מאמר שיטה

זיהוי הפעילות הרטרוטרנספוזיציה של קו חם-1s באמצעות PCR הופכי למרחקים ארוכים

9.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59880

⸱

27 ביולי 2019

 , 
1Systems Oncology Research Program, University of Helsinki, 2Department of Biochemistry and Developmental Biology, Medicum, University of Helsinki

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר מבנה פשוט המבוסס על ה-PCR כדי לנטר את הפעילות של כריכת שורות פעילה של קו 1 וכדי למפות דה נובו בגנום נתון. באמצעות קו התא MCF7, אנו מדגימים בזאת כיצד ניתן להחיל שיטה זו כדי לזהות פעילות של קו -1 ממוקם ב 22q 12.1.

תקציר

לונג בתוספת אלמנטים גרעיניים 1 (קו -1) הם המשפחה היחידה של אלמנטים גנטיים ניידים בגנום האנושי שיכול לנוע באופן עצמאי. הם עושים זאת על ידי תהליך הנקרא retroטרנספוזיציה שבו הם מתעתור כדי ליצור ביניים mRNA אשר אז מוכנס כתוצאה מכך הגנום על ידי תמלול הפוכה. למרות היותו שקט בתאים נורמליים, LINE-1s פעילים מאוד גידולים אפיתל שונים. דה נובו LINE-1 הוספות יכול פוטנציאלי לנסוע tumorigenesis, ולכן חשוב בשיטתיות לחקור את קו 1 הרטרווזיציה בסרטן. מתוך ~ 150 retroטרנספוזיציה-קו מוסמך-1s נוכח הגנום האנושי, רק קומץ של המקום קו -1, המכונה גם "חם" קו -1, חשבון עבור רוב ההכנסה קו-1 של דה נובו בסוגי סרטן שונים. פיתחנו תגובת שרשרת פולימראז פשוטה (PCR) מבוססי שיטה כדי לפקח על פעילות הרטרוטרנספוזיציה של אלה שורה חם-1s. שיטה זו, המבוססת על מרחק הפוך (LDI)-PCR, מנצלת 3 התמרה, מנגנון שדרכו קו -1 מגייס את האזור שאינו חוזר על עצמו, שניתן להשתמש בו לזיהוי אירועי התמרה של קו נובו -1 3 שמקורם בקו חם מסוים -1.

מבוא

לונג שונים אלמנטים גרעיניים (LINE-1s) הם משפחה של אלמנטים גנטיים ניידים הנקרא retrotransposons שיכולים באופן עצמאי לעבור ממקום אחד למשנהו באמצעות מנגנון העתקה והדבקה הנקרא retroטרנספוזיציה. במשך הזמן האבולוציוני, הגנום האנושי צבר יותר מ 500,000 עותקים של קו -1 חוזר על1. עם זאת, רוב העותקים קו -1 הנמצאים בגנום הם מוטציה ולכן לא יכול לעבור דרך הרטרוטרנספוזיציה; רק ~ 150 עותקים יש עותק שלם של רצף ה-DNA הדרושים להם לעבור2. בתאים סומטיים נורמליים, הניידות של השורה האלה מוגבלת על-ידי גורמים מארחים שונים3. הגבלות אלה משוחררת גידולים אפיתל שונים, גורם קו -1 כדי להיות הלחץ וכתוצאה מכך הוספות דה נובו רבים בגנום הגידול4. חלק הוספות אלה הקשורים הגידול דה נובו הוכחו לגרום insertional מוטגנזה בגנים, ולכן נהיגה התקדמות הגידול5,6. לכן, חשוב להיות מסוגל למפות הוספות רומן בגנום הגידול.

שיטות קיימות כדי לזהות הוספות דה נובו קו -1 השימוש (1) הגנום כל רצף גישה4,7,8, שבו אלגוריתמים שונים בחישוב משמשים כדי למצוא את הוספות דה נובו LINE-1 מ-wgs נתונים, או (2) רצף הדור הבא מטרות 3 הקצה של צעיר, פוטנציאלי שורה-1s9,10,11,12,13. עם זאת, מציאת הוספות הרומן בקרב כמה אלפי עותקים כמעט זהה עם שיטות אלה רחוקה טריוויאלי, ואת האתגר הוא עוד יותר מחמירות על ידי טרוגניות הגידול שינויים גנומית הקשורים קו -1 הוספת4.

