הרומן ניקולט שיטת תיקון Dinucleotide עבור Ca תאיים2 + מדידה עם fura-2-אנלוגי בתאים חיים

Jeong Hoon Lee; Jeong Mi Ha; Quynh Mai Ho; Chae Hun Leem

doi:10.3791/59881

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הרומן ניקולט שיטת תיקון Dinucleotide עבור Ca תאיים^{2 +} מדידה עם fura-2-אנלוגי בתאים חיים

5.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59881

⸱

20 בספטמבר 2019

Jeong Hoon Lee¹ , Jeong Mi Ha¹ , Quynh Mai Ho¹ , Chae Hun Leem¹^,²^,³

¹Department of Physiology, University of Ulsan College of Medicine/Asan Medical Center, ²Asan Medical Center, ³Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology

במאמר זה

סיכום

בשל החפיפה הספקטרלית של עירור ואורכי גל הפליטה של NADH וfura-2 אנלוגיות, הפרעות האות משני הכימיקלים בתאים חיים הוא בלתי נמנע במהלך המדידה הכמותית של [Ca^{2 +}]. לפיכך, שיטת התיקון המקוונת הרומן של הפרעה באות NADH למדידה [Ca^{2 +}] פותחה.

תקציר

כדי למדוד [Ca 2 +] כמותית, fura-2 אנלוגיים, אשר משמשים לעתים קרובות משתמשים^בשתישדות פלואורומטרים. עם זאת, השימוש בצבע הוא מוגבל בתאים חיים בגלל הפרעה פלואורסצנטית אוטומטי, בעיקר מפני הפרעות מסוימות (NADH). באופן ספציפי יותר, זהו מכשול גדול כאשר מדידת מיטוכונדריאלי [Ca^{2 +}] ככמת באמצעות fura-2 האנלוגיים כי רוב הרוב של nadh הוא המיטו,. אם הריכוז צבע פלורסנט זהה, עוצמת עירור מסוים צריך לייצר את עוצמת הפליטה זהה. לכן, יחס עוצמת הפליטה של שני אורכי גל עירור שונים צריך להיות קבוע. מבוסס על עיקרון זה, שיטת תיקון מקוון הרומן של הפרעה האות NADH הפרעות למדוד [Ca^{2 +}] פותחה, ואת עוצמת האות האמיתית של nadh ו fura-2 ניתן להשיג. עוד, משוואה הרומן לחשב [Ca^{2 +}] פותחה עם עירור isosbestic או עירור ב 400 nm. עם שיטה זו, שינויים מיטוכונדריאלי [Ca^{2 +}] יכול להיות נמדד בהצלחה. בנוסף, עם קבוצה שונה של העירור ואת אורכי הגל, פרמטרים מרובים, כולל NADH, [Ca^{2 +}], ו-pH או הממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאל (ענבל_m), ניתן למדוד בו. מיטוכונדריאלי [Ca^{2 +}] ו ענבל_m או pH נמדדו באמצעות fura-2-FF ו טטרמתירומתיל אתיל אסתר (tmre) או קרבוקטרוקסי-סמיטואפאפופלויור-1 (קרבוXY-סנאפ -1).

מבוא

התפקיד המשמעותי של הרשות התאיים^{2 +} מוכר באופן נרחב¹. הקוונפיקציה של [Ca^{2 +}] חיוני כדי להבין את התהליכים של פונקציות פיזיולוגיות הסלולר. האנלוגית fura-2 הם שימושיים למדי משום שהם נרגשים בטווח UV (< 400 ננומטר), ואת השיטה הטימטרית ניתן להחיל על המדידה הכמותית. לכן, פרמטרים פיזיולוגיים אחרים כגון pH, פוטנציאל הממברנה, וכו ', ניתן למדוד עם צבעי פלורסנט אחרים. Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} ריכוז ([Ca^{2 +}]_m) היה הדיווחים 0.08-20 μm²^,³^,⁴^,⁵. בין fura-2 אנלוגיות, fura-2-FF מתאים למדידת טווח זה של [Ca^{2 +}]. עם זאת, התאים החיים למרבה הצער מכילים NADH/NADH עבור תהליכי חילוף החומרים שלהם, ו-NADH יוצר הפרעות האות בגלל העירור החופף וספקטרום הפליטה עם האנלוגי fura-2. הפרעה זו מגבילה מאוד את השימוש באנלוגיות של fura-2. במיוחד, אם האנלוגי מוחל על מדידת מיטוכונדריאלי [Ca^{2 +}], הפרעה זו היא המכשול הגדול ביותר, כי הסכום הגבוה ביותר של nadh הוא במיטו,. זה מסובך עוד יותר על ידי שינויים nadh להיות קשור הפוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ענבל_m) ושינוי של ענבל_m משפיע [Ca^{2 +}]_m⁶^,⁷^,⁸ ^, ⁹. יתר על כן, עבור לימוד [Ca^{2 +}]_m דינמיקה, חיוני לדעת את מעמדם של פרמטרים מיטוכונדריאלי אחרים, כגון nadh, ענבל_m, ו-pH.

