מאמר שיטה

מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה

DOI:

10.3791/59930

⸱

30 באוקטובר 2019

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר, ובדיקה משותפת המשמשת להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. מדידת התפשטות היא, לכן, שימוש תכוף בביולוגיה התא. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, רב-תכליתית של מדידת התפשטות כי ניתן להשתמש בתאים חסיד ושאינם חסיד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת של תא להתרבות היא בלתי נפרד לתפקוד הרגיל של רוב התאים, והדיסרגולציה של התפשטות היא בלב תהליכי מחלות רבים. מסיבות אלה, מדידת ההפצה היא כלי נפוץ המשמש להערכת הפונקציה cell. ניתן למדוד את תפוצת התא רק על ידי ספירה; עם זאת, זהו אמצעי עקיף למדידת התפשטות. אחד האמצעים השכיחים של במישרין זיהוי תאים הכנת לחלק הוא על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. אלה כוללים את הרדיו האנלוגי נוקלאוטיל 3H-thymidine פלוס non-רדיואקטיבי נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' Deoxyuridine (bromo) ו-5-ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU). התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, אשר יש מספר יתרונות כאשר בהשוואה BrdU. בדוח זה, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התפשטות באמצעות התאגדות של EdU. פרוטוקול זה כולל אפשרויות לקריאות שונות, יחד עם היתרונות והחסרונות של כל אחד מהם. אנו גם דנים במקומות שבהם הפרוטוקול יכול להיות ממוטב או שונה כדי לענות על הצרכים הספציפיים של הניסוי המתוכנן. לבסוף, אנו נוגעים בדרכים כי פרוטוקול בסיסי זה ניתן לשנות עבור מדידת מטבוליטים תא אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר1,2. שליטה על התפשטות ההשפעות על תהליכים נורמליים כגון פיתוח, תהליכים פתולוגיים כגון סרטן ומחלות לב וכלי דם. צמיחה היפרפלסטית של תאים שריר וסקולריים חלקה, למשל, הוא חשב להיות הקודמן טרשת עורקים3. שינויים בתפוצת התאים משמשים גם להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. בהתחשב בהשפעה הנרחבת שלה, מדידת ההפצה היא התווך של מעבדות רבות בביולוגיה המבוססת על תאים.

ניתן למדוד את תפוצת התא על-ידי ספירת תאים בלבד אם אוכלוסיית הריבית מתפצלת במהירות רבה. עבור תאים הגדלים לאט יותר, ספירת תאים עשויה להיות פחות רגישה. התפשטות נמדדת לעתים קרובות על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. למרות התקן הזהב הוא 3H-thymidine התאגדות, מעבדות רבות מקבל הרחק משיטה זו בהתחשב בזמינות של חדש, לא רדיואקטיבי חלופות. אלה כוללים צבעי פלורסנט cytoplasmic, זיהוי של מחזור תאים חלבונים משויכים, והתאגדות של שאינם רדיואקטיביים נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' deoxyuridine (Bromo) ו-5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.

צבעי cytoplasmic, כגון carboxyfluoraatstcdedit (CFSE), לזהות התפשטות משום שעוצמת החצאים של הצבע בכל פעם תא מחלק5. טכניקה זו משמשת בדרך כלל בזרימה cy, לנסות תאים שאינם חסיד. זה לא נעשה הרבה עבור תאים חסיד, אבל עם הדור החדש של הקוראים צלחת ההדמיה זה עשוי להשתנות. זיהוי של מחזור התא חלבונים הקשורים באמצעות נוגדנים מבוססי טכניקות (הזרימה cy, כימיה אימונוהיסטוכימיה, וכו ') משמש לעתים קרובות עבור רקמות או תאים שאינם חסיד. תאים/רקמות אלה חייב להיות קבוע מחלחל לפני כתמים. הפונקציה מזהה את הקוד האנלוגי מדומה BrdU ו-EdU דומים בגישה ל- 3שעות-thymidine. התאגדות של BrdU מזוהה על ידי נוגדנים אנטי BrdU, ולכן התאים חייב להיות קבוע וחדיר לפני כתמים. בנוסף, התאים חייבים להיות מטופלים עם DNase כדי לחשוף את האפיפי של BrdU.

התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, שבה הקבוצה האלקין והעזידה "לחץ" יחד בנוכחות של נחושת קטליטי. כל קבוצה יכולה לשמש כמולקולה הביואופטית המשולבת או מולקולה גילוי4. הקבוצה האלמני הזמינה מסחרית. לצורך התפשטות ההפצה, לפיכך, פונקציונליות האלנובית של נוקלאוסייד אנלוגי מזוהה על ידי עזידה מצומת לצבע פלורסנט או סמן אחר. לשילוב של EdU יש מספר יתרונות על BrdU. ראשית, מכיוון שקבוצות האלאלקין והעזידה אינן מצויים בתאי היונקים, האינטראקציה הזאת היא מאוד ספציפית עם רקע נמוך6. בגלל שתי הקבוצות הן קטנות, תאים לא צריך לעבור דנטורציה DNA כדי לחשוף את נוקלאוטיד אנלוגי כנדרש brdu7. לבסוף, לחץ על כימיה הוא תכליתי מאוד, והוא יכול לשמש תיוג מטבולