות 5 דקות. ודא שהפרוסות כולן מסתכמות בתחתית השפופרת.
    1. אם מספר פרוסות נשארות מרחפות, מסתכמות ומהיפוך את הצינורית בקצרה, ומניחים את הצינור ב-4 ° c שוב עד שכל הפרוסות מטביעים לחלוטין; אם יש צורך בכך, מחק את הפרוסות הצפות.
  9. יוצקים את הפתרון V3 ופרוסות לצלחת 10 ס מ.
  10. חותכים את מחזיקי הרקמה לאורך הנכון, ומניחים אותם על גזה סטרילית. העבירו את הפרוסות למחזיקי המחשב. לעטוף את הפמוטים עם גזה, ולמקם אותם בחנקן נוזלי באמצעות מלקחיים, ואחריו דגירה עבור 5 דקות.
  11. תייג את מבחנות הקריוגניים. עם מידע על הרקמה
  12. להעביר את הפמוטים עם פרוסות רקמה לתוך מבחנות קריוגניים, אשר מאוחסנים חנקן נוזלי.

4. בידוד תאים ראשוניים (איור 2)

  1. לעקר מלקחיים ומספריים עם קיטור בלחץ גבוה ב 121 ° c עבור 30 דקות.
  2. לכרות דגימות סרטן קיבה מתוך דגימות מחדש או שנקטפו רקמות PDX. הניחו את הרקמות על הקרח ולאחר מכן העבירו את הרקמות לצלחת תרבותית של 10 ס מ.
  3. לנתח ולהסיר שטחים נקרופטיים, רקמת שומן, קרישי דם ורקמת חיבור עם מלקחיים ומספריים.
  4. לשטוף את רקמות הגידול פעם עם DPBS המכיל 100 U/mL פניצילין 0.1 mg/mL סטרפטומיצין בצלחת 10 ס מ.
  5. חותכים את רקמת הגידול לתוך 1 מ"מ3 חתיכות על המכסה של המנה; עובי המקסימום של כל חתיכה צריך להיות 1 מ"מ.
  6. להעביר את הרקמות לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL עם כ 7 מ ל מסוג 1 הקולגנאז ו טריפסין (1:14) פתרון. מערבולת את התערובת לזמן קצר.
  7. מודקון את הצינור באמבט מים ב 37 ° c עבור 30-40 דקות. מערבולת התערובת כל 5 דקות.
  8. הוסף נפח שווה של RPMI-1640 בינונית (1x) בתוספת 10% FBS לצינור. מערבולת את התערובת ביסודיות.
  9. להעביר את התערובת לתוך שפופרת חדשה 50 mL של צנטריפוגה על ידי סינון איטי דרך מסנן 40 יקרומטר.
    הערה: השתמש במסננים 40 יקרומטר כדי להבטיח יחס גבוה יותר של תאים סרטניים. במקרה הצורך, ניתן להשתמש במסנני 100 יקרומטר כדי לשמר סוגים נוספים של תאים, כגון תאים אימונולוגיים.
  10. צנטריפוגה את filtrates ב 113-163 x g עבור 5-7 דקות ב RT. בזהירות להסיר את הסופרנטאנט.
  11. שטוף את הגלולה עם 5 מ ל של PBS, ובזהירות להסיר את הסופרנטאנט.
  12. אם הגלולה אדומה, הוא מכיל הרבה אריתרופוציטים. השהה מחדש בעדינות את הגלולה עם 500 μL של מאגר פירוק של תא דם אדום. לאחר הדגירה 5 דקות, להוסיף 5 מ ל PBS, ובזהירות להסיר את הסופרנטאנט.
  13. השהה מחדש את הגלולה עם בינונית תרבותית, והעבר את התערובת לצלחת 10 ס מ סטרילית.
  14. החליפו את המדיום עם המדיום המכיל סרום כל 2-3 ימים.
  15. העבר את התאים העיקריים באמצעות טריפסין/EDTA כאשר הם מגיעים 50% המפגש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן, רקמות הגידול מפעולה נשמרו בפתרון מניות עד לשלב הבא. בתוך 4 שעות, רקמות הגידול נחתכו לחתיכות קטנות מושתל לתוך האגפים הקטנים של עכברים NSG כי היה מורדם באמצעות כותנה שספוגה isofלוריאן. גידולים גדולים יותר 1 ס"מ3 יכול להיות resected עבור השרשה לתוך עכברים חדשים (איור 1) או לפרוס בזהירות ונשמר בחנקן נוזלי לאחר הפרוטוקול. במחקר זה, גידולים הדור הראשון גדל לאט יותר מאשר אלה בדורות המאוחרים, לוקח 3 שבועות או יותר כדי להגיע לגודל המתאים. שיעור ההצלחה של היווצרות הדור הראשון גידול תת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

סרטן קיבה היא מחלה אגרסיבית עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות; thus, מודלים של סרטן קיבה הפכו משאב קריטי כדי לאפשר לימודי מחקר פונקציונלי עם תרגום ישיר למרפאה4,8,17. כאן, יש לנו לתאר את השיטות ואת הפרוטוקול של יצירת סרטן קיבה מודלים PDX וקווי התא הראשי. חשוב מכך, הן המאפיינים הביולוגיים מורפולוגיים וביולוגיים של דגימות סרטן הקיבה נשמרו בעיקר בדגמי PDX.