פליטות ב 450 ננומטר ו 500 nm עם ההתרגשות ב 353 nm, 361 nm, ו-400 nm מכילים את האותות מ-NADH ו-fura-2-FF, והמשוואות הן כדלקמן. בזאת, 353 nm ו 361 nm הם נקודות isosbestic של fura-2-FF עבור פליטות ב 450 nm ו ב 500 nm, בהתאמה.

F_361,450 = f_{361450, nadh} + F_{361450, משוואת פרא} 1
F_353,500 = f_{353500, nadh} + F_{353500, משוואת פרא} 2
F_400,500 = f_{400500, nadh} + F_{400500, משוואת פרא} 3

כאשר F_{x, y} היא עוצמת הפליטה הנמדדת ב-y-nm על-ידי עירור ה-x-Nm, f_{x, y, nadh} מייצגת את עוצמת הפליטה הטהורה התלוית התלות, ו-f_{x, y, fura} מייצגת את עוצמת הפליטה הטהורה של fura-2-FF. תחת הריכוז זהה של צבע פלורסנט, אינטנסיביות עירור מסוים צריך לייצר את עוצמת פליטה זהה. לכן, יחס עוצמת הפליטה של שני אורכי גל עירור שונים צריך להיות קבוע. Ca^{2 +} ו fura-2 לא השפיעו על מאפייני הזריחה של nadh; לכן, את היחס של הפליטה ב 450 ננומטר ו ב 500 ננומטר של NADH היה קבוע באורך גל כל עירור. אותו כלל ניתן להשתמש עבור fura-2-FF מבוסס על ההנחה כי NADH או [Ca^{2 +}] אינו משפיע על הפליטה ואת מהווה ספקטרום של fura-2-ff. עם זאת, Ca^{2 +} גרם שינוי ספקטרלי של הפליטה fura-2-FF. לכן, כדי להסיר את ההשפעה של Ca^{2 +}, הריגוש isosbestic אשר אינו תלוי ca^{2 +}, צריך להיות בשימוש. כל אורך הגל (כלומר, 450 nm ו 500 ננומטר) יש נקודה isosbestic ומתוך ההתקנה הניסיונית שלנו, 353 nm ב 500 nm ו-361 nm ב 450 nm נבחרו. מאלה, המשוואות הבאות תקפים¹⁰.

R_f = f_{361450, fura}/F_{353500, משוואת fura} 4
R_N1 = F_{400500, nadh}/F_{361450, משוואת נדיה} 5
R_N2 = F_{353500, nadh}/F_{361450, משוואת נדיה} 6

עם קבועים אלה, המשוואות הבאות מ (משוואה 1) (משוואה 2) ו (משוואה 3) הן חוקיות.

F_361,450 = f_{361450, nadh} + R_F × f_{353500, משוואת fura} 7
F_353,450 = R_N2 × f_{361450, nadh} + f_{353500, משוואת fura} 8
F_400,500 = R_N1 × f_{361450, nadh} + f_{400500, משוואת fura} 9

ממשוואות אלה, אם R_f, r_N1ו-r_N2 ידועים, אותות טהורים של nadh ו fura-2 ניתן להשיג כדלקמן.

