הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אופטימיזציה, עיצוב והימנעות החסרונות בתוך מולטיפלקס במגה ומין אימונוהיסטוכימיה

9.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59915

⸱

26 ביולי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

במאמר זה

סיכום

הטכנולוגיה המתהווה של מולטיפלקס מאפשרת הדמיה של סוגי תאים מרובים בתוך הרקמה הקבועה, שאינה מוטבעת ברקמת פרפין (FFPE). הציגו הם הנחיות להבטחת מולטיפלקס 7-צבע מוצלח עם הוראות אופטימיזציה של נוגדנים וריאגנטים, הכנת שקופיות, עיצוב וטיפים להימנעות בעיות נפוצות.

תקציר

הערכה מיקרוסביבתית של רקמות שלמות לניתוח חדירת תאים וארגון מרחבי הינם חיוניים להבנת המורכבות של תהליכי המחלות. הטכניקות העיקריות המשמשות בעבר כוללות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו immunofluorescence (IF) המאפשרים ויזואליזציה של תאים כתמונה בזמן שימוש בין 1 ל 4 סמנים. לשתי הטכניקות יש חסרונות כולל קושי לצביעת מטרות מנוגדות ומגבלות לא מקושרות הקשורות לפעילות מחודשת במינים. IHC אמינים ומיושנים, אבל הטבע של הכימיה וההסתמכות על ספקטרום האור הנראה מאפשר רק כמה סמנים לשמש והופך שיתוף לוקליזציה מאתגרת. השימוש אם מרחיב סמנים פוטנציאליים אך בדרך כלל מסתמך על רקמות קפואות בשל הרקמה המקיפה של הרקמות האוטומטיות לאחר קיבוע פורמלין. Cy, שיטת זרימה, טכניקה המאפשרת תיוג סימולטני של אפיציסקופים מרובים, abrogates רבים של ליקויים של IF ו-IHC, עם זאת, הצורך לבחון תאים כהשעיה תא יחיד מאבד את ההקשר המרחבי של תאים להשליך ביולוגי חשוב יחסים. מולטיפלקס (mfIHC) מגשר על טכנולוגיות אלה ומאפשר הפנוטיפים סלולריים רב אפיטביים ברקמת פרפין קבוע מוטבע (FFPE) רקמה תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של המיקרו-סביבה ומרחבי קשר של תאים. בתוך רקמה שאינה מופרת בחוזק פלורסנט גבוהה fluorophores כי קשר בעוצמה לאפירופה רקמות מאפשר יישומים מרובים של הנוגדנים העיקריים ללא חשש של מינים החוצה פעילות משנית על ידי נוגדנים משני. למרות טכנולוגיה זו הוכח לייצר תמונות אמינות ומדויקות לחקר המחלה, תהליך יצירת אסטרטגיה שימושי mfIHC צביעת יכול להיות זמן רב ומדויק עקב אופטימיזציה ועיצוב נרחב. כדי ליצור תמונות חזקות המייצגות אינטראקציות סלולריות מדויקות באתרו ולהמתיק את תקופת האופטימיזציה לניתוח ידני, מוצגות כאן שיטות להכנת שקופיות, אופטימיזציה של נוגדנים, עיצוב מולטיפלקס, כמו גם שגיאות נתקל בדרך כלל במהלך תהליך הצביעת.

מבוא

ויזואליזציה של מיקרוסביבה הגידול ללא פגע (TME) הוא חיוני בהערכת לא רק חדירה תאית בגידולים ממאירים מוצק אלא גם תא לאינטראקציות תאים. מולטיפלקס אימונוהיסטוכימיה (mfihc) התפתחה ככלי יעיל עבור מולטי אנטיגן פנוויקליד של תאים במחקר של סרטן ומחלות הקשורות1,2,3,4, 5,6,7. זאת, בשילוב עם תוכנות ותוכניות הרומן שנועדו לנתח ערכות נתונים גדולות, מאפשר התבוננות באינטראקציות מורכבות בין תאים1,2,4. גורם הגבלת הקצב ברכישת נתונים הוא לעתים קרובות איכות הרקמה המוכתמת לפני ניתוח.

