מאמר שיטה

הכנה ואפיון ננו-פוטזומים לצורך מלכודת הידרופיזיאליות של חלבונים ביולוגיים

DOI:

10.3791/59900

⸱

31 באוגוסט 2019

 ,  , 
1Chemistry Institute, Federal University of Rio de Janeiro

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר לחות קלאסית באמצעות שיטת הסרט דק השומנים לקראת nanoliposome סוימים ואחריו ננו-חלקיק אפיון. 47 kDa-hydrophilic וחלבון כדורי, טארין, הוא כיום בהצלחה כאסטרטגיה כדי לשפר את היציבות, להימנע הרשאה מהירה, ולקדם שחרור מבוקר. ניתן להתאים את השיטה לעטיפת מולקולות הידרופובי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליפוכמה nanocapsules הוחלו למטרות רבות בתעשיית התרופות, קוסמטיקה, ומזון. תכונות של ליפוזומים כוללים תאימות ביולוגית שלהם, biodegradability, לא חיסוני, חוסר רעילות, ויכולת להוסיף גם תרכובות הידרופיפילית והידרו-פוביות. הידרציה הקלאסית של סרטי השומנים הדק בממס אורגני מיושם כאן כטכניקה לכמס טארין, לקטין צמח, ב nanoliposomes. Nanoliposome גודל, יציבות, מלכודת יעילות, ואפיון מורפולוגית מתוארים בפרוטרוט. הננו-פוטזומים מוכנים באמצעות 1, 2-dioleoyl-sn-גליצרול-3-פוספולאטאנאמין (סם), 1, 2-dioleoyl-sn-גליקו-3-פוספהואנתאנאואמין-N-[אמינו (פוליאתילן גליקול)-2000] (אמוניום מלח; DSPE-MPEG 2000), ו cholesterylhemisuccinate (CHEMS) כמו המרכיבים העיקריים. שומנים מומס הראשון ב כלורופורם כדי להשיג סרט השומנים דק כי הוא הנוזלים לאחר מכן בתמיסה אמוניום גופרתי המכיל את החלבון להיות לכוד ומודבטים לילה. לאחר מכן, טכניקות sonication ושחול מוחלים כדי ליצור unilamellar שלפוחיות ננו-בינוניות. המדד הגדול והרב של הננו-שלפוחית נקבעים על ידי פיזור אור דינמי, ואילו מורפולוגיה ננו-שלפוחית מוערך על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני. יעילות מלכודת נקבעת על ידי היחס של כמות החלבון שאינו כימוס לכמות המקורית של חלבון טעון בתחילה. ליפוזומים הומוגנית מתקבלים בגודל ממוצע של 155 ננומטר וערך המדד של 0.168. יעילות מלכודת גבוהה של 83% מושגת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר המחקרים היעילים העלו בשנים האחרונות את מערכות אספקת הסמים היעילות. עם זאת, מגבלות כגון הסיווג מהיר, ביולוגי עני התפלגות, מסיסות ב-pH פיזיולוגי וספיגת הסלולר מספיק עדיין צריך להיות מעל. השימוש במערכות ננו התפתחה כהתקדמות האחרונה בסרטן therapeutics, להחיל כדי להגדיל את הריכוז התאיים של תרופות בתוך תאים סרטניים תוך מזעור רעילות בתאים בריאים. יתר על כן, חלקיקים שהתקבלו ממגוון שונים של חומרים (כלומר, פולימרים, דנדריטים, ליפוזומים, וירוסים, פחמן צינוריות, ומתכות כגון תחמוצת ברזל וזהב) מוחלים כרגע כדי לשפר את ההשפעות נגד סרטן ולהפחית מערכתי רעילות1. ליפוכמה nanocapsules בפרט הוחלו למטרות רבות בתעשיית התרופות, קוסמטיקה, ומזון. בשנים האחרונות, מוצרים נוטראטיים שונים כגון ויטמינים, אנזימים, ותמציות צמחים כבר גובשה באמצעות ליפוכמה טכנולוגיה2.

ליפוזומים הם כדוריים ושלפוחיות המורכב של אחד או יותר bilayers שומנים באופן ספונטני נוצר על ידי פיזור של פוספוליפידים במדיה ימית3,4. ראשי הקוטב של הפוספוליפידים ממוקמים על המשטחים החיצוניים והפנימיים של הקרומים, במגע עם הסביבה הימית. לעומת זאת, שרשראות חומצת שומן יוצרות את ליבת ההידרופובי של הקרומים ומוגנות מהמים5. תכונות מסוימות של ליפוזומים הגורמים להם מערכות מסירה מושכת של סמים כוללים תאימות ביולוגית שלהם, biodegradability, לא חיסוני, לא רעילות, ואת היכולת להוסיף הן תרכובות הידרופיפילית ו הידרו פוביות6.

ניתן להכין ליפוזומים באמצעות שלבים שונים כגון עצבנות, sonication, שחול, ליטוטיזציה, הקפאה והפשרה. שיטות קלאסיות כוללות אידוי לשלב הפוך, הזרקת ממס, וכלי ניקוי דיאליזה. השיטה המוחלת ביותר היא לחות דק השומנים הסרט, המכונה גם השיטה של bangham, אשר משמש להשגת צורות השומנים vesicular7,8,9,10,11. לאמטיות (מספרם של הזרחן) וגודל החלקיקים הם פרמטרים קלאסיים המשמשים לאפיון ליפוזומים כמו 1) unilamellar ושלפוחיות (ULVs), נוצר על ידי בילוליפיד זרחן ייחודי משתנה בגודל כדלקמן: i) קטן unilamellar שלפוחיות (רכבי השטח, ~ 0.02-0.20 μm), ii) גדול unilamellar ושלפוחיות (LUVs, ~ 0.2-1.0 μm), ו-iii) ענק unilamellar שלפוחיות (GUVs, > 1 μm); או 2) מולטיצ שלפוחיות (mlvs, > 0.1 μm)3,12. גודל שלפוחית הוא פרמטר חשוב כאשר בוחנים שימוש תרפויטי, כגון טיפול בסרטן, שבו גדלים של < 200 ננומטר הם אידיאליים כדי לאפשר ננו שלפוחיות לחצות את מחסום האנדותל ולהגיע רקמות מוסרי4.

בזאת, את ההליך אנקפסולציה לאחר הליחות הקלאסית של טכניקת השומנים הדק הסרט7 תוארה באמצעות טארין, צמח לקטין המאופיין חלבון כדורי הידרופילי13,14,15 . שלפוחיות ננו בגודל מיוצרים על ידי כלילת שלבים sonication ו ההבלטה בטכניקה העיקרית, וכתוצאה מכך שלפוחית ליפוזומלית יציבה עם יעילות מלכודת גבוהה16.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ליפוזומזה של טארין בננה16

הערה: יש להכין את כל ההכנות בטרילקאט כדי להשיג נפח גדול יותר (7 מ ל) ולאפשר למדגם לcentrifuged בultracentrifuge (ראו פרטים להלן).

  1. שוקלים ליפופי רכיבים באמצעות איזון אנליטי, כפי שמוצג בטבלה 1.
  2. לפזר את הרכיבים השומנים בכלורופורם באמצעות מיכל 250 mL המתאים לאייד רוטרי כדי למנוע אובדן של חומר.
  3. מערבבים את התערובת ב 150 סל ד למשך 15 דקות.
  4. הסר את הכלורופורם באמצעות מאייד רוטרי בתנאים הבאים:
    1. התאימו את הפה הנפחי לתנוחה הסטנדרטית (25 °) ליעילות אופטימלית, ובמגע עם המים מאמבט החימום.
      הערה: זרוע הציוד צריכה להיות נוטה ב -25 ° כדי לשמור על קשר בין הבקבוקון הנפחי לבין אמבט מים, בעוד לא להשפיע על האידוי יעילות או פגיעה במדגם. התנוחה הסטנדרטית יכולה להשתנות בהתאם למותג הציוד.
    2. הגדר את טמפרטורת העבה למינימום של 3 ° c.
    3. הגדר את טמפרטורת אמבט החימום ל-40 ± 1 ° c.
    4. הגדר את הסיבוב על 120 rpm.
    5. כוונן את הוואקום ל 207 mbar ונקודת רתיחה ל-20 ° c.
    6. לאחר ~ 25 דקות, להסיר את הבקבוקון ולמחוק את הממס המואדו, הנותרים העבה, כראוי.
      הערה: סרט דק ואטום, המורכב מרכיבים ליפושים, נוצר בשלב זה וניתן לדמיין בקלות. הממס המואדו שנותר בתוך העבה חייב להיות מאוחסן לנמענים לסילוק (כלור) להיות מטופלים על ידי חברה מיוחדת עבור השלכת המתאים.
  5. מימה את הסרט השומנים כדי להגיע לריכוז 0.01 M השומנים ב 0.3 הפתרון אמוניום גופרתי (pH = 7.4) המכיל טארין ב 1 מ"ג/mL לנפח הסופי של 10 mL.
    1. מערבבים את התערובת עבור 40 דקות ו-דגירה לילה ב 4 ° c.
      הערה: שלב זה יכול להיחשב כנקודת עצירה. הדגירה של הלילה אינה חובה.
  6. לאחר הדגירה, הsonicate ההשעיה של 1 דקות ב -25 ° צ' (טמפרטורת החדר; RT) כדי להפחית את גודל הוולפוחית ולמנוע צבירה.
    הערה: הפחתת גודל בוצעה בsonicator אולטרה סאונד תחת התנאים הבאים: 130 W ו 40 kHz.
  7. לבצע שחול 12 מחזור באמצעות קרום הנקבובית של 0.2 יקרומטר.
    הערה: לפני תהליך ההבלטה, בדוק את ההרכבה המצומצמת באמצעות מים כדי להימנע מדליפה לדוגמה. קרום נקבובית 0.1 יקרומטר מתאים גם. במקרה זה, טרום לחמם את המחזיק הקטן הבלטת ממד מעל טמפרטורת המעבר ליפיד כדי להקל על שחול, תוך שמירה על המאפיינים הפיזיקליים של שני השומנים והחלבונים.
    1. התאם את חלקי הבלטת ממד המצומצם, כפי שמתואר במדריך היצרן.
    2. מניחים את קרום פוליקרבונט בין שני מסנן טרום רטוב תומך ולמקם אותו לתוך המחזיק.
    3. הכנס מזרק אחד mL ריק לתוך המכשיר, למלא את המזרק השני על הנפח הכולל שלה עם ההשעיה ליפוזומבית, ולהכניס אותו בצד הנגדי.
    4. לבצע שחול 12 מחזור באמצעות קרום הנקבובית של 0.2 יקרומטר. לדחוף את הדגימה ממזרק. אחד למשנהו, לאט לאסוף את ההשעיה הבלטת צינור טרום מקורר.
      הערה: קרום הפוליקרבונט צריך להיות מוחלף רק כאשר העברה לדוגמה ממזרק אחד למשנהו הופכת קשה. ההשעיה ליפוזומבית צריך להיות ברור במהלך התהליך ההבלטה כתוצאה הפחתת גודל בשל היווצרות של רכבי השטח. כ 0.2 מ ל של המדגם ניתן לאבד במהלך שלב זה.
  8. ליפוזומים נפרדים. באמצעות הסתבכות
    הערה: שמרו על הדגימות באמבט קרח עד שultracentrifuge מוכנה לשימוש. הפרדת רכבי השטח מהרכיבים הנותרים והאמוניום סולפט באמצעות ultracentrifuge עם רוטור הנדנדה (ראה פרטים להלן).
    1. שוקלים את המדגם בצינור טיטניום המתאים הרוטור ולאזן את הצינורות. בדוק את אמצעי האחסון המינימלי הנדרש על פי הרוטור המשמש כדי למנוע נזק הצינורות, ולהתאים את נפח ההשעיה ליפוזומעם אמוניום סולפט, במידת הצורך.
      הערה: דלי הנדנדה תמיד צריך להיות נתמך על המעמד כאשר מחוץ לצנטריפוגה כדי למנוע גירוד "פסים זברה" (כלומר, פסים שחור ולבן בתחתית), אשר משמשים את הצנטריפוגה כדי לקבוע את מהירות הסיבוב.
    2. הפעל את הוואקום לפני השימוש צנטריפוגה כדי לאפשר לו למקרר.
    3. להתאים את צינורות טיטניום לתוך דלי הנדנדה.
      הערה: הרם את הצינורות למיקום שהם מניחים בעת הפעלת כדי לוודא שהם מצוידים באופן מושלם.
    4. שחררו את הוואקום, פתחו את דלת הצנטריפוגה והניחו את הרוטור בפנים.
      הערה: שים לב לסימון המעגל בתחתית הרוטור, אשר חייב להתאים בכיוון ההפוך של אותו סימן מעגל לתוך הצנטריפוגה עצמה.
    5. סגור את דלת הצנטריפוגה, לחץ על ואקום ולחכות עד ואקום מגיע מ 200 כדי < 20 מיקרון או מ 26 Pa כדי < 3 Pa.
    6. כוונן את הפרמטרים בultracentrifuge התצוגה ל-150,000 x g (המקבילה ל-29,600 rpm עבור דלי הנדנדה האמור) עבור 90 דקות ב-4 ° צ' (האצת: מקסימום, האטה: מקסימום).
      הערה: המירו תמיד את המהירות ל-x g אם הצנטריפוגה הספציפית מוגדרת ב-rpm. השתמש באתר הצנטריפוגה כדי להמיר את היחידה בהתאם לרוטור המשמש.
    7. הקש על אחזר, בדוק את התנאים ולחץ על ' התחל ' כדי לפעול.
      הערה: המתן עד שהצנטריפוגה תגיע למהירות הרצויה.
    8. לאחר 90 דקות, לשחרר את הוואקום על ידי לחיצה על כפתור ואקום ולפתוח את דלת צנטריפוגה כאשר ואקום מגיע 200-700 מיקרון (שווה ערך ל 26-93 Pa).
    9. לכבות את הצנטריפוגה, להסיר את הרוטור מבפנים, ולהשאיר אותו על הספסל עם דליים להתייבש.
    10. . שמור על הדגימות של הקרח
  9. בזהירות, supernatant נפרד מן הגלולה על ידי הפיכת הצינור הפוך מטה לתוך שפופרת צנטריפוגה חד פעמי 15 מ ל כדי להפריד את supernatant ואת הגלולה.
    הערה: לאחסן את הסופרנטנט המכיל את החלבון שאינו מכיל ב-4 ° c. הוא ישמש לקביעת יעילות האנקפסולציה. . הגלולה מופיעה כמו ג'לי שקוף
  10. השהה את הגלולה המכילה את החלבון המכוונן ב-HEPES מלוחים באגירה (3 מ ל של 1x HBS).
    הערה: HBS 2x (פתרון המניה) מוכן על ידי דילול הסכומים הבאים של ריאגנטים במים מזוקקים: 140 mM הנאגל, 1.5 mM Na2hbs4, 50 מ"מ hepes, ולאחר מכן התאמת ה-pH כדי 7.4 ונפח סופי כדי 100 mL. Na2hpo4 ניתן להחליף על ידי נחקו3או מושמט כדי למנוע הפרעות אם ליפוכמה ריכוז הוא להיקבע. The HBS 2x פתרון המניה צריך להיות מדולל במים מזוקקים כדי לקבל HBS 1x לפני השימוש.

2. יעילות כימוס

הערה: קבע את יעילות האנקפסולציה באמצעות פרוטוקול פיטרסון17על מנת למנוע הפרעות שומנים בדם בקוונפיקציה חלבון. יש לנתח את כל הדגימות (בתקני BSA וליפומה סופרנטאנט) בטרילקאט. הכינו גם צינורית ריקה.

