Method Article

אופטימיזציה, עיצוב והימנעות החסרונות בתוך מולטיפלקס במגה ומין אימונוהיסטוכימיה

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכנולוגיה המתהווה של מולטיפלקס מאפשרת הדמיה של סוגי תאים מרובים בתוך הרקמה הקבועה, שאינה מוטבעת ברקמת פרפין (FFPE). הציגו הם הנחיות להבטחת מולטיפלקס 7-צבע מוצלח עם הוראות אופטימיזציה של נוגדנים וריאגנטים, הכנת שקופיות, עיצוב וטיפים להימנעות בעיות נפוצות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכה מיקרוסביבתית של רקמות שלמות לניתוח חדירת תאים וארגון מרחבי הינם חיוניים להבנת המורכבות של תהליכי המחלות. הטכניקות העיקריות המשמשות בעבר כוללות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו immunofluorescence (IF) המאפשרים ויזואליזציה של תאים כתמונה בזמן שימוש בין 1 ל 4 סמנים. לשתי הטכניקות יש חסרונות כולל קושי לצביעת מטרות מנוגדות ומגבלות לא מקושרות הקשורות לפעילות מחודשת במינים. IHC אמינים ומיושנים, אבל הטבע של הכימיה וההסתמכות על ספקטרום האור הנראה מאפשר רק כמה סמנים לשמש והופך שיתוף לוקליזציה מאתגרת. השימוש אם מרחיב סמנים פוטנציאליים אך בדרך כלל מסתמך על רקמות קפואות בשל הרקמה המקיפה של הרקמות האוטומטיות לאחר קיבוע פורמלין. Cy, שיטת זרימה, טכניקה המאפשרת תיוג סימולטני של אפיציסקופים מרובים, abrogates רבים של ליקויים של IF ו-IHC, עם זאת, הצורך לבחון תאים כהשעיה תא יחיד מאבד את ההקשר המרחבי של תאים להשליך ביולוגי חשוב יחסים. מולטיפלקס (mfIHC) מגשר על טכנולוגיות אלה ומאפשר הפנוטיפים סלולריים רב אפיטביים ברקמת פרפין קבוע מוטבע (FFPE) רקמה תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של המיקרו-סביבה ומרחבי קשר של תאים. בתוך רקמה שאינה מופרת בחוזק פלורסנט גבוהה fluorophores כי קשר בעוצמה לאפירופה רקמות מאפשר יישומים מרובים של הנוגדנים העיקריים ללא חשש של מינים החוצה פעילות משנית על ידי נוגדנים משני. למרות טכנולוגיה זו הוכח לייצר תמונות אמינות ומדויקות לחקר המחלה, תהליך יצירת אסטרטגיה שימושי mfIHC צביעת יכול להיות זמן רב ומדויק עקב אופטימיזציה ועיצוב נרחב. כדי ליצור תמונות חזקות המייצגות אינטראקציות סלולריות מדויקות באתרו ולהמתיק את תקופת האופטימיזציה לניתוח ידני, מוצגות כאן שיטות להכנת שקופיות, אופטימיזציה של נוגדנים, עיצוב מולטיפלקס, כמו גם שגיאות נתקל בדרך כלל במהלך תהליך הצביעת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ויזואליזציה של מיקרוסביבה הגידול ללא פגע (TME) הוא חיוני בהערכת לא רק חדירה תאית בגידולים ממאירים מוצק אלא גם תא לאינטראקציות תאים. מולטיפלקס אימונוהיסטוכימיה (mfihc) התפתחה ככלי יעיל עבור מולטי אנטיגן פנוויקליד של תאים במחקר של סרטן ומחלות הקשורות1,2,3,4, 5,6,7. זאת, בשילוב עם תוכנות ותוכניות הרומן שנועדו לנתח ערכות נתונים גדולות, מאפשר התבוננות באינטראקציות מורכבות בין תאים1,2<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל העבודה אושרה על ידי לוח הביקורת הפנימית של אוניברסיטת מישיגן.

1. מיטוב נוגדנים ראשוניים והכנת שקופיות

  1. קביעת הריכוז האידיאלי של נוגדנים עבור מולטיפלקס באמצעות IHC קונבנציונאלי.
    1. בדקו את הנוגדנים לקולנוע באמצעות האימונוהיסטוכימיה הידנית (IHC)13.
    2. השתמש ברקמות ספציפיות שיש להם סוג תא שופע עבור כל נוגדן נבדק כגון באמצעות רקמת שקדים עבור בדיקות CD3 נוגדן.
    3. השתמש בריכוז הייחוס עבור IHC המומלץ על ידי החברה ולאחר מכן מלא IHC עם ריכוזי נוגדנים בריכוזים המומלצים, כמו גם ריכוזים מעל ומתחת לריכוז המומלץ.
  2. הכינו את הרקמה המוטבעת. של פורמאלין לשקופיות
    1. באמצעות מיקרוטומ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התהליך הכולל של קבלת שיטת מולטיצבעוניות בעלת 7 צבעים מלווה בדפוס חוזר. איור 1 מתאר את התהליך בצורת דיאגרמה. ברגע שהגלשות מיובשות ומתייבשות או מתקבלות מהמעבדה ומעואפות בתנור הכלאה ב-60 ° c עבור 1, לאחר מכן המשיכו לדאפיזציה ומחזור, לתקן את השקופיות בפורמאלין שוב ולאחר מכן לאחר מכן על ידי אחזור אנטיגן. כל סיבוב של ריבוב מתחיל באחזור אנטיגן וגימורים בהסרת נוגדנים (איור 1).