הטכניקות הקודמות השתמשו כדי להתאים את התאים ב-TME כוללים אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy, שכולם מהווה מגבלות משמעותיות. IHC משתמשת במקטעי פרפין קבועים (FFPE) משובצים ברקמות שאינן מוכתמים לפני הכתם על ידי נוגדן אחד לרוב. השימוש של חזרת peroxidase (HRP) נוגדן משני מאוגד ותגובה כימית מאפשר ויזואליזציה של אפיגניים אחד נגד הגנים8. בעוד IHC הוא אמין ומבוצע על רקמת FFPE אשר קל לעבוד עם, מגבלות על ספקטרום אור גלוי פירושו רק אחד או שניים סמנים יכול להיות אמין מכובד ולוקליזציה של אנטיגנים די קשה8. דרך להרחיב סמנים זמינים ולכן אנטיגנים שניתן לנחקר על מקטע אחד היא לשנות את הזריחה המאפשרת להשתמש במגוון רחב יותר של הספקטרום החזותי. עבור IF, מוקפא או רקמת FFPE מועבר על שקופיות ונוגדנים בשימוש כי הם מושכן fluorophores שונים. בעוד זה מגדיל את מספר אנטיגנים שניתן לנחקר, קיימות מספר מגבלות חשובות. ראשון, כי כל נוגדן בדרך כלל רק מצורף אחד fluorophore הבהירות היא לעתים קרובות לא חזק מספיק כדי להתגבר על הרקמה האוטומטית של רקמות. מסיבה זו, רוב IF מבוצע על רקמות קפואות אשר יקר לאחסן וקשה לעבוד עם. מספר מצומצם של תגי פלורסנט זמינים לשימוש עקב חפיפה ספקטרלית ומינים לחצות פעילות מחודשת במיוחד כאשר נוגדנים לא מצובית משמשים. זרימה cy, אשר מורכב עיבוד רקמות טריות לתוך השעיה תא אחד ותיוג עם נוגדנים פלורסנט היה תקן זהב עבור immunophenotyping קלדה במשך עשורים9,10. היתרון של cytometry זרימה היא היכולת לתייג נוגדנים מרובים בלי לדאוג מינים לחצות פעילות מחדש כמו רוב מצוחים. בגלל התאים הם "דמיינו" על ידי מכונה ולא העיניים האנושיות, יש fluorophores הרבה יותר זמין אבל זה מגיע עם עלות. יש לבצע פיצוי באופן ידני שיכול לשנות באופן משמעותי את התוצאות המייצרות אוכלוסיות חיוביות ושליליות כוזבות. המגבלה המשמעותית ביותר של הזרימה cy, מנסה להיות בארכיטקטורת רקמות ולאחר מכן כל מידע מרחבי אובד על-ידי הצורך עבור תאים בודדים ההשעיה.

באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט אוטומטי בשילוב עם התוכנה הרומן משלבת את היתרונות של ihc, IF וזרימה cy, לנסות על ידי מתן מכתים רקמות רב אנטיגן עם הגברה האות ו שמירה על מערכות יחסים מרחבית ללא צורך בפיצוי. רקמת FFPE מושם על שקופיות טעונה אשר, לאחר אחזור אנטיגן, לעבור סיבוב של יישום הנוגדן העיקרי אנטיגן היעד של עניין ואחריו נוגדן משני עם תג כימי HRP, דומה ל-IHC. לאחר המיקום של הנוגדן המשני, תגובה מסוימת HRP התוצאות מחייב מחייבת fluorophore כריכה האפירופה של ריבית11. לאחר הרקמה מתויג, סיבוב נוסף של חימום השקופיות הושלמה הסרת מורכב הנוגדן העיקרי הקודם והמשני משאיר רק את תג פלורסנט מאוגד לרקמות הרקמה11. הדבר מאפשר למרוח מחדש נוגדנים מרובים של מינים כלשהם מבלי לדאוג לפעילות חוצת-שתיים11,12. כדי למזער כל צורך פיצוי ידני של צבעי פלורסנט מרובים, אוסף של fluorophores עם חפיפה מעט ספקטרלית כולל כתם גרעיני משמש להשלמת mfIHC. כדי להסביר את הגרסה האוטומטית הנתקלת עם רקמת FFPE, התוכנה מפחית את הקרינה האוטומטית מהתמונה הסופית באמצעות תמונה משקופית ריקה האפשרית בגלל כוחה של אנטיגן מסוים של פלואורסצנטית הבאים fluorophore . הגברה של האות שימוש בתוכניות הרומן המיועדות לערכות נתונים גדולות, ניתן לזהות ולנתח מיקומי תאים עבור הקשר מרחבי1,2,4. המגבלה המשמעותית ביותר של טכניקה זו היא זמן אופטימיזציה. מתודולוגיה מפורטת עם הנחיות לתכנון ניסיוני ולצביעת ואסטרטגיית דימות נמצאה כאן. mfIHC יהיה שימושי עבור מעבדות כי לא כרגע יש מערכת ממוטבת מכתים אוטומטית שרוצה להבין טוב יותר את ההקשר המרחבי של האינטראקציה תא לתאים ברקמת FFPE שלמים באמצעות הטכניקה הידנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העבודה אושרה על ידי לוח הביקורת הפנימית של אוניברסיטת מישיגן.