מחקרים באמצעות שיטות קיימות אלה הראו כי רק כמה שורה-1s חשבון עבור רוב של דה נובו קו 1 הוספות נצפתה בגידולים7,8. לכן, כדי לענות אם מדגם גידול מסוים מציג פעילות LINE-1, זה מספיק כדי למפות את אירועי הרטרוטרנספוזיציה שנגרמו מקומץ זה של המקום הפעיל ביותר של קו 1. במאמר זה, אנו מתארים תגובת שרשרת פולימראז פשוטה (PCR) מבוססי שיטה14 כי ניתן להשתמש כדי לנטר את הפעילות של מקום מסוים קו 1 ב אינטרון הראשון של הגן TTC28 ב 22q 12.1 כי הוא פעיל מאוד בסרטן המעי הגס מיכל סבן , 8. זה לוקוס קו 1 יהיה מכונה TTC28-line-1 לאורך המאמר. הדבר מזהה במפורש את האירועים של דה נובו line-1 משנה את ההתרחשויות המונעות רצף לא חוזר על האזור הנמצא במיקום המקורי של קו 1 על ידי מנגנון הנקרא 3 התמרה15. 3 התמרה מתרחשת בשל האות החלשה קו 1 פוליאדלציה (PAS) הגורמת מכונות הטרנססקריפט לדלג על זה ובמקום זאת לסיים שעתוק על PAS חזק במורד, ובכך לכידת האגף הלא חוזרים החוצה ( מעתה ואילך המכונה "תג ייחודי") אשר מוכנס למיקום היעד לצד רצף קו -1. פיליפ ואח '16 לאחרונה הראה כי סוגי תאים שונים יכולים לבטא את המקום האחר LINE-1. לאור ממצא זה, ניתן להחיל שיטה זו כדי לפקח על הפעילות של קו -1 ביטוי ביותר המתגייס את התגית הייחודית שלהם לסוג העניין של הסרטן.

הצעד הראשון ב-LDI-PCR הוא העיכול של דנ א גנומית עם אנזים הגבלה המייצר קטע מגבלה המכיל את קו -1 להיות המאייד (כאן, TTC28-LINE-1) ואת התגית הייחודית שלה (איור 1). ה-DNA מתעכל לאחר מכן מעגליות על ידי הארכה עצמית ו-PCR מוגבר באמצעות כלים בצבעי היסוד ההופכי ממוקם בתוך תג ייחודי. על-ידי כך, המקור באורך מלא-1 במיקום "יליד" שלה הוא תמיד מוגבר ולצידו, שורה הצאצאים 1 הוספות במקום מטרה שונה המכיל את התג הייחודי יהיה גם הוגדל (איור 1), ובכך לדווח הפעילות הרטרודשנה של קו 1 המדובר.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי מועצת המחקר המוסדי וועדת האתיקה של אוניברסיטת הלסינקי החולים. אישור מידע חתום התקבל מהנושא לדגימת הדם המשמשת להמחשת פרוטוקול זה.

1. עיצוב התחל ההופכי ובחירת אנזימי הגבלה (ביואינפורמטיקה)

  1. קביעת תגית ייחודית המשויכת לקו -1
    1. הורד את הרצף TTC28-LINE-1 בתבנית fasta ממסד נתונים של קו 1 כגון L1Base17. L1base ID עבור TTC28-LINE-1 הוא 135.
    2. כולל 5 ק ג הרציף האגפים הן 5 או 3 הקצוות של הרצף קו -1 וביאורים אותו במעבד תמלילים.
      הערה: כאן רצף האגפים קו -1 מסומן בגופן חום, ורצף קו 1 נמצא בגופן אפור (קובץ משלים).
    3. הזן 1 kb רצף במורד של קו שנבחר-1's קנצוני pas לתוך כלי חיזוי PAS כגון polyadq18 או הדרקון הצופה polya19 וביאורים את כל האות polyadq בחלון זה 1 kb.
      הערה: אם אין PAS בחלון של 1 kb, חפש את PAS בחלון הבא של 1 kb במורד הזרם. TTC28-LINE-1 של משלו החלש pas מודגש בוורוד וכל PAS אחרים ב 1 kb חלון במורד מודגש באדום (קובץ משלים).
    4. ביאור את הרצף בין הקצה של השורה הראשונה של קו 1 ו-PAS החזקה ביותר "תג ייחודי".
      הערה: "התגית הייחודית" של TTC28-LINE-1 מודגשת בצהוב (קובץ משלים).
  2. עיצוב צבעי יסוד הפוכים
    1. עיצוב של ה-PCR ההופכי על ידי הזנת "תג ייחודי" רצף לתוך מבוססי אינטרנט כלי עיצוב פריימר כמו פריימר 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) או הפיצוץ פריימר של NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). כיוון שהזוגות המסיסים שעוצבו על ידי כלים אלה פונים זה לזה, מקלה על ה-PCR המקובל, השתמשו בפונקציה המשלימה את ההיפוך לצמד התחל לביצוע ה-PCR ההופכי.
      הערה: כאשר התמרה LINE-1 מעוגלים בכבדות בקצה ה -5 שלהם וגודל האזור משתנה במידה רבה, המטרה היא לשמור על המרחק בין שני הצבעי היסוד ההופכי, על-ידי הגדרת הפרמטר "אורך המוצר של ה-PCR" ב-ncbi פריימר-הפיצוץ ל ינימום. במקרה של PAS מרובים בתוך התג הייחודי, לעצב כמה זוגות פריימר המתאימות מעבר שונים. עיצוב התחל קרוב PAS, כמו קו -1 הוספות ליזום מ 3 ́end של ה-RNA ביניים ו 5 קצה זה נחתך למדי. כאן שלושה זוגות פריימר עוצבו, מודגשים בצבע ירוק, מתאים לשלושה אותות רב-אדנילציה חזקים בתג הייחודי של TTC28 LINE-1 (קובץ משלים).
  3. בחירת אנזימי הגבלה
    1. מעכלים את רצף קו -1 יחד עם ה-5 kb שלו במעלה ובמורד הזרם בסיליקו באמצעות כלי מבוסס אינטרנט כגון RestrictionMapper. זה ייתן רשימה מקיפה של אנזימים הגבלה העיכול באזור זה, יצירת שברי הגבלה שונים.
    2. בחר אנזימי הגבלה שחותכים את המקור המקורי של קו -1 כדלקמן: ב 5 הקצה, או במעלה של קו -1 ́s 5 ́end או רחוק 5 ́end של קו -1 עצמו, ו ב 3 לקצה, במורד במורד התגית הייחודית של קו -1.
      הערה: האנזים ההגבלה שנבחרה צריך להיות חסר רגישות למתתילציה DNA, צריך להיות חום-מאפשר, וליצור מסתיים "דביק" מתנדנד שמשלימים זה את זה. כדי להדגים LDI-PCR, Sacאני הגבלת אנזים שחותך DNA באתרים GAGCTC, מודגש כאן באור ירוק, משמש (קובץ משלים).
    3. שים לב לגודל קטע ההגבלה שנעשה על-ידי אנזימי הגבלה שנבחרו. הדבר אינו אמור להיות ארוך מ-12 kb מאחר שייתכן שהוא אינו מוגבר ביעילות על-ידי ה-PCR.

2. יצירת תבניות DNA מעגליות עבור ה-PCR למרחקים ארוכים

  1. חילוץ והערכת דנ א
    1. לחלץ דנ א גנומית מדגימות (גידול או דם) באמצעות מסחרית זמין ערכות DNA הפקת זה יכול לחלץ איכות טובה, משקל מולקולרי גבוה DNA הכרחי LDI-PCR על פי הוראות היצרן. לחילופין, משקל מולקולרי גבוה יכול גם להיות מופק על ידי פנול: כלורופורם20.
    2. למדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות פלואורומטר על פי הוראות היצרן, ולהפעיל 100 ng של ה-DNA על 1% (w/v) agarose ג'ל המכיל אתידיום ברומיד (0.5 μg/mL) ב 1x טריס-אצטט-EDTA (מאגר) ב 4.5 V/cm21 לצד λ-הודו DNA סמנים מולקולרית משקל לבדוק את איכות ה-DNA וכמות.
  2. לעכל דנ א גנומית
    1. לעשות תערובת התגובה לעיכול (הנפח הסופי של 50 μL) על ידי הוספת 20 יחידות שקאני הגבלה אנזים, 5 μl של מאגר התגובה 10X (טבלה של חומרים), 100 ng של DNA (עד 44 μl) ב שפופרת 0.2 משנת ה-mL של מרבית היצרנים I s מספיק כדי לעכל לחלוטין 100 ng של דנ א גנומית). ערבב את הפתרון על ידי מצליף בשפופרת, וצנטריפוגה בקצרה.
    2. השתמש ציקלer תרמית כדי לדגירה את תערובת התגובה ב 37 ° צ' עבור 1 h, ואחריו חום הפעלה ב 65 ° צ' עבור 5 דקות.
  3. ליגגאת ה-DNA של גנומית מתעכל
    1. כדי 50 μl לערבב העיכול (לאחר שלב 2.2.2), להוסיף 8 μl של 10x t4 מאגר ליגאז, 1 μl (5 יחידות) של t4 dna ליגאז ו 21 μl של מים אלקטרופורזה לבצע התגובה הסופית נפח של 80 μl. מערבבים את הפתרון על ידי מצליף הצינורות , וצנטריפוגה בקצרה.
    2. מודטה בציקלונט תרמית ב -22 ° c במשך 10 דקות, מסתיימת בשלב הפעלת חום ב-65 ° c עבור 10 דקות.