אופטימיזציה של כל שלב בתהליך הוא העליונה כדי להשיג תמונה ברורה ושמ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות רקמה שלמה של ביופסיה הגידול מוצק כריתת כירורגית להישאר כלים אבחון וחיזוי חשוב לניתוח מחלות, כמו גם פרוגנוזה המטופל. מולטיפלקס (mfIHC) היא טכניקה חדשנית המשלבת את היתרונות של אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy,. השיטות הקודמות כדי לחקור את התאים באתרו הורשו הערכה של תא אל התא הסדרים בסביבה רקמה8, עם זאת, המספר הנמוך של האפיסקופים כי יכול להיות נחקר מגביל ניתוח מורכב. הזרימה cy, למרות שימושי בניתוח סוגי תאים רבים בדגימה, מאבד הקשר מרחבי על ידי הכוח של הכנת דגימות כמו תא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לאד סטאק, בעבר Perkin אלמר, על עזרתו עם התקנה ואופטימיזציה של הצביעת המקורי של הקולנוע. המחברים רוצים גם להודות לקריסטן שמידט מתוך מדעי הביולוגיה לטיפים באמצעות תוכנת הניתוח. מחקרים שדווחו בפרסום זה נתמכים על ידי המכון הלאומי לבריאות הסרטן תחת הפרס מספר P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. תמיכה נוספת סופקה על ידי Jeffery A. קולבי קולון סרטן ו טום ליאו מחקר קרנות.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% אתנולפישרHC8001GAL
70% אתנולפישרHC10001GL
95% אתנולפישרHC11001GL
תוכנה לניתוחAkoya BiosciencesCLS135783inForm גרסה 2.3.0
Antifademountant ThermoFisherP36961ProLong
פתרון חסימת יהלוםוקטורSP-6000Bloxall
בקר סרום אלבומין (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
תלושי כיסויפישר12-548-5E
ניגוב משימות עדיןKimberly-Clark34120
מדלל פלואורסצנטיAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA מדלל
פלואורופור 520אקויה BiosciencesFP1487001KT1:100
Fluorophore 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluorophore 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluorophore 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluorophore 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluorophore 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluorophore DAPIAkoya BiosciencesFP14903 טיפות בקופסה עמידה בחום TBST או PBS
Tissue-Tek25608-904קופסת שקופיות מפלסטיק-תא
לחIbi ScientificAT-12
תנור היברידיזציהFisherBiotech
עט מחסום הידרופוביוקטורH-4000מיקרוסקופ ImmEdge
פרקין אלמרCLS140089מנטרה תחנת עבודה לפתולוגיה כמותית
מיקרוגלPanasonicNN-A661Sעם טכנולוגיית אינוורטר
פורמלין ניטרלי מאגרפישר סיינטיפיקSF100-410% ניטרלי חוצץ פורמלין
pH 6 מאגר אחזור אנטיגןAkoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 מאגר אחזור אנטיגןAkoya BiosciencesAR900AR9
פוספט חוצץ מלחפישרBP3994PBS
קופסת שקופיות פלסטיקTissue-Tek25608-906
ניילון פלסטיקפישרNC9070936
פוליסורבט 20פישרBP337-800טווין 20
ראשוני נוגדן CD163LeciaNCL-LCD1631:400
נוגדן ראשוני CD3DakoA04521:400
נוגדן ראשוני CD8Spring BioM53901:400
נוגדן ראשוני FOXP3DakoM35151:400
נוגדן ראשוני PancytokeratinCell Signaling126531:500
נוגדן ראשוני תא PD-L1 איתות136841:200
נוגדן משניAkoya BiosciencesARH1001EAפולימר אופל
סט כתמי שקופיותמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית6254001
Tris חוצץ מי מלחקורנינג46-012-CMTBS
מתלה שקופיות אנכימדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית50-294-72
קסילןפישר
ירוק X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex Fluorescent ImmunohistochemistryFormalin Fixed Paraffin Embedded TissueAntibody OptimizationMultiplex DesignSlide PreparationAntigen RetrievalFluorophore ApplicationMonoplex AssaySpatial AnalysisTumor Microenvironment

Related Articles