1. מיטוב נוגדנים ראשוניים והכנת שקופיות

  1. קביעת הריכוז האידיאלי של נוגדנים עבור מולטיפלקס באמצעות IHC קונבנציונאלי.
    1. בדקו את הנוגדנים לקולנוע באמצעות האימונוהיסטוכימיה הידנית (IHC)13.
    2. השתמש ברקמות ספציפיות שיש להם סוג תא שופע עבור כל נוגדן נבדק כגון באמצעות רקמת שקדים עבור בדיקות CD3 נוגדן.
    3. השתמש בריכוז הייחוס עבור IHC המומלץ על ידי החברה ולאחר מכן מלא IHC עם ריכוזי נוגדנים בריכוזים המומלצים, כמו גם ריכוזים מעל ומתחת לריכוז המומלץ.
  2. הכינו את הרקמה המוטבעת. של פורמאלין לשקופיות
    1. באמצעות מיקרוטומה, בלוקים לחתוך של רקמת ffpe בעובי בין 4 ו 6 יקרומטר ולהחיל על שקופיות טעונה.
      הערה: השימוש במים מזוקקים מבטיח הרכבה נכונה של רקמות ודבקות ברחבי הקולנוע.
    2. מניחים את השקופיות שטוחות, בצד הרקמה מעלה, ומאפשרים להתייבש ב-37 ° c למשך הלילה.
    3. אחסן שקופיות בתיבת שקופיות הרחק מטמפרטורה קיצונית עד שתהיה מוכן להשלמת המגה-בית.