3. ה-PCR ההופכי למרחקים ארוכים

  1. קביעת תחל ריפוי טמפרטורה על ידי ה-PCR הדרגתי
    1. הגדר טמפרטורת ריפוי מדרגה של (a-4) ° c, (a-2) ° c, A, (A + 2) ° c, (a + 4) היכן היא טמפרטורת הריפוי התיאורטית של הזוג הפריימר המחושבת באמצעות כלי מבוסס האינטרנט של הספק המסחרי.
      הערה: הציקלנים התרמיים מיצרנים מסוימים עשויים שלא לאפשר קביעת הדרגתי של הטמפרטורה באופן ידני. במקרה זה, ניתן להשתמש בהגדרת מעבר הצבע האוטומטי עם טווח טמפרטורה של (A-4) ° צ' עד (A + 4) ° c.
    2. להכין תערובת מאסטר עבור ה-PCR על ידי שילוב וערבוב של הרכיבים הבאים 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת: 4 μL של מאגר התגובה 5x, 0.4 μL של 10 מ"מ dNTP, 5 μL של 2 μM PCR פריימר (קדימה ואחורה, תוכנן בשלב 1.3.1) , 0.2 μL (0.1 U) של דנ א פולימראז לכל תגובה. הגדר תגובה אחת לכל טמפרטורת הריפוי במעבר הצבע.
    3. עבור כל תגובה, סדרת מחלקים 19 μl של מיקס הורים לתוך 0.2 mL PCR צינורות ולהוסיף 1 μl (1.25 ng) של תבנית DNA מעגלית שנעשתה בסעיף 2.
      הערה: שימוש מעגלי ה-DNA ליגייתי עצמית שנוצר מן ה-dna דם נורמלי כמו תבנית כדי למנוע צריכת דנ א פוטנציאלי הגידול יקר עבור שלב זה אופטימיזציה.
    4. הפעל את תוכנית ה-PCR של מעבר הצבע בציקלייר תרמי כמתואר להלן: (i) מחזור אחד של 3 דקות ב-98 ° צ' (דנטורציה); (ii) 35 מחזורים של (10 s בשעה 98 ° צ'), 20 בטמפרטורה מעבר הצבע של [A-4] עד [4] ° c [ריפוי] ו-1-6 דקות (30) לקילו בסיס של ה-PCR הצפוי בשנת 72 ° צ' [סיומת]); (3) מחזור אחד של 10 דקות ב 72 ° צ' (סיומת סופית).
    5. הפעל 6 μL של מוצר ה-PCR ב 1% agarose ג'ל21 מוכן 1 x טה מאגר ב 4.5 V/cm ולנתח את מוצרי ה-PCR הניב בטמפרטורות ריפוי שונות.
    6. בחר את טמפרטורת הריפוי המניבה מוצר PCR המתאים לגודל הצפוי.
  2. זיהוי הפעילות הרטרוד1 של קו נובו בגנום הגידול
    1. בצע את LDI-PCR באמצעות זוג ה-PCR ההופכי לתבניות DNA מעגליות שנוצרו מדגימות גידול (סעיף 2). בצע את אותן הוראות לגבי ה-PCR מעבר הצבע (סעיף 3.1), אך הפעם מחליף את מעבר הטמפרטורה בטמפרטורת הריפוי המיטבית.
    2. לנתח את מוצרי ה-PCR על ידי האגג ג ג'ל כפי שנעשה בשלב 3.1.5. מוצר ה-PCR של הגודל הידוע או המוצר "הטבעי" התואם לקו -1 במקום המקורי שלו צריך להיות גלוי לכל תגובה. דה נובו קו-1 3 התמרה את החפירה לדגימת הגידול מזהה כמוצרי PCR בגדלים שונים, יחד עם מוצר ה-PCR היליד ג'ל agarose.

4. רצף מוצרי LDI-PCR כדי לחשוף את זהותו של אתרי היעד עבור התמרה LINE-1 3

  1. בצע רצף מולקולה חד-ממדי לקריאה ארוכה של כל התוספות ה-PCR שנוצרו בכל תגובת LDI-PCR כדי לזהות את אתרי האינטגרציה של היעד של האירועים האלה של קו-1 3.
    הערה: רצף שיבוט ו-Sanger של מוצרי LDI-PCR הוא גם הגישה האפשרית, אם כי מסורבלת.
  2. יישר את הקריאות המופק על-ידי מולקולה יחידה לקריאה בפלטפורמות רצף לגנום הייחוס באמצעות צינורות של יישור רצף סטנדרטי. נתח את הקריאות המיושרות באמצעות התוכנה LDI-PCR14 כדי לזהות הוספות קו-1 של דה נובו ואתרי היעד שלה.