  1. הכנת ריאגנטים למניה ופתרונות עבודה17
    1. עבור ריאגנטים במלאי, להכין נחושת-tartrate-קרבונט (CTC) על ידי ערבוב 10 מ ל של 20% נתרן פחמתי, 200 μL של 0.1% נחושת סולפט, 200 μL של 0.2% אשלגן tartrate עם 9.6 mL של מים מזוקקים. הכינו 100 mL של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS) ו 0.8 N הידרוקסיד נתרן (NaOH).
    2. עבור פתרונות עבודה, להכין 10 מ ל של 0.15% נתרן deאוקסיבלשנות (DOC) ו 72% חומצה אצטית טריכלור (TCA). התמוססות 10 מ ג של סרום הפרה אלבומין (BSA) ב 10 מ ל של מים מזוקקים כדי להשיג 1 mg/mL פתרון סטנדרטי. הכן מגיב על ידי הוספת חלקים שווים של CTC, NaOH, SDS, ו-H2O. הכנת מגיב B על ידי דילול folin-Ciocalteu פנול מגיב 1:5 במים מזוקקים.
      הערה: מגיב A דורש 1 mL עבור כל צינור התגובה, בעוד מגיב B דורש 0.5 mL. כדי לקבוע את הכרכים הסופיים של ריאגנטים A ו-B, ראשית להגדיר את מספר צינורות התגובה לשמש, בהתחשב בשלושה ריכוזים שונים של BSA, ריק, ודגימות בטריליטה. מגיב יש להיות הומוגניים היטב לפני השימוש ניתן לאחסן ב 25 ° צ' (RT) עבור 2 שבועות. מגיב B הוא גם יציב ב -25 ° צ' (RT) אם מאוחסן בבקבוק ענבר.
  2. משקעים
    הערה: שלב זה מבוצע בצינורות מיקרוצנטריפוגה.
    1. לדלל את ליפומי supernatant עם מים לנפח הסופי של 1 mL המכיל 5-100 μg של חלבון.
      הערה: הצינור הריק צריך להיות מלא 1 מ ל של מים מזוקקים.
    2. הוסף 0.1 mL של 0.15% DOC, הומוגון על ידי vortexing, ו-דגירה עבור 10 דקות ב RT.
    3. הוסף 0.1 mL של 72% TCA, מערבבים היטב, וצנטריפוגה ב 3,000 x g ו RT עבור 15 דקות.
      הערה: DOC-TCA מקדמת משקעים בחלבון, ויוצרים שני שלבים נפרדים. חלבון היעד ניתן לשחזר על ידי צנטריפוגה, הימנעות הפרעות שומנים בדם.
    4. השמט בזהירות את הסופרנטנט על-ידי הסטת הצינורית כלפי מטה והנחת הצינור על נייר סופג. שמור את הגלולה לשלב הבא.
      הערה: הגלולה יכולה להיות קשה מאוד לראות, אבל הצינור צריך להיות מתהפך גם אם זה לא נראה.
  3. ספקטרופוטומטר
    1. להשעות את הגלולה שהתקבל משלב 2.2.4 ב 1 מ ל של מים מזוקקים. מערבבים ביסודיות כדי לוודא את הגלולה היא התפרקה ולהעביר את המדגם למבחנה חדשה בדיקה.
    2. הכנת מדלל סטנדרטים של אלבומין (BSA) לנפח סופי של 1 mL.
      הערה: תקני חלבון חייבים להיות מוכנים בין 5-100 μg/mL.
    3. להוסיף 1 מ ל של מגיב A אל הצינורות משלב 2.3.1 ו 2.3.2 ללא יוצא מן הכלל, לערבב היטב, ו דגירה עבור 10 דקות ב RT.
      הערה: SDS יכולים להקל על הפרעות השומנים אפשרי בעוד לסייע בפתרון חלבון.
    4. הוסף 0.5 mL של מגיב B על הצינורות משלב 2.3.1 ו 2.3.2, לערבב היטב, ו דגירה עבור 30 דקות ב-RT בזמן מוגן מפני האור.
      הערה: מגיב Follin-Ciocalteu של פנול הוא תערובת של פוספומוליב ו phosphotungstate משמש לצביעת מטרי של תרכובות המכילות חנקן, כגון חלבונים. Complexation נחושת מגבירה את הפעילות החוזרת של פנולים כלפי מגיב זה, הפקת מתחם כחול/סגול על פי ריכוז חלבונים.
    5. קביעת ספיגת ב750 ננומטר באמצעות ספקטרוסקופיה.
    6. לחשב את ריכוז החלבון בסופרנטנט על בסיס העקומה הסטנדרטית כדלקמן.
      1. ערך בספיגת העלילה (Abs) vs. bsa ריכוז (Mg/mL) כדי להשיג את מקדם זוויתי (k) בהתחשב קו נטייה ליניארית.
      2. לקבוע את ריכוז חלבון סופרנטאנט (C) ביחס בין ערך הספיגה לבין מקדם זוויתי (k), ולאחר מכן להכפיל על ידי הנפח הכולל כדלקמן:
        נוסחת חישוב ריכוז, C=[Abs/k]×נפח סופרנטנט, הקשורה למחקרי ספיגה.
  4. קבע את יעילות האנקפסולציה בהתאם לנוסחה הבאה:
    נוסחת יעילות אנקפסולציה המציגה משוואת חישוב אחוז אנקפסולציה של חלבון.
  5. כאשר טעון חלבון = 10 מ"ג, חלבון שאינו כימוע = ערך של C התקבל בשלב 2.3.6.2.
    הערה: במקרה זה, סך של 10 מ"ג טארין מומס בתמיסה אמוניום גופרתי (1 מ"ג/mL) משמש לביצוע הליך האנקפסולציה, כיוון שריכוז זה מספיק כדי להשיג את השפעות החוץ-גופית13,16, . שמונה עשרה