2. שיטת הצביעת הכללי

  1. הכנת פתרונות כביסה ואחזור אנטיגן
    1. הכינו את פתרון השטיפה של 0.1% TBST על ידי ערבוב 9 L של מים מיוהים, 1 L של מלוחים באגירה טריס (TBS) ו-10 מ ל של פוליסורbate 20.
    2. להכין הן פתרונות אחזור אנטיגן (pH 6 ו-pH 9; רשימת חומרים) על-ידי דילול ל-1x עם מים מאוהים.
  2. לחות והתחדשות
    1. לאפות שקופיות, שוכב שטוח, רקמות למעלה ב 60 ° c עבור 1 h בתנור הכלאה1. הסר שקופיות מהתנור ואפשר לצנן לפחות 5 עד 10 דקות מקום במדף שקופיות אנכי.
    2. פנקו את השקופיות בפתרונות הבאים ברציפות: קסילן ב טרילקאט, ואחריו טיפול יחיד של 100% אתנול, 95% אתנול, ולבסוף 70% אתנול עבור 10 דקות כל אחד באמצעות מכתים שקופית ערכת1.
    3. שטוף את מתלה השקופיות במשך 2 דקות עם מים מיוהים על-ידי שטיפה בתיבת שקופיות פלסטיק ולאחריה קיבוע על-ידי שטיפת שקופיות בתיבת פלסטיק מלאה בפורמאלין נייטרלי עבור 30 דקות13. לשטוף את השקופיות במים מוכי 2 דקות ולאחר מכן להמשיך לאחזור אנטיגן.
  3. שליפת אנטיגן
    1. מניחים את מתלה השקופיות לתוך תיבה עמידים בחום ממולא לקו הפנימי (כ 300 mL) עם מאגר אחזור אנטיגן של pH 6 או pH 9.
      הערה: מאגר אחזור אנטיגן יכול להיות pH 6 או pH 9 אשר עשוי להיות ממוטב לכל אפיפי. עם זאת, להתחיל באמצעות pH 9 עבור נוגדנים הכרוך באפיסקופים גרעיניים ו-pH 6 עבור כל הנוגדנים אחרים.
    2. כסו את הקופסה בניילון נצמד והשתמשו בגומייה כדי לאבטח. מניחים את התיבה לתוך המיקרוגל בקצה הצלחת מסתובבת (מיקרוגל חייב להיות מצויד בטכנולוגיה מהפך לחימום אפילו). לחמם את השקופיות עבור 45 s ב 100% כוח ואחריו 15 דקות ב 20% כוח13.
      הערה: טיפול במיקרוגל עשוי להזדקק למיטוב בהתאם למיקרוגל שבשימוש.
    3. תנו לשקופיות להתקרר במשך כ-15-20 דקות.
  4. הכינו פתרונות עבודה של נוגדנים ו-fluorophores תוך שקופיות קריר.
    1. להכין את הנוגדן העיקרי מדלל על ידי המסת 0.5 g של סרום הפרה אלבומין לתוך 50 mL של TBST. לחילופין, השתמש 50 mL של מלוחים 1 x פוספט מאגור (PBS) כדי לפזר גרגירים.
    2. להפוך כל נוגדן העיקרי לעבוד פתרון ריכוז אופטימיזציה נקבע בסעיף 1, את הנוגדן העיקרי מדלל. הערכת כ-200 μL לכל שקופית.
    3. להכין את הפתרון fluorophore לעבוד על ידי דילול כל fluorophore ב fluorophore מדלל בריכוז של 1:100.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב בהתאם לנוגדן. הערכת כ-100 μL לכל שקופית.
    4. ביום האחרון של כתמים, להכין את 4 ′, 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) פתרון העבודה על ידי הוספת 3 טיפות של DAPI לתוך 1 מ ' TBST.
  5. מכתים שקופית (כביסה וחסימה)
    1. להסיר את הקופסה מהמייקרוגל לאחר קירור ולהסיר את עטיפת הפלסטיק, לשטוף את השקופיות עם מים מוכי עבור 2 דקות ואחריו 2 דקות לשטוף בתיבת שקופית פלסטיק מלא TBST13.