תוצאות

במקרה של TTC28-LINE-1, יש יותר מאחד PAS בתוך חלון 1 kb במורד pas קנצוני שלה, ומכאן האזור בין TTC28-LINE-1 pas והחזק pas ב 811 bp במורד נחשב תג ייחודי עבור TTC28-LINE-1. שלושה זוגות הופכי לפריימר ה-PCR עוצבו בתג ייחודי זה המתאים למעבר שונה14. בחרנו שלושה אנזימים הגבלה: (אני) Nsii כי חותך 5 במעלה הזרם של TTC28-LINE -1 ו 3 זה מחוץ לתג ייחודי, ו (ii) שקאני ו (iii) Pstאני זה לחתוך 5 בתוך קו -1 בקצה המרוחק שלה 5, ו 3 מחוץ לתג ייחודי. אלה ליצור שברי הגבלה של 10,288 bp, 5,699 bp, ו 6,305 bp בהתאמה.

על מנת להדגים את השיטה, ביצעו LDI-PCR ב-DNA שחולצו MCF7 line. זה שורה תא של סרטן השד נמסר בעבר כדי להציג TTC28-line-1 פעילות16. עבור פשטות, עשינו תבנית DNA מעגלית באמצעות אנזים הגבלה אחת, שקאני, מתוך שלוש וביצע ldi-PCR באמצעות זוג אחד פריימר מתוך שלושה (שולחן 1) כדי לזהות הוספות דה נובו קו -1 הנובע TTC28- . קו -1

איכות טובה של ה-DNA מופק מקו התא MCF7 הבטיחו על ידי אלקטרופורזה ג'ל ג ' אז (איור 2). דנ א שלם במשקל מולקולרי גבוה מראה כי ה-DNA גנומית היא באיכות אופטימלית עבור הצורך הזה. אם הכתם גלוי במקום, זה מעיד על איכות ירודה של ה-DNA שחולצו, אשר בתורו יהיה לעכב את הליכי המטה.

איור 3 מציג תוצאה מייצגת של ניסוי ה-PCR של מעבר הצבע, שמטרתו לקבוע את טמפרטורת הריפוי האופטימלית של צמד הTTC28-LINE-1 ההופכי. DNA דם גנומית מתעכל עם שקאני, ואחריו באמצעות הארכה עצמית כדי ליצור תבנית DNA מעגלית, שימש לתגובה זו. מוצר ה-PCR הספציפי ביותר של הגודל הצפוי (5,649 bp) בשעה 62, 64 ו-66 ° צ' מראה כי טמפרטורת הריפוי האופטימלית לזוג זה נמצאת בטווח של 62 עד 66 ° c.

יצרנו תבנית DNA מעגלית על ידי עיכול MCF7 גנומית של דנ א עם שקאני הגבלה אנזים ואחריו הקשר העצמי. איור 4 מראה כי TTC28-LINE-1 3 התמרה מתרחשת בקווי MCF7 תאים: דה נובו הוספות ניתן לזהות כמוצרי ldi-PCR בגדלים שונים יחד עם מוצר ה-pcr היליד של גודל ידוע (5,649 bp). כדי לזהות קואורדינטות גנומית של אתרי היעד של דה נובו , ניתן לרצף את היכולות PCR (ראה פרוטוקול 4).

דיאגרמת תהליך עריכת גנים עם תקציר, ליגייט, PCR; מציג מיפוי מיקומים ותבניות DNA מעגליות.
איור 1 : סקירה של LDI-PCR כדי לזהות קו-1 3 התמרה. תבנית DNA מעגלית נוצרת על ידי העיכול הראשון (I) זה עם אנזים הגבלה וליגטינג עצמית (II) זה. שלב זה מלווה ב-PCR הופכי (III) עם הצבע הראשון של ה-PCR המיועד לתגית הייחודית של קו -1 הריבית (רצף בין ה-PAS החלשים של קו -1, בוורוד ובמורד הזרם, באדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ג'ל אלקטרופורזה של DNA, הפרדת gDNA, MCF7, דם, סמן מולקולרי, דפוס נדידת kb.
איור 2 : הערכת איכות של דנ א מופק. 100 ng של דנ א שחולצו מן קו התא MCF7 דם מאדם רגיל, אשר ישמשו כמדגם שליטה, היו לרוץ לצד 1 μL ו 2 μL של λ DNA/HindIII סמן מתויג כמו M. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים אלקטרופורזה של ג'ל PCR; דפוס רצועת DNA בטמפרטורות חישול משתנות; 5 KB, סמני 7 KB.
איור 3 : ה-pcr הדרגתי כדי לקבוע את טמפרטורת הריפוי המיטבית לצבעי ה-pcr ההופכי (טבלה 1). LDI-PCR תוך שימוש בצמדים הפוכים בטמפרטורת הריפוי החל מ-56 ועד 66 ° c מראה מוצר PCR ברור ב-62 עד 66 ° c. החץ הירוק מציין את טמפרטורת הריפוי הנבחרת לניסויים עתידיים. תבנית ה-DNA מעגלית שנוצר על ידי עיכול ה-DNA דם גנומית מאדם רגיל עם שקאני ולאחר מכן השימוש העצמי שימש לשלב זה אופטימיזציה. M, סמן (1 kb ועוד סולם DNA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאת אלקטרופורזה; הפרדת רצועת DNA, נתיבי ג'ל M, MCF7, דם ו-H<sub>2</sub>O.
איור 4 : Ldi-PCR כדי לזהות קו-1 3 התמרה מתוך הנובע TTC28 . שורה 1 תבניות DNA מעגליות שנוצרו על ידי עיכול MCF7 ודם (מן הפרט הרגיל) DNA גנומית עם שקאני בעקבות הקשר העצמי היו מוגבר על ידי התחל ההופכי בטמפרטורת ריפוי אופטימלית. "יליד" ה-PCR מוצר, מסומן עם כוכבית, של גודל צפוי (5,649 bp) זוהה הן MCF7 DNA ו-DNA דם נורמלי, בעוד MCF7 גם הפיק מוצרים PCR נוספים בגדלים שונים, המציין דה נובו קו 1 הרטרווזיציה. M, סמן (1 kb סולם DNA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שם תחלרצף (5 למעלה → 3)
L1_001 (rev)היכל האוויר
L1_002 (fwd)לינה והסקה

טבלה 1: צמד ה-PCR ההופכי המיועד לתג ייחודי של TTC28 -קו -1 מיכל בן 14 .

קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

כאן אנו מתארים שיטה שבה ניתן להשתמש כדי לזהות הוספות דה נובו line-1 הנובעים כל שורה פעילה 1 של ריבית. יש לנו אופטימיזציה שיטה זו עבור קו פעיל מאוד-1, ממוקם ב 22q 12.1, ובעבר הוכיחה את זה להיות רגיש מאוד בזיהוי הוספות תת שבטיים בסרטן המעי הגס14.

ההצלחה של LDI-PCR תלוי באיכות של דנ א גנומית. לכן, כללנו צעד נוסף בקרת איכות כדי להבטיח כי בתחילת הפרוטוקול, משקל מולקולרי גבוהה DNA הוא קיים (שלב 2.1.2). אנו ממליצים לאחסן DNA גנומית ב-20 ° c עבור אחסון לטווח ארוך, וכדי להכין את האליבטים כדי למנוע מחזורים של הקפאה והפשרה. באמצעות דנ א גנומית של דם או החולה בהתאמה לרקמות נורמלי מומלץ מאוד להבחין אם שורה 1 הרטרווזיציה זיהה הוא germline או אירוע סומאטיק. מאז לחתוך אתרים עבור אנזימים הגבלה הם סטוכסטי בגנום, ייתכן כי אתר מסוים הכניסה מסוימים דה נובו קו -1 עשוי לא לעגן כל האתרים לחתוך את האנזים ההגבלה לשמש בסביבתו. מכאן כדי להגדיל את הסבירות לזהות את רוב הוספות דה נובו LINE-1 ב-DNA הגידול, יותר מאשר אנזים הגבלה אחת יש להשתמש בתגובות נפרדות כדי ליצור ספריות שונות של תבנית DNA מעגלית. יתר על כן, אם התגית הייחודית של קו -1 של ריבית יש יותר מאשר PAS אחד, ולאחר מכן שימוש זוגות פריימר הסמוכים כל PAS משפר את הסיכויים לזהות הפרשות מקוצר בכבדות.

למרות שיטות אלגנטיות לזיהוי הגנום כולו של הוספות דה נובו קו 1 קיימים, הם יכולים להיות מכריע אם המטרה היא לחקור את היכולת הרטרוספיוזיציה של קו 1 מסוים בהקשר הסלולר הספציפי. למטרה זו, LDI-PCR יכול להיות גישה זולה ופשוטה אך איתנה כדי להמחיש את האירועים LINE-1 הרטרוציציציה. הגישה המכוונת המשמשת בשיטה זו דומה ל-TS-אטלס22; עם זאת, LDI-PCR מתחמק משימוש באמצעות מקשר והוא יכול להגביר את שני הצמתים של הכניסה של דה נובו קו 1 בו זמנית. מידע בנוגע הן 5 או 3 צמתים של הכניסה LINE-1, אתר היעד של אינטגרציה, הזנב polyA ושינויים באתר היעד, כולם הם הסימנים ההיכר של קו 1 הרטרושיציה, ניתן להשיג על ידי צימוד LDI-PCR עם מולקולה אחת טכנולוגיות לקריאה ארוכת טווח. קריאות ארוכות שנוצרות כך מכילות את רצף קו -1 שהוכנס, את התג הייחודי ואת רצפי היעד בקריאה אחת בודדת, המתקשים במיפוי קריאות קצרות באזור החוזר.

קיימות שתי מגבלות עיקריות המשתמשות ב-LDI-PCR לאיתור פעילות LINE-1. הראשון הוא הפנימי של ה-PCR: זה יכול רק להגביר באופן אמין שברים עד 10 kb בגודל. יש לשקול זאת בעת בחירה באנזים הגבלה, מאחר שהשבר המקורי לא יעלה על מגבלה זו. שנית, שיטה זו יכולה רק לזהות את אירועי הרטרוטרנספוזיציה הניוד של האזור השני של שלושה מאגפים באמצעות 3 התמרה. מכאן, הפעילות של אלה שורה 1 שאינם מציגים 3 התמרה המצב לא יזוהו באמצעות שיטה זו. בנוסף, למרות היותו מוגבר על ידי LDI-PCR, כמה אירועים שורה 1 הרטרוליציה כי (א) ליצור מטרה PCR בגודל דומה כמו מיקום "יליד" או הנחות אחרות או (ב) הם נדירים או תת שבטיים, לא ניתן לזהות על ידי agarose ג'ל אלקטרופורזה. כזה שורה 1 אירועים הרטרוטציה ניתן ללכוד על ידי רצף מוצר LDI-PCR באמצעות מולקולה בודדת לקריאה ברצף טכנולוגיות14.

זרימת העבודה המתוארת כאן יכולה להיות שונה בקלות כדי לזהות את הפעילות של "חם" LINE-1s על-ידי שימוש באנזים הגבלה מתאים על-ידי תכנון התחל ההופכי מיקוד קו 1s. בנוסף לזיהוי קו -1 בתיווך 3 התמרה, שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לזהות פחות השכיחות של קו -1 מתווך 5 התמרה23. שיטה דומה שימשו כדי לזהות את אתר האינטגרציה של כתבים LINE-1 בתוך תא מבוסס על24 ו הספק אתרי אינטגרציה בסרטן25. מלבד LINE-1 הוספות, שיטה זו יכולה גם להיות מנוצל כדי לזהות סטיות גנוסטיות אחרות, כגון הסדרים מחדש DNA, שבו מידע על האזור מועדים מראש שכבר קיים26.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

היינו רוצים להודות לכל העמיתים שלנו במאמר שבו שיטה זו תוארה לראשונה14, במיוחד טטיאנה Cajuso, Kimmo פיילין, אוטי Kilpivaara ו-Esa Pitkänen לדיונים יקרי ערך בעת פיתוח השיטה. L.K. ממומנת על ידי האקדמיה של פינלנד (להעניק מספרים 25996, 292789, 306026 ו 314394), קרן Juselius Sigrid, והאגודה הפינית לסרטן. לחץ דם הוא הנמען של אוניברסיטת הלסינקי הקרן מחקר האגודה שלנו, מענק האגודה לסרטן החברה הפינית, ומענק מחקר דוקטורט מאידה מונטיטין זאקטיסי. אנחנו גם מודים Teemu Masalin (אוניברסיטת הלסינקי) ו קול Shrestha מקבוצת המחקר של L.K. לסייע לנו עם הפקת וידאו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 Kb סולם DNAניו אינגלנד BiolabsN3232L
10 מ"מ dNTPThermoFisher Scientific18427013
חומצה אצטיתThermoFisher Scientific64-19-7משמש להכנת מאגר TAE
AgaroseBioNordikaBN-50004
דגימת דם (קפואה)דגימת דם מאדם בריא לבקרה PCR
ChemiDoc XRS+ SystemBio-rad1708265
DNA צבע לטעינת ג'ל (6X)ThermoFisher ScientificR0611
DNeasy Blood & ערכות רקמותQiagen69504
Ethidium BromideBio-rad161-0433
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)ThermoFisher Scientific25102-12-9משמש לייצור מאגר TAE
FastDigest BufferThermoFisher ScientificB64
FastDigest SacIThermoFisher ScientificFD1133
Generuler 1 Kb פלוס סולם DNAThermoFisher ScientificSM1331
Generuler Lambda DNA/HindIII סמן, 2ThermoFisher ScientificSM0103
Mini-Sub  תא GT תאביו-ראד1704406
Phusion Green Hot Start II נאמנות גבוהה DNA פולימראזThermoFisher ScientificF537L
PowerPac ספק כוח בסיסיBio-rad1645050
קוואנטוס פלואורומטרPromegaE6150
T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificEL0011
Tear-A-Way 96/8, 96 ובכן PCR צלחת4titude4ti-0750/TA
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneThermoFisher Scientific77-86-1משמש לייצור מאגר TAE
Veriti Thermal CyclerApplied Bioscience4375786

מקורות

  1. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  2. Brouha, B., et al. Hot LINE-1s account for the bulk of retrotransposition in the human population. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (9), 5280-5285 (2003).
  3. Goodier, J. L. Restricting retrotransposons: a review. Mobile DNA. 7, 16(2016).
  4. Lee, E., et al. Landscape of somatic retrotransposition in human cancers. Science. 337 (6097), 967-971 (2012).
  5. Miki, Y., et al. Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of L1 sequence in a colon cancer. Cancer Research. 52 (3), 643-645 (1992).
  6. Scott, E. C., et al. A hot L1 retrotransposon evades somatic repression and initiates human colorectal cancer. Genome Research. 26 (6), 745-755 (2016).
  7. Pitkanen, E., et al. Frequent L1 retrotranspositions originating from TTC28 in colorectal cancer. Oncotarget. 5 (3), 853-859 (2014).
  8. Tubio, J. M., et al. Mobile DNA in cancer. Extensive transduction of nonrepetitive DNA mediated by L1 retrotransposition in cancer genomes. Science. 345 (6196), 1251343(2014).
  9. Badge, R. M., Alisch, R. S., Moran, J. V. ATLAS: a system to selectively identify human-specific L1 insertions. American Journal of Human Genetics. 72 (4), 823-838 (2003).
  10. Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Medicine. 21 (9), 1060-1064 (2015).
  11. Ewing, A. D., Kazazian, H. H. Jr High-throughput sequencing reveals extensive variation in human-specific L1 content in individual human genomes. Genome Research. 20 (9), 1262-1270 (2010).
  12. Sanchez-Luque, F. J., Richardson, S. R., Faulkner, G. J. Retrotransposon Capture Sequencing (RC-Seq): A Targeted, High-Throughput Approach to Resolve Somatic L1 Retrotransposition in Humans. Methods in Molecular Biology. 1400, 47-77 (2016).
  13. Zhao, B., et al. Somatic LINE-1 retrotransposition in cortical neurons and non-brain tissues of Rett patients and healthy individuals. PLOS Genetics. 15 (4), e1008043(2019).
  14. Pradhan, B., et al. Detection of subclonal L1 transductions in colorectal cancer by long-distance inverse-PCR and Nanopore sequencing. Scientific Reports. 7 (1), 14521(2017).
  15. Moran, J. V., DeBerardinis, R. J., Kazazian, H. H. Jr Exon shuffling by L1 retrotransposition. Science. 283 (5407), 1530-1534 (1999).
  16. Philippe, C., et al. Activation of individual L1 retrotransposon instances is restricted to cell-type dependent permissive loci. Elife. 5, (2016).
  17. Penzkofer, T., et al. L1Base 2: more retrotransposition-active LINE-1s, more mammalian genomes. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D68-D73 (2017).
  18. Tabaska, J. E., Zhang, M. Q. Detection of polyadenylation signals in human DNA sequences. Gene. 231 (1-2), 77-86 (1999).
  19. Kalkatawi, M., et al. Dragon PolyA Spotter: predictor of poly(A) motifs within human genomic DNA sequences. Bioinformatics. 29 (11), 1484(2013).
  20. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
  22. Macfarlane, C. M., et al. Transduction-specific ATLAS reveals a cohort of highly active L1 retrotransposons in human populations. Human Mutation. 34 (7), 974-985 (2013).
  23. Beck, C. R., Garcia-Perez, J. L., Badge, R. M., Moran, J. V. LINE-1 elements in structural variation and disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 187-215 (2011).
  24. Morrish, T. A., et al. DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition. Nature Genetics. 31 (2), 159-165 (2002).
  25. Li, J., et al. Leukaemia disease genes: large-scale cloning and pathway predictions. Nature Genetics. 23 (3), 348-353 (1999).
  26. Pradhan, B., et al. Detection and screening of chromosomal rearrangements in uterine leiomyomas by long-distance inverse PCR. Genes, Chromosomes and Cancer. 55 (3), 215-226 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LINE 1TTC28 LINE 1DNADNA

מאמרים קשורים