F_{361450, NADH} = (F_361,450 -R_f × f_353,500)/(1-r_f × r_N2) משוואה 10
F_{353500, Fura} = (r_N2 × f_361,450 -f_353,500)/(r_F × r_N2 -1) משוואה 11
F_{400500, Fura} = F_400,500 -R_N1 × f_{361450, משוואת נדיה} 12
R_fura = F_{353500, fura}/F_{400500, משוואת fura} 13

Ca^{2 +}הטופס מאוגד של fura-2-FF היה כמעט לא פלורסנט ב 400 הריגוש ננומטר גל. בהתבסס על מאפיין זה, ניתן לגזור את משוואת הכיול החדשה הבאה.

[Ca^{2 +}] = K_d∙ (F_{400500, max}/f_{353500, מקסימום}) × (R_fura-r_דקות) משוואה 14

כאשר K_d הוא קבוע הדיסוציאציה,_{f 400500, Max} ו_{-f 353500, max} הם הערכים המרביים של האותות הנפלטים ב 500 ננומטר עם ההתרגשות ב 400 nm ו 353 Nm, בהתאמה, ו r_דקות הוא מינימום r_fura ב Ca^{2 +}-תנאי פנוי. מאחר שנעשה שימוש בהתרגשות, המשוואה יכולה להיות פשוטה יותר כדלקמן.

[Ca^{2 +}] = K_d∙ (1/R_דקות) ∙ (R_fura-r_דקות) משוואה 15

לכן, רק ערכי K ו_- R_{מינימום} נדרשים לחישוב [Ca^{2 +}].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים מקומיים וועדת השימוש.

1. הכנת התמיסה

הכינו מיציטים חד-לבבית.
הערה: כל מעבדה עשויה להיות בעלת פתרון אחסון תאים שונה. כאן, המיציטים מאוחסנים במדיום התרבותי (DMEM).
הכן 100 mL של Ca^{2 +}-פתרון חינם (שולחן 1).
הכן 50 mL של מדיום התרבות בגביע 50 mL. . ושים אותו באמבט מים ב-37 ° c שמור את הפתרון הנותר בטמפרטורת החדר.
להכין 50 mL של הפתרון סאפונין על ידי הוספת 5 מ ג סאפונין כדי 50 mL של Ca^{2 +}-פתרון חינם.
הערה: Saponin משמש לחלחל מיאלוציטים לב, כדי להסיר תאי ציטוסולג, ולדמיין את הזריחה המידריתית בלבד.
הכן 16 μL של 1 מ"מ fura-2-FF-AM מומס diמתיל סולפוקסיד (DMSO).
הערה: הפוך פתרון מניות 1 מ"מ של fura-2-FF-AM מומס dmso ו סדרת מחלקים 16 μl בשפופרת 2 מ ל. אחסן אותם ב-20 ° צ' עד השימוש.
הכינו 50 mL של NADH-free Ca^{2 +}פתרון חינם (שולחן 1) ו 50 מ ל של Nadh-חינם ca^{2 +}פתרון רווי (שולחן 1) כאשר נקודות isosbestic יש למדוד. להתאים את ה-pH ל 7.0 עם KOH.
הערה: NADH-free Ca^{2 +}-פתרון חינם (שולחן 1) מכיל 10 μm fccp ו-100 μm ADP ללא כל מצעים מיטוכונדריאלי כדי למזער את nadh ב המיטואום.
הכינו 50 ml של Ca^{2 +}פתרון חינם, 50 ml של פתרון ארמיטה, 50 ml של פתרון פירובט, 50 ml של פתרון ארמיטה-פירובט, ו 50 ml של הפתרון rotenone לשמש מדידות גורם תיקון nadh (שולחן 1).