    2. לאחר ייבוש כל שקופית סביב הרקמה עם מחיקה עדין משימה להיזהר לא לתת את הרקמה להתייבש, מעקב סביב החלק החיצוני של הרקמה באמצעות עט המכשול הידרופובי. אין לגעת ברקמה עם מחיקה או עט משימה עדינה.
    3. מניחים כל שקופית בחדר החות ומוסיפים פתרון חסימה (כ -4 טיפות) לרקמה. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  6. מכתים שקופית (יישום נוגדן ראשי)
    1. קח כל שקופית והסר את פתרון החסימה על-ידי הקשה על צד השקופית על ערימת מגבות נייר ובאמצעות מחיקה עדינה של משימה כדי להסיר סוכן חוסם עודף מסביב לרקמה.
    2. הנח את השקופית חזרה לתוך החדר מחולל לחות ולהוסיף כ 200 μL של הנוגדן הראשי עובד. מודטה בחדר מחולל לחות במשך 1 h ב RT.
    3. לשטוף עם TBST עבור 2 דקות על ידי שייט בטריליטה13.
      הערה: לאחר כל צעד שוטף, שינוי ה-TBST יסייע להבטיח דימוי נקי יותר.
  7. החלקת צביעת (יישום נוגדן משני)
    1. ביטול של TBST הנותרים מכל שקופית ולהחיל כ 3 כדי 4 טיפות של נוגדן משני (תערובת של ארנב ועכבר משני HRP נוגדנים מצופנים). המשך 10 דקות בחדר המיחולל. בשעה13
      הערה: אם מתכנן להשתמש בנוגדן העיקרי המחייב נוגדן משני מאשר עכבר או ארנב או בחירה להשתמש בנוגדן משני חלופי, להחיל את HRP המתאים מעלה משני לשקופיות ו-הדגירה ב-RT עבור 45 דקות. אופטימיזציה של זמן דגירה עשוי להיות צורך עבור השני החלופי14.
    2. לאחר הדגירה, לשטוף עם TBST עבור 2 דקות בטרילקאט13.
  8. צביעת שקופיות (יישום fluorophore)
    1. החל כ 100 μL של פתרון העבודה fluorophore ו הדגירה בחדר מחולל לחות ב-RT עבור 10 דקות13.
    2. לשטוף עם TBST עבור 2 דקות בטריליטה13.
  9. הסרת נוגדנים
    1. שקופיות מיקרוגל (45 s ב 100% לאחר מכן 15 דקות ב -20%) בתיבה עמיד בחום (ראה שלב 2.3.2) להסרת נוגדנים13,14.
      הערה: הדבר משלים סיבוב אחד של המגה-פלקס. זוהי הנקודה היחידה שבה ניתן להשהות את הפרוטוקול. כדי להשהות את הפרוטוקול, השאר את השקופיות מתחת למאגר אחזור האנטיגן לילה בטמפרטורת החדר.
  10. המשך סיבובים נוספים של כתמים. חזור על הצעדים 2.5.1-2.9.1 עבור שאר הצמדים-fluorophore. לאחר כל נוגדנים fluorophores השתמשו, להמשיך בסעיף 2.11.
  11. יישום DAPI והרכבה
    1. לאחר הסיבוב האחרון הכתים בתוך הקולנוע, להסיר את יישום הנוגדן האחרון עם הפתרון לאחזור אנטיגן pH 613. לשטוף עם מים מוכי ואחריו TBST עבור 2 דקות כל13.
    2. החל כ 150 μL של פתרון DAPI העבודה לשקופיות ו-דגירה בחדר מחולל לחות עבור 10 דקות ב-RT1.
    3. לשטוף עם TBST עבור כ 30 s ואת הכיסויים מחליק עם השוטר נגד עמעום. החל לק ציפורן ברור בארבע פינות של שמיכות פעם אחת המדיה ההרכבה התייבש כדי לאבטח coverslip (אופציונלי).