3. קביעת גודל ויציבות

הערה: התפלגות הגודל והחלוקה של התרופות (PdI) של ההכנות ליפוזוממים מוערכים על ידי פיזור אור דינאמי (DLS). PdI קרוב ל 0.1 מציין הכנה הומוגנית. לקביעת יציבות, ליפוזומים בחנות ב -4 ° c ובדיקת גודל הממוצע באופן קבוע.

  1. הפעל את הציוד DLS 30 דקות לפני השימוש כדי לחמם את מנורת הלייזר.
  2. העבר את ההכנה ליפוזומבית שהתקבל בשלב 1.10 לקובט לשינוי גודל חד פעמי.
  3. הגדר את פרמטרי הציוד כדלקמן: דיפרסנט סוג = מים (RI = 1.33); חומר = שומנים (RI = 1.45); ו-RT.
  4. לחץ על התחל והמתן בזמן שהציוד מסיים את קריאתו.
  5. הסר את הקובט וכבה את הציוד.
    הערה: יש להעביר את המדגם מקובט בחזרה ל 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה חד פעמית עבור ניתוחים הבאים, או להשליך אותו אם יש סכום מספיק עבור קריאות חדשות.

4. אפיון מורפולוגית

הערה: ליפומין אפיון מבוצע על פי מורטיי ורמסניי19. דגימות המכילות nanoliposomes שהתקבלו בשלב 1.10 מוכנים בטרילקאט.

  1. לתקן את שמיכות זכוכית (קוטר 13 מ"מ) בחלק התחתון של צלחת פטרי עם קלטת דו צדדית. חותכים את הקלטת לחלקים קטנים (הגודל המתאים לתיקון הכיסויים), מסירים את הנייר המגן מתחת ומסדרים אותו בתחתית צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים, הסר את נייר המגן על גבי הקלטת ותקן את הכיסויים.
    הערה: היזהר בשלבים הבאים כדי לא לשחרר את הכיסויים, ולהשתמש בקלטת חזקה.
  2. . המעיל מחליק עם פולי-ל-ליזין מניחים ניירות מסנן רטוב בתוך צלחת פטרי כדי לשמור על לחות הדגירה 1 h ב RT (25 ° c).
  3. לאחר ציפוי, לשטוף את הכיסויים עם מים מזוקקים.
  4. למלא את הכיסויים עם טיפה של המדגם משלב 1.10 ולאפשר להם להתייבש 1 h ב RT.
  5. כדי לתקן את הדגימות, לכסות אותם עם 4% גלוטאלדהיד מוכן 0.1 M פוספט מאגר, pH = 7.2. מניחים ניירות מסנן רטוב בתוך צלחת פטרי וחותם את הצלחת כדי לשמור על רמות לחות. מודטה ב -4 ° c עבור 48 h.
  6. לשטוף את 3x שמיכות עבור 5 דקות עם מאגר פוספט זהה.
  7. דוגמאות מייבשים כדלקמן: 35% אתנול 1x עבור 15 דקות, 50% אתנול 1x עבור 15 דקות, 75% אתנול 1x עבור 15 דקות, 95% אתנול 2x עבור 15 דקות, ו אתנול מוחלט 3x עבור 20 דקות.
  8. מייבשים את הדגימות על ידי הטבילה ב-2x ב-1-2 מ ל של החוקרים במשך 10 דקות.
    הערה: יש לתמרן את ה-HMDS בזהירות בתוך מכסה המנוע. ניתן לאפשר לdesiccator להתייבש בתוך הלילה או בתוך מייבש המנוע ב-RT.
  9. הר את הדגימות מיובש על stub עם דבק פחמן מוליך דבק.
  10. שטחו את פני השטח של שמיכות בוואקום עם שכבת מוליך חשמלית (20 ננומטר) של זהב-פלדיום.
  11. הקלטת תמונות עם מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה (SEM) במצב ואקום נמוכה ומתח נמוך (20 kV).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מתאר את nanoliposome סוימים הכנה16,20,21. פוספוליפידים, 1, 2-dioleoyl-sn-לגליצרול-3-פוספולאטאנאמין (סם), 1, 2-דיסטארוקסיל-sn-גליקו-3-פוספהואטאנאואמין-N-[אמינו (פוליאתילן גליקול)-2000] (אמוניום מלח; DSPE-MPEG 2000), ו cholesterylhemisuccinate (CHEMS), המרכיבים העיקריים ליפוחלק, היו הומס הראשון ב כלורופורם כדי להשיג את הסרט ליפיד. הסרט השומנים היה לאחר מכן בתמיסה אמוניום גופרתי המכיל את החלבון הידרופילי (טארין) להיות לכוד, ואת הדגירה בוצעה לילה. לאחר מכן, sonication וטכניקות שחול הוחלו על הפקת unilamellar שלפוחיות קטנות. הצעד המקביל הפריד את ההכנה ליפוזומלית משומנים בחינם וחלבון ללא כימוס, ואילו הסופרנטאנט שימש לקביעת יעילות מלכודת.