2. fluoroprobe העמסה ההליך לתוך המיטו,

הכינו את פתרון טעינת הצבע על ידי הוספת 2 מ ל של מדיום התרבות עד 16 μL של 1 מ"מ fura-2-FF-אם.
הערה: צבע פלורסנט הוא שברירי מתחת לאור. הכן את הפתרון בדיוק לפני השימוש. שמור את הפתרון המכיל את צבע הפלורסנט במקום חשוך. הריכוז הסופי של fura-2-FF-AM הוא 8 μM. אם נעשה שימוש בקרבוקסיב-1, הכן את פתרון טעינת הצבע עם 2 מטרים בקרבוקסירוקסי-סנאפ -1.
קח 2 מ ל של תאים מבודדים ומקום במבחנה 5 מ ל במצב זקוף.
חכו 15 דקות כדי שהציטים שלי. ישקע לתחתית ותסיר את הסופרנטאנט
הערה: הסופרנטאנט עשוי להכיל פסולת תא. אל צנטריפוגה את הצינור כדי למנוע נזק לתאים.
הוסף 2 מ ל של פתרון טעינת הצבע.
מודיית את פתרון טעינת הצבע עם תאים עבור 60 דקות ב-4 ° c.
ואז, לשים את המבחנה באמבטיה מים 37 ° c עבור 30 דקות במצב זקוף.
הסר את הסופרנטאנט, והוסף 4 מ ל של מדיום התרבות הקדם-שחומם של 37 ° c. מודיית את התאים עבור 60 דקות באמבטיה 37 ° c המים.
לבסוף, להסיר את הסופרנטאנט, להוסיף 4 מ ל של מדיום התרבות בטמפרטורת החדר ולשמור את הצינור בטמפרטורת החדר.

3. מבוא למערכת המדידה הרב-פרמטרית

הערה: איור 1 מציג דיאגרמה של המערכת כולה.

עבור מקור האור עירור, השתמש monochromator מהיר (polychrome II) שיכול לשנות את האור בתוך 3 ms.
השתמש בעדשה טבילה שמן (40x, NA 1.3) עם מיקרוסקופ הפוך כדי להגדיל את עוצמת האות.
השתמש במסנן כמעט אינפרא-אדום ובמצלמת התקן מצמידים (CCD) כדי לפקח על שדה האובייקט ללא הפרעה של אותות פלורסנט.
לכוד את תמונת שדה האובייקט כדי לקבל את האזור.
כוונן את שדה האובייקט במסך הצג עם דיאפרגמה של שדה רק כדי להציג את התא להפחתת הרקע.
השתמש בארבעה צינורות פוטופוטיפלייר עם כל מסנן פס-לעבור (450, 500, 590, ו 640 nm) כדי לזהות אורכי גל פליטה עם שיטת ספירת פוטון. השתמש במראות הדיקרואיק המתאימות לפיצול ולניתוב מחדש של אור הפליטה.
הערה: האור עירור חזק מאוד בהשוואה לאור הפליטה. לפיכך, בחר במסנן הרצועות עם המאפיינים החוסמים הגבוהים ביותר כדי להקטין את הרקע. מערכת ספירת פוטון כוללת שילוב של PMTs, יחידות מונה פוטון, ומונה במהירות גבוהה. כדי לשלוט במערכת ולדגום את הנתונים, נעשה שימוש בתוכנת הנהיגה שנעשתה בהתאמה אישית. יש צורך למצוא דרך להחיל שיטה זו עם מערכות אחרות.