3. פרטים עבור הספריה, מונוליסים ומולטיפלקס

  1. בחרו שקופיות לבניית ספריית פלואורואופפור.
    1. עבור הקולנוע 7-צבע לאסוף 7 תאים חיסוניים שקופיות רקמות עשירות (כלומר, tonsil, טחול, וכו ') עבור הספריה.
      הערה: בחר שקופיות בקרה שישמשו עבור ספריית fluorophore עם כל שקופית המייצגת כל פלואורואופפור ייחודיים שישמשו במגה-בית. שקופיות בקרה צריך להיות אפירופה שופע של הבחירה יכול להיות אותו סוג של רקמות עבור כל fluorophore.
  2. שקופיות של ספריות כתמים ותמונות לשימוש עם מונוקסים וריבוב.
    1. בצע את השלבים 2.1 ל2.9.1 באמצעות שקופיות הבקרה ובקרת שקופיות רקמת הבחירה. מניחים פלואורואופפור שונים על כל שקופית בריכוז של 1:100; שקופית אחת צריכה להכיל DAPI בלבד.
    2. המשך לסעיף 2.11 למעט השמטת צביעת DAPI ובמקום זאת השתמש ב-TBST ו-mount כמתואר.
    3. לאחר שנתן שקופיות יבש בן לילה, התמונה עם כל הערוצים DAPI, CY3, CY5, CY7, טקסס האדום, מוליך למחצה נקודות קוואנטום, ופלואורואסעין isothiocyanate (FITC) הגדרת החשיפה 250 ms עם הגנה על הרוויה תכונה1.
      הערה: ניתן לקבוע את זמני החשיפה ב-50-250 ms13.
    4. העלה את תמונות הספרייה אל התוכנה והשתמש בניתוח של מונוליסים ומולטיפלקס.
  3. בחר שקופיות עבור מונוליסים.
    1. בחר שקופיות בקרה בעלי אפירופה שופע של בחירה המבוססת על נוגדנים ממוטבים (סעיף 1). עבור כל סיבוב של כתמים להתבצע באולמות הקולנוע, בחר את מספר שקופיות הבקרה כדי ליצור מונוליסים.
      הערה: מטרת הונולקס היא לקבוע את המיקום הטוב ביותר (סדר) עבור כל נוגדן לשמש בחדרי הקולנוע.
  4. . כתמי מונוליסים
    1. בצע את סעיפים 2.1 ל2.11 באמצעות הנוגדן העיקרי בסדר אחר (מיקום) עבור כל אחת מהשקופיות. כל שקופית צריכה להיות רק נוגדן ראשי אחד שהוחל בסדר (מיקום) שונה מהשקופיות האחרות.
      הערה: עבור כל שקופית שבה הסיבוב קורא ללא נוגדן ראשוני או fluorophore במקום זאת להשתמש נוגדן העיקרי דילול ו fluorophore מדלל13.
  5. תמונה שקופיות ולנתח את הונולקס.
    1. באמצעות המיקרוסקופ וקביעת זמן חשיפה ל 250 ms עבור כל הערוצים ללכוד כל תמונה ניצול DAPI להתמקד.
      הערה: ניתן לקבוע את זמני החשיפה ב-50/250 אלפיות14.
    2. באמצעות תוכנת הניתוח להעריך כל שקופית מונולקס על ידי מסתכל על עוצמת פלורסנט של סמן מוכתם.
    3. השווה עוצמה זו לרקע. אם הוא גבוה פי 5 מאשר ברקע, מיקומו של שקופית זו הוא מיקום אופטימלי לשימוש בבית הקולנוע הסופי.
  6. בחרו שקופיות למגה-פלקס.
    1. בחר את שקופיות הריבית והוסף שקופית נוספת שישמשו כשקופית ריקה עבור חיסור של פלואורסצנטית אוטומטי לאחר כתמים והדמיה.
  7. . להכתים את הקולנוע
    1. בהתבסס על תוצאות מונולקס, לבחור את הסדר המתאים (עמדות) עבור כל נוגדן מבוסס על שלב 3.5.3. הקצה כל פלואורואופפור לנוגדן.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך במיטוב; עם זאת, תוכנית להשתמש בנוגדנים בהירים עבור סמנים שופע פחות1, שיתוף נוגדנים לוקליזציה צריך להיות מותאם עם fluorophores במרחק נסרה מן השני13, ו fluorophores עם הספקטרום 540 ו 570 לא צריך להיות שיתוף מקומי בשל לחפיפה ספקטרלית בעיות1.
    2. המשך עם סעיפים 2.1-2.11 המבטיח שהשקופית הריקה אינה מקבלת נוגדן ראשוני, fluorophore או DAPI, במקום זאת להשתמש בנוגדן מדלל, fluorophore מדלל, ו TBST בהתאמה במקומו.
  8. מולטיפלקס תמונה ולנתח עבור תקינות של צביעת
    1. באמצעות המיקרוסקופ וקביעת זמן חשיפה ל 250 ms עבור כל הערוצים, ללכוד כל תמונה ניצול DAPI להתמקד.
    2. באמצעות תוכנת הניתוח (טבלה של חומרים), להעריך כל מולטיפלקס על ידי צבע שווא פלורסנט.
      הערה: תמונה ברורה צריך להדגים כל סמן בבירור. אם הסמן נראה מפוזר או גרעינית או לא קיים, סביר להניח כי הסמן לא עבד וצריך להיות ממוטב מחדש.
    3. באמצעות תוכנת הניתוח, הערך כל מולטיפלקס באמצעות מראה פתולוגיה. הראייה הפתולוגית תאשר. את הספציפיות של כל סמן השווה ל-IHC בעבר אופטימיזציה (סעיף 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התהליך הכולל של קבלת שיטת מולטיצבעוניות בעלת 7 צבעים מלווה בדפוס חוזר. איור 1 מתאר את התהליך בצורת דיאגרמה. ברגע שהגלשות מיובשות ומתייבשות או מתקבלות מהמעבדה ומעואפות בתנור הכלאה ב-60 ° c עבור 1, לאחר מכן המשיכו לדאפיזציה ומחזור, לתקן את השקופיות בפורמאלין שוב ולאחר מכן לאחר מכן על ידי אחזור אנטיגן. כל סיבוב של ריבוב מתחיל באחזור אנטיגן וגימורים בהסרת נוגדנים (איור 1).