Nanoliposomes המיוצר באמצעות המתודולוגיה הנ ל הציגה התפלגות גודל החל 51-396 nm ו בגודל ממוצע של 155 ננומטר (שולחן 2). ההכנה הייתה הומוגנית, מאחר והמדד הפולידיסטילי היה 0.168. יעילות מלכודת גבוהה של 83% ניתן להגיע אם ליפוזומים הם הבלטת דרך ממברנה בגודל 0.2 יקרומטר הנקבוביות (שולחן 2).

ננואוליפומורפולוגית מאפיינים הוערכו על ידי SEM. איור 2A, B מציג בצורה עגולה שלפוחיות שלפוחית בטווח של 121 ננומטר ונותחו ב 20 KV, בעוד איור 2ג, D מציג כראוי מוכן דגימות. Nanoliposomes היו פשוט מיובשים האוויר ללא הקיבעון הקודם או כל טיפול אחר המתואר במחקר זה. כתוצאה מכך, שלפוחיות גדולות ופגועות בטווח של 332 יקרומטר ונותחו ב 5 kV נצפו.

דיאגרמת סינתזת ננו-חלקיקי שומנים; התייבשות, סוניקציה, שחול למחקר אספקת תרופות.
איור 1: ייצוג סכמטי של הכנת הננו. סמים, פג, ו CHEMS, המרכיבים העיקריים של הרכיבים, היו הומס הראשון ב כלורופורם כדי להשיג את הסרט ליפיד (1, 2, 3). הסרט השומנים היה לאחר מכן במאגר מלוחים המכיל את החלבון הידרופילי (טארין) להיות לכוד, ואת הדגירה בוצעה לילה (4). לאחר מכן, טכניקות sonication ו ההבלטה יושמו כדי ליצור רכבי שטח (5, 6). הצעד המקביל הפריד את ההכנה ליפוזומלית משומנים חופשיים וחלבון ללא כימוס, ואילו הסופרנטאנט שימש לקביעת יעילות מלכודת (7). דמות זו שונתה מ Correa ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דגימות SEM מספקות לעומת לא מספקות; השוואת מיקרו-מבנים בקנה מידה ננומטרי; ניתוח גודל חלקיקים.
איור 2: שנאוליפוכמה photomicroscopy על ידי SEM. (א, ב) תמונות של ליפוזומתיים עגולות בצורת שלפוחיות בטווח של 121 ננומטר ונותחו ב -20 kV. (ג, ד) תמונות של דגימות. שהוכנו בצורה מספקת דגימות שאינן מורשות להתבונן על שלפוחיות גדולות ו/או פגומות, שאינן יכולות להתנגד למצבי ואקום ו/או מתח ב-5 kV. דמות זו שונתה מ Correa ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ליפוכמה רכיביםמשקל (גר')ריכוז (ממ)נפח סופי
סמים0.04205.710 מ ל
MPEG 2000-DSPE0.10593.8
מיכל כימי0.00240.5

סמים-1, 2-dioleoyl-sn-גליצרול-3-פוספולאטיאנאמין); MPEG 2000-DSPE-1, 2-distearoyl-sn-גליליקו-3-פוספהואטאנאואמין-N-[אמינו (פוליאתילן גליקול)-2000] (אמוניום מלח); מcholesterylhemisuccinate.

שולחן 1: הכנת ליפוזומלי הננו של טארין.

גודל נקבובית של ממברנה (μm)התפלגות גודל (nm)גודל ממוצע (nm)מדד פולידיסטיסיטה (PdI)שיא (nm)יעילות מלכודת
0.251-3961550.16894 ± 390.83

מדד גודל ומפזרים הוערכו על ידי פיזור אור דינמי, בעוד היעילות אנקפסולציה נקבע על פי פיטרסון17.

שולחן 2: גודל, מפוליפרופילן מדד, ויעילות מלכודת של nanoliposome סוימים הכנה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נבדק על ידי Correa et al.16 כדי לכסיאת טארין, מתוקקים ואנטי מוסרי לאנטין מטוהרים מקולקסיה . המתודולוגיה הניבה תוצאות מוצלחות, המאפשר ייצור nanoliposomes יציבים בגודל המתאים עבור יישומים טיפוליים. ניסוח מציג שחרור נשלט ברמות pH שונים בתנאים פיסיולוגיים. זה גם פוטנציאל התכונות הפרמקולוגית של טארין, כגון עיכוב של האדם גליובלסטומה U-87 MG וסרטן השד מד א-MB-231 תאים וגירוי של תאים במח העצם העצמות. הכנה ליפוזומלית הציגה השפעות רעילים בתאי עכברים בריאים בתאים16.

השיטה הקלאסית, שתוארה לראשונה על-ידי באנגהאם ואח '7, מאפשרת ייצור ליפולי מולטיצ'יני גדול ושלפוחיות, הטרוגנית בגודל ובצורה. עיבודים של שיטה זו, כפי שדווחו במחקר הנוכחי, מוחלים בהצלחה על ידי כולל שלבים נוספים כגון sonication ו שחול באמצעות קרום פוליקרבונט 0.2 יקרומטר. זה מאפשר ייצור של פיזור הומוגנית יותר לגבי גודל בטווח ננומטר16,23,24. לכן, כדי להבטיח תוצאות מוצלחות, פרוטוקול עטיפת האנקפסולציה וניסוח היפוזומיום המתוארים כאן יש לעקוב בקפדנות.