4. שיטות תיקון של NADH עם מערכת מדידה רב-פרמטרית

זיהוי של נקודות isosbestic של Fura-2-FF באתרו.
הערה: דיווחים רבים הצהירו כי מאפייני פלורסנט משתנים בתאים. לכן, בצע את כל ההליכים כדי לקבל את הפרמטרים כדי לתקן את ההפרעה באתרו.
1. הר את התא טעון על המיקרוסקופ ולחכות 3 דקות להטביע את התאים לתחתית.
  הערה: התאם מספרי תאים כדי לראות סביב תא אחד לכל שדה יעד אחד עם עדשת היעד 40x.
2. מבשם NADH-free Ca^{2 +}-פתרון חינם ב 37 ° c.
3. לאחר תא מיקוד, למדוד את הרקע ללא תא ואת שטח התא כפי שמוצג בסעיף 4.1. חשב את רקע התא מאזור התא.
  הערה: יש לתקן את שני אותות הרקע בכל ניסוי.
4. מבשם את הפתרון סאפונין עבור 60 s ולחזור ל-nadh חינם Ca^{2 +}-חינם הפתרון.
5. למדוד Fura-2-FF-פולט אותות ב 450 ננומטר ו 500 ננומטר בו זמנית על ידי סריקת עירור מ 350 nm כדי 365 nm עם 0.1 הצעד nm בשנת.
6. מבשם NADH-free Ca^{2 +}פתרון רווי וחזור על 4.2.5 שלב.
7. הפחת את האותות בתמיסה של Ca^{2 +}רוויה מתוך האותות בתנאים של ca^{2 +}-free.
8. חזרו על ההליכים מ4.2.2. ל4.2.7 עם תאי-לב בודדים אחרים
  הערה: אם עוצמת האות נחלשת, חזור מ4.2.1. חזור על ההליך עבור, לפחות, 5 תאים שונים.
9. מכל האותות שהושגו, לחשב את הסטיות הסטנדרטיות של הפליטה בכל עירור ולבחור את אורך הגל מראה את סטיית התקן המינימלית (SD) ערך כנקודת isosbestic.
  הערה: נתוני הנציג מוצגים באיור 2.
זיהוי אותות הרקע ושיטות התיקון באזור התאים
הערה: קיימים שני סוגים של הרקעים. אחד בא מן התאים והשני מגיע השתקפות על מכסה המכסה (הרקע ללא תא). יש לתקן את שני הרקעים בכל ניסוי.
1. הר את התאים ללא צבע באמבט על המיקרוסקופ ולחכות 3 דקות להטביע את התאים לתחתית. מבשם NADH-free Ca^{2 +}-פתרון חינם עבור כ 5 דקות.
  הערה: שיעור הפרזיה של הפתרון הוא 2-3 mL/min ב-37 ° c.
  הערה: התאם מספרי תאים כדי לראות סביב תא אחד לכל שדה יעד אחד עם עדשת היעד 40x.
2. הגדר את שדה האובייקט כך שיכסה את התא המיועד.
3. לאחר הזזת התא אל מחוץ לשדה, למדוד את אותות הרקע של החלון ללא תא ולהגדיר אותם כהיסטים.
  הערה: האות משמעו שהאות האור יתגלה במערכת ספירת הפוטון.
4. החזר את התא למיקום ההתחלתי וממד את אותות הרקע של התא ואת אזור התא.
  הערה: למרות שאור העירור מסונן עם המסנן ' מעבר בנדנה ', הוא עדיין מכיל כמות גדולה מאוד של האור המסונן. אור זה מפוזר כאשר להכות את התאים וגורם לאות רקע ניכר כי מערכת ספירת הפוטון הוא רגיש מאוד. . צריך לתקן את זה
  הערה: ניתן לחשב את אזור התא עם תמונת תא שנלכדה ותוכנת דימות זמינה. יחידת התאים יכולה להיות כל יחידה כולל ספירת פיקסלים. . רק סטנדרטיזציה זה הכרחי
5. חזור על ה4.1.1 ל4.1.4 במשך 10 פעמים כדי לקבל את הקשר בין אזור התא לבין אותות הרקע של התא.
  הערה: מאוחר יותר, ניתן לחשב את אותות הרקע של התא מאזור התא מקשר הגומלין. מכיוון שנורת האור עירור הופכת להזדקנות, הליך זה צריך לחזור על עצמו, לפחות בכל חודש.
מדידה של מקדמי R
1. לחשב Rf עם המשוואה 4 מן האותות המתקבלים בסעיף 4.2.
2. הר את התאים ללא צבע על המיקרוסקופ ומבשם Ca^{2 +}-חינם הפתרון.
3. למדוד את האותות כגון F₃₆₁, ₄₅₀, _nadh, F₄₀₀, ₅₀₀, _nadh, f₃₆₁, ₄₅₀, _nadh, ו-f₃₅₃, ₅₀₀, N_אד.
4. מבצע את הפתרון המלף וחזור על 4.3.3. ולמדוד את האותות.
5. מבשם הפתרון הפירובט ולחזור על ה4.3.3. ולמדוד את האותות.
6. מבצע את התמיסה המל4.3.3 וחוזר על עצמו. ולמדוד את האותות.
7. באמצעות הפתרון rotenone ולחזור על 4.3.3. ולמדוד את האותות.
  הערה: הדוגמה של האות nadh הוקלט על פירובט 5 מ"מ, 5 מ"מ ארמיטה פלוס 5 מ"מ פירובט, ו 10 μm rotenone תוספת מוצג באיור 3.
8. לחשב כל שיפוע של F₃₆₁, ₄₅₀, _nadh vs. F₄₀₀, ₅₀₀, _nadh ו-f₃₆₁, ₄₅₀, _nadh vs. f₃₅₃, ₅₀₀, _nadh. בדומה למוצג באיור 3. כל מדרון מציין R_N1 ו-r_N2.

5. מבחר עירור ואור הפליטה עבור TMRE או קרבוקסיב-1

אם TMRE עבור מדידת פוטנציאל מיטוכונדריאלי נעשה שימוש בנוסף, השתמש 530 הריגוש ננומטר גל ו 590 הפליטה ננומטר גל.
אם השימוש בקרבוקסיב-1 למדידת הפוטנציאל המיטוכונדריאלי נעשה בשימוש בנוסף, השתמש באורך הגל של 540 ננומטר ואורכי גל פליטה של 590 ננומטר ו640 ננומטר¹².

6. בחירת ערך K-_d של fura-2-FF

השינוי של ה-pH יכול להשפיע על ערכי K_d עבור Ca^{2 +} קשירה על fura-2-FF¹⁰. השתמש בערך K_d של 5.28 ב-pH 7.5 עבור המיטו,.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שינויים עקב תיקון¹⁰
איור 4 מציג את השינויים ב [Ca^{2 +}]_m לפני ואחרי התיקון. התוצאות הראו בבירור את השינויים הניכרים ב [Ca^{2 +}]_m. מיטוכונדריאלי מונח ריכוז סידן ללא cytosolic Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_c) היה 1.03 ± 0.13 μm (ממוצע ± S.E., n = 32), ואת המקסימום [ca^{2 +}]_m ב 1-μm [ca^{2 +}]_c היה 29.6 ± 1.61 μm ( אומר ± S.E., n = 33) (איור 5

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטת תיקון ההפרעות פותחה בהצלחה עבור מדידת האותות של NADH ו fura-2 אנלוגיות. מדידה מדויקת של האותות חיונית לתיקון מדויק. עם זאת, האופי הטבוע של מכשיר הפלורסנט מייצר אות רקע שאינו קשור לזה של NADH של fura-2. הפילטר האיכותי ביותר יכול להעביר עד 10 עד⁸ מאורכי הגל הלא רצויים של האור. עם זאת, אות הפלורסנט מתא בודד הוא קטן מאוד, ואת ההשתקפות של אור עירור לאחר מסנן הלהקה-pass עדיין חזק מספיק כדי לזהם את אותות פלורסנט בפועל. לכן יש צורך בתיקון מזהיר של אות הרקע.