אופטימיזציה של כל שלב בתהליך הוא העליונה כדי להשיג תמונה ברורה ושמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דגימות רקמה שלמה של ביופסיה הגידול מוצק כריתת כירורגית להישאר כלים אבחון וחיזוי חשוב לניתוח מחלות, כמו גם פרוגנוזה המטופל. מולטיפלקס (mfIHC) היא טכניקה חדשנית המשלבת את היתרונות של אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy,. השיטות הקודמות כדי לחקור את התאים באתרו הורשו הערכה של תא אל התא הסדרים בסביבה רקמה8, עם זאת, המספר הנמוך של האפיסקופים כי יכול להיות נחקר מגביל ניתוח מורכב. הזרימה cy, למרות שימושי בניתוח סוגי תאים רבים בדגימה, מאבד הקשר מרחבי על ידי הכוח של הכנת דגימות כמו תא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים רוצים להודות לאד סטאק, בעבר Perkin אלמר, על עזרתו עם התקנה ואופטימיזציה של הצביעת המקורי של הקולנוע. המחברים רוצים גם להודות לקריסטן שמידט מתוך מדעי הביולוגיה לטיפים באמצעות תוכנת הניתוח. מחקרים שדווחו בפרסום זה נתמכים על ידי המכון הלאומי לבריאות הסרטן תחת הפרס מספר P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. תמיכה נוספת סופקה על ידי Jeffery A. קולבי קולון סרטן ו טום ליאו מחקר קרנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100% אתנולפישרHC8001GAL
70% אתנולפישרHC10001GL
95% אתנולפישרHC11001GL
תוכנה לניתוחAkoya BiosciencesCLS135783inForm גרסה 2.3.0
Antifademountant ThermoFisherP36961ProLong
פתרון חסימת יהלוםוקטורSP-6000Bloxall
בקר סרום אלבומין (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
תלושי כיסויפישר12-548-5E
ניגוב משימות עדיןKimberly-Clark34120
מדלל פלואורסצנטיAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA מדלל
פלואורופור 520אקויה BiosciencesFP1487001KT1:100
Fluorophore 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluorophore 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluorophore 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluorophore 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluorophore 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluorophore DAPIAkoya BiosciencesFP14903 טיפות בקופסה עמידה בחום TBST או PBS
Tissue-Tek25608-904קופסת שקופיות מפלסטיק-תא
לחIbi ScientificAT-12
תנור היברידיזציהFisherBiotech
עט מחסום הידרופוביוקטורH-4000מיקרוסקופ ImmEdge
פרקין אלמרCLS140089מנטרה תחנת עבודה לפתולוגיה כמותית
מיקרוגלPanasonicNN-A661Sעם טכנולוגיית אינוורטר
פורמלין ניטרלי מאגרפישר סיינטיפיקSF100-410% ניטרלי חוצץ פורמלין
pH 6 מאגר אחזור אנטיגןAkoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 מאגר אחזור אנטיגןAkoya BiosciencesAR900AR9
פוספט חוצץ מלחפישרBP3994PBS
קופסת שקופיות פלסטיקTissue-Tek25608-906
ניילון פלסטיקפישרNC9070936
פוליסורבט 20פישרBP337-800טווין 20
ראשוני נוגדן CD163LeciaNCL-LCD1631:400
נוגדן ראשוני CD3DakoA04521:400
נוגדן ראשוני CD8Spring BioM53901:400
נוגדן ראשוני FOXP3DakoM35151:400
נוגדן ראשוני PancytokeratinCell Signaling126531:500
נוגדן ראשוני תא PD-L1 איתות136841:200
נוגדן משניAkoya BiosciencesARH1001EAפולימר אופל
סט כתמי שקופיותמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית6254001
Tris חוצץ מי מלחקורנינג46-012-CMTBS
מתלה שקופיות אנכימדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית50-294-72
קסילןפישר
ירוק X3P1GAL

מקורות

  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880(2018).
  3. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  4. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
  5. Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
  6. Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  7. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
  8. Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
  9. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  10. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  11. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  12. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  13. Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32(2016).
  14. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
  15. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

רקמה מקובעת בפורמלין ומוטמעת בפראפיןאופטימיזציית נוגדניםתכנון מולטיפלקסהכנת סליידיםהשבת אנטיגןיישום פלואורופורבדיקת מונופלקסניתוח מרחבימיקרו-סביבת הגידול
אופטימיזציה, עיצוב והימנעות החסרונות בתוך מולטיפלקס במגה ומין אימונוהיסטוכימיה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.