הרכב nanoliposome סוימים נבחר בקפידה על מנת להבטיח את היווצרות קרום bilayer עם סמים, MPEG 2000-DSPE, ו CHEMS כמו המרכיבים העיקריים. אלה הם טבעי בעלי חיים ממברנה bilayer המרכיבים והאחרון יכול להיוועץ נזילות כדי nanoliposome סוימים אדריכלות, להבטיח יישום רחב עבור המסירה מורכבים אקטיביים בבני אדם.

הננו-פוטוליציה היא חיונית כדי להבטיח ליפוכמה יציבות המבנה. העדר של פג מוביל להגדלת גודל, מדד רב מאוד באיכות גבוהה, ויעילות מלכודת נמוכה. תוצאות אופטימליות ניתן להשיג עם סמים כמו המרכיב העיקרי ליפוחלק. עם זאת, זהו פוספוליפיד בעלות גבוהה. העלויות הכספיות של הייצור nanoliposome יכול להיות מושגת על ידי החלפת סמים עם שומנים דומים אחרים כגון הדוג (1, 2-dioleoyl-sn-גליקו-3-פוספהולין). CHEMS היא מולקולה כולסטרול נמצא באופן טבעי ממברנות תא בעלי חיים, אשר לא צריך להיות מנשלל מן הניסוח, מאז חשוב להבטיח נזילות bilayer השומנים ו malleability16.

היבטים אחרים של פרוטוקול אנקפסולציה ניתן גם להתאים. הכלורופורם המשמש לפזר את הרכיבים ליפוזומיום יכול בקלות להיות מוחלף על ידי מתנול ללא השפעות על גודל ממוצע, הומוגניות, ויעילות מלכודת. עם זאת, דליפת חלבונים מסוימים עלולה להתרחש באחסון תחת 4 ° צ'16. השלב הדגירה לילה עם פתרון אמוניום גופרתי המכיל טארין אינו חובה; עם זאת, לנוחות זה יכול להתבצע ללא כל נזק nanolipoזומבית מאפיינים, עטיפת משנה, או יעילות הפסדים ביציבות, כפי שמתואר על ידי Correa et al.16. השלב ההבלטה מבוצע בטמפרטורת החדר, אשר יכול להקטין את קצב הזרימה בין מזרקים אם הממברנה 0.1 יקרומטר בגודל הנקבוביות משמש.

כדי להתגבר על בעיה זו, השימוש 0.2 יקרומטר ממברנה בגודל הנקבוביות או חימום של המחזיק הבלטת ממד מעל טמפרטורת המעבר ליפיד צריך להיחשב. על האנליסט להיזהר שלא לפגוע בשומנים או בחלבון שניתן להשבית ולאבד פעילות ביולוגית. לחילופין, הכנה ליפוזומלית יכול להיות דיאליזה נגד hbs במקום להשתמש בקרום לגזור על פי משקל מולקולרי חלבון. הבחירה של הטבע הכימי של המאגר שבו nanoliposomes מושעה לאחר השעיית הקשר קשורה ישירות היישום הבאים. מאז פרספקטיבות של מחקר זה כוללים vivo ו בתחום מבחנה, ההשעיה ב-HEPES מלוחים באגירה היה מספיק כדי להבטיח לא השפעות ציטוטוקסיו טווח pH קרוב לתנאים פיסיולוגיים.

ליפוזומים צריך להיות מטופלים באופן דק, בדומה לתאים חיים, כדי להשיג תמונות SEM באיכות גבוהה יותר. הליכי קיבוע וייבוש חשובים כדי להבטיח את ההדמיה של שלפוחיות קטנות ללא פגע התומכות בערכים גבוהים מ -20 kV תחת תנאי ואקום. איור 2 A, B מציג הננו-שלפוחית בינונית תואמת את הליך ההבלטה. ויזואליזציה של שלפוחיות החל מ 51-396 nm אפשרי אם הכנה לדוגמה הולם בעקבות הליך זה מבוצע. השלבים כוללים קיבעון, ייבוש על ידי הגדלת ריכוזי האתנול, והתייבשות כימית כדי למנוע היווצרות של אגרגטים ושלפוחיות הנגרמת על ידי ואקום והאלקטרונים קרן. מצד שני, איור 2ג, D מראה ליפושלפוחיות מיובשות בטמפרטורת החדר ולא נתון כל הטיפולים המתוארים כאן, כלומר הם היו מוכנים כראוי. כתוצאה מהליך מתאים, שלפוחיות ענק נוצרות, גם לאחר שחול באמצעות קרום 0.2 יקרומטר בגודל הנקבוביות. שלפוחיות שנקרעו נצפו גם הן בחלוניות כתוצאה מפגיעה בוואקום ובקרן האלקטרונים.