Fura -2 יש בעיה העמסה למדוד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

תודות

עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי תוכנית בסיסית מחקר המדע באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2018R1A6A3A01011832), על ידי משרד המדע, מ& תכנון עתידי (NRF-2016M3C1A6936606) ועל ידי משרד המסחר, התעשייה & אנרגיה (10068076).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>2 מ"ל אפנדורף צינור	אקסיג'ן	MCT-200-C	2 מ"ל צינור
<חזק>AD/DA ממיר	Instrutech	ITC-18	ציוד
<חזק>ADP, אדנוזין 5&פריים;-דיפוספט מונופוטסיום מלח דיהידרט	סיגמא-אולדריץ'	A5285	כימיקלים
<חזק>מסנן מעבר פס	אילינג אלקטרו-אופטיקה, בע"מ	35-3920	ציוד, 640 & מסנן מעבר פס 11 ננומטר
<חזק>	אומגה אופטי	690-9823	ציוד, 590± מסנן מעבר פס 15 ננומטר
<חזק>	אומגה אופטי	500DF20-9916	ציוד, 500± מסנן מעבר 20 ננומטר
<חזק>פס	Chroma Technology Corp.	60685	ציוד, 450 פלוס; תמיסת סידן כלוריד 30 ננומטר
<חזקה>	>סיגמא-אולדריץ'	21114	כימיקלים
<חזק>קרבוקסי-SNARF-1(AM)	Invitrogen	C1272	כימיקלים
<חזק>התקן מצמד מטען (CCD) מצלמה	ציוד	פיליפס	FTM1800NH/HGI
<מראה חזקה>דיכרואית	Chroma Technology Corp.	86009	ציוד, מראה דיכרואית רב-פסית, השתקפות : < 400 ננומטר, 490 ופלוסמן; 10, 560 ופלוסם; 10, תיבת הילוכים: 460 & 15, 510 ו-plusmn; 20, >580 ננומטר
<חזק>מראה דיכרואית	Chroma Technology Corp.	567DCXRU	ציוד, השתקפות: < 560 ננומטר, שידור: > 580 ננומטר
<מראה חזקה>דיכרואית	Chroma Technology Corp.	480dclp	, השתקפות: < 470 ננומטר, תיבת הילוכים: > 490 ננומטר
<מראה חזקה>דיכרואית	Chroma Technology Corp.	20728	ציוד, מראה דיכרואית רב-פסית, השתקפות : < 405 ננומטר, 470 ופלוסם; 30, שידור: 430 ננומטר ~ 520 ננומטר, > 640 ננומטר
<חזק>דימתיל סולפוקסיד (DMSO) < חזק >	סיגמא-אולדריץ	' 154938	כימיקלים
<חזקים>DMEM, דולבקו' s Modified Eagle' s כימיקלים בינוניים	סיגמא-אולדריך	D5030	כימיקלים
<חזק>EGTA, חומצה אגטזית, אתילן-ביס(אוקסיאתילניטרילו)חומצה טטראצטית, גליקול אתר דיאמין חומצה טטראצטית	סיגמא-אולדריך	E4378	כימיקלים
<חזק>FCCP, מזוקסלוניטריל 4-טריפלואורומטוקסיפנילהידרזון	סיגמא-אולדריץ'	21857	כימיקלים
<דיאפרגמת שדה >חזקה	Nikon	86506	ציוד
<חזקה>פורה-2-FF(AM)	TEFLABS	137	כימיקלים
<שפופרת חזקה>ירוקה	מבחנה	DWM
<חזקה>HEPES, 4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית, N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-N&פריים;-(2-חומצה אתנסולפונית)	סיגמא-אולדריץ'	H3375	כימיקלים
<חזק>מונה במהירות גבוהה	National Instruments	NI-6022	ציוד
<חזק>מראה חמה	Chroma Technology Corp.	21002	ציוד, 50:50
<חזק>מיקרוסקופ הפוך	Nikon	TE-300	ציוד
<חזק>מלאט	סיגמא-אולדריץ'	27606	כימיקלים
<חזק>מסנן אינפרא אדום קרוב	Chroma Technology Corp.	D750 / 100X	, 750 ופלוסמן; עדשת טבילה בשמן 100nm
<חזקה>	Nikon	MRF01400	40x, NA 1.3; ציוד
<חזק>יחידת דלפק פוטון	Hamamatsu	C3866	ציוד
<חזק>צינור מכפיל פוטון	Hamamatsu	R2949	ציוד
<חזק>פוליכרום II	Till Photonics	SA3/MG04	ציוד
<חזק>אשלגן כלורי	Merck	1.04936	כימיקלים
<חזק>תמיסת אשלגן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ	' P4494	כימיקלים
<חזק>פירובט	סיגמא-אולדריך	107360	כימיקלים
<חזק>רוטנון	סיגמא-אולדריץ'	R8875	כימיקלים
<חזק>ספונין	סיגמא-אולדריץ'	S4521	כימיקלים
<חזק>TMRE, טטרמתילרודמין, אתיל אסטר	בדיקות מולקולריות	T669	כימיקלים

ציוד ציוד

מקורות

Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NADH Ratiometric Fluoroprobe NADH Tetramethylrhodamine Ethyl Ester Carboxy Seminaphtorhodafluor 1

הרומן ניקולט שיטת תיקון Dinucleotide עבור Ca תאיים2 + מדידה עם fura-2-אנלוגי בתאים חיים