קיימות מספר נקודות קריטיות בפרוטוקול להקמת דגמי PDX שי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81572392); תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הארצי של סין (2016YFC1201704); טיפ-top כשרונות מדעיים וטכניים חדשניים של הנוער של גואנג-דונג מיוחד תמיכה תוכנית (2016TQ03R614).

אנחנו במיוחד להודות גואנגג'ואו Sagene ביוטכנולוגיה ושות, בע מ לסיוע בהכנת הדמויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
40 μ m מסננת תאיםBiologix, שאנדונג, סין15-1040
מיקרוסקופ ביולוגיOLYMPUS, טוקיו, יפןOLYMPUS CKX41
צנטריפוגהEppendorf, Mittelsachsen, גרמניה.5427R
CO2 חממהתרמו פישר סיינטיפיק, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בHERACELL 150i
DPBSBasalmedia Technology, שנחאי, סיןL40601
ארון מים אלקטרו-תרמוסטטיYiheng, שנחאי, סיןDK-8AXX
סרום בקר עובריWisent Biotechnology, ונקובר, קנדה86150040
IsofluraneBaxter, סיןCN2L9100
ערכת רקמות חיות ערכת קריוCelliver Biotechnology, שנחאי, סיןLT2601
ערכת הפשרת רקמות חיותCelliver Biotechnology, שנחאי, סיןLT2602
NSGBiocytogen, בייג'ינג, סיןB-CM-002-4-5W
Penicilin& סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב15140122
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםסולארביו, בייג'ינג, סיןR1010
RPMI-1640 בינוניתרמו פישר סיינטיפיק, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב8118367
מחטי תפר כירורגיות עם חוטLingQiao, נינגבו, סין3/8 קשת 4 פעמים; 10
תבניות ולהבי עזר מעובדים ברקמותCelliver Biotechnology, שנחאי, סיןLT2603
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב2003779
קולגנאז מסוג 1Thermo Fisher Scientific, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב17100017

מקורות

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Sugano, K. Screening of gastric cancer in Asia. Best Practive & Research in Clinical Gastroenterology. 29 (6), 895-905 (2015).
  3. Nikfarjam, Z., et al. Demographic survey of four thousand patients with 10 common cancers in North Eastern Iran over the past three decades. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (23), 10193-10198 (2014).
  4. Coccolini, F., et al. Advanced gastric cancer: What we know and what we still have to learn. World Journal of Gastroenterology. 22 (3), 1139-1159 (2016).
  5. Goetze, O. T., et al. Multimodal treatment in locally advanced gastric cancer. Updates in Surgery. 70 (2), 173-179 (2018).
  6. Graziosi, L., Marino, E., Donini, A. Multimodal Treatment of Locally Advanced Gastric Cancer: Will the West Meet the East? Annals of Surgical Oncology. 26 (3), 918(2019).
  7. Choi, Y. Y., Noh, S. H., Cheong, J. H. Evolution of Gastric Cancer Treatment: From the Golden Age of Surgery to an Era of Precision Medicine. Yonsei Medical Journal. 56 (5), 1177-1185 (2015).
  8. Zhang, W. TCGA divides gastric cancer into four molecular subtypes: implications for individualized therapeutics. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (10), 469-470 (2014).
  9. Tirino, G., et al. What's New in Gastric Cancer: The Therapeutic Implications of Molecular Classifications and Future Perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  10. Roschke, A. V., et al. Karyotypic complexity of the NCI-60 drug-screening panel. Cancer Research. 63 (24), 8634-8647 (2003).
  11. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Xu, C., et al. Patient-derived xenograft mouse models: A high fidelity tool for individualized medicine. Oncology Letters. 17 (1), 3-10 (2019).
  14. Lai, Y., et al. Current status and perspectives of patient-derived xenograft models in cancer research. Journal OF Hematology & Oncology. 10 (1), 106(2017).
  15. Kawaguchi, T., et al. Current Update of Patient-Derived Xenograft Model for Translational Breast Cancer Research. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 131-139 (2017).
  16. Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Research. 75 (15), 2963-2968 (2015).
  17. Liu, X., Meltzer, S. J. Gastric Cancer in the Era of Precision Medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (3), 348-358 (2017).
  18. Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. (7), Cold Spring Harbor. 694-708 (2014).
  19. McDermott, S. P., et al. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  20. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma (c) (null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  21. Wege, A. K., et al. Co-transplantation of human hematopoietic stem cells and human breast cancer cells in NSG mice: a novel approach to generate tumor cell specific human antibodies. MAbs. 6 (4), 968-977 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

עכברי NSGהשתלה של רקמת גידולהזרקה תת-עוריתעיכול באמצעות קולגנאז וטריפסיןפרוטוקול הקפאה לשימור (Cryopreservation)צביעת H&Eמחקרי תגובה לתרופות
הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.