Nanoliposome סוימים ושלפוחיות נחקרו כמערכת אנקפסולציה ומשלוח עבור מולקולות הידרופובי, כולל רזברטרול (3, 5, 4 '-trihydroxyבנות), מתחם אקטיביים נגד תאים סרטניים המעי הגס. הליך האנקפסולציה יכול להתגבר על מסיסות העניים של תרכובות ליפופילית בנוסף לאספקת biocompatibility, biodegradability, non-אימונוגלוגניות, ומאפיינים שאינם רעילות הטבועה ליפוכמה nanocapsules25. יש לקחת בחשבון את העיבודים בפרוטוקול, בהתאם לתוואי הניהול ולמטרה, כגון פיתוח ליפופי ניסוחים חדשים לניהול בעל פה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים בפני המעבדה האלקטרונית, מעבדת מיקרוסקופ אלקטרוני ואפיון חומרים מרובי משתמשים; לד ר אדאלברטו ויירא, ד ר ג'ניפר לאו, ורפאל ליניסו, פרופסורים מאוניברסיטת אוניברסיאנדייד למען ריו דה ז'ניירו, UFRJ, ברזיל, לשימוש בultracentrifuge; לד ר אלכסנדר אפדס טורס ודניאל פרון, פרופסורים באוניברסיטודייד למשל ריו דה ז'ניירו, UFRJ, ברזיל, לשימוש של מאייד רוטרי; לפרופ ' רולנד בודמאייר וד ר אנדריי דאבצקי מהעיר הגרמנית בברלין, שסייעו במשאבים, סיפקה מתודולוגיות חדשות, והשגחת ACNTF במהלך 6 חודשי התמחות בבית ארסמוס + בגרמניה; לד ר רוג'יאנה צמאה ואלין פרנאנדס, פרופסור וטכנאי באוניברסיסיה הפדרלית, ריו דה ז'ניירו, UFRJ, ברזיל, לשימוש Zetasizer מלוורן; לבלומה גות'ר ולטסה רודריגז, פרופסור וטכנאי באוניברסיטדייד הפדרלי באוניברסיטת ריו דה ז'ניירו, UFRJ, ברזיל, לשימוש SEM; לד ר רייצ'ל אן האוזר דייוויס, חוקרת בפונדסאו אוסולדו קרוז, למלל נלווה. מחקר זה היה ממומן בחלקו על ידי המלון העליון, ברזיל (שכמיות)-קוד כספים 001 (גרנט No. 1627392; 1811605); על ידי הפונדה קרלוס צ'אס פילסו דה אמאפו à Pesquisa do אסטאדו דו ריו דה ז'ניירו (להעניק לא. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 ו-E-26/202.860/2016); על ידי Conselho הלאומי דה Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) (מענק No. 406601/2018-6), ו ככלכלית דה Estudos e Projetos (FINEP).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמוניום סולפטסיגמא-אולדריץ' ושותA4418
אנאליטיקל בלנס מטלר H10Twמטלר בע"מ417870
בקמן DU-640 ספקטרופוטומטרבקמן קולטר8043-30-1090
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-Aldrich Co5470
BUCHI Rotavapor R-300 מאייד סיבובי עם בקר ומשאבת V-300תרמו פישר סיינטיפיק05-001-022PM
CHEMS (כולסטרילהמיסוקסינט)Sigma-Aldrich CoC6512
ChloroformSigma-Aldrich Co48520-Uזהירות
נחושת (II) סולפט (פנטהידרט)Sigma-Aldrich Co209198
כיסויים (קוטר 13 מ"מ)Thermo Scientific NuncEW-01839-00
DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine)ליפואיד GMBH565600.1
אתנול אבסולוטסיגמא-אולדריץ' ושות'32205
Folin -Ciocalteu phenol reagentSigma-Aldrich CoF9252
GlutaraldehydeSigma-Aldrich CoG5882
HEPESSigma-Aldrich CoH3375
Hexamethyldisilazane (HMDS)Sigma-Aldrich Co440191זהירות
JEOL JSM-6460 LV Sacnning אלקטרונים מיקרוסקופJEOL בע"מ
מיני אקסטרודר 7אוונטי קוטב ליפידים610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- פוספו-אתנולמין-N-[אמינו (פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום)ליפואיד GMBH588200.1
אופטימה L-90k אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר PNLL-IM-12AB
מאגר פוספטסיגמא-אולדריץ' ושותP3619
פולי-ליזיןסיגמא-אולדריץ' CoP8920
אשלגן L-טרטרט מונו-בסיסיSigma-Aldrich Co243531
נתרן קרבונטSigma-Aldrich CoS7795
נתרן כלוריS7653
נתרן דאוקסיכולט (DOC)Sigma-Aldrich CoD6750
נתרן דודציל סולפטSigma-Aldrich CoL3771
נתרן הידרוקסידSigma-Aldrich CoS8045
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מיםSigma-Aldrich CoRES20908-A7
TESCAN VEGA 3 סריקת מיקרוסקופ אלקטרוניםTescan#657874
חומצה טריכלורואצטית (TCA)Sigma-Aldrich Co91230
Zetasizer Nano ZSPמלברן אנליטיקאי בע"מ
אמבט ניקוי אולטרסאונד דגם 2510ברנסון
' '

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1(2009).
  2. Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
  3. Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
  4. Ferreira, D. dS., Lopes, S. C. dA., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
  5. Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
  6. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102(2013).
  7. Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
  8. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  9. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
  10. Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
  11. Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
  12. Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
  13. Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
  14. Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
  15. Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
  16. Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471(2019).
  17. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  18. Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240(2018).
  19. Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. Janecek, M., Kral, R. , InTechOpen. (2016).
  20. Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
  21. dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737(2016).
  22. Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
  23. Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
  24. Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3(2003).
  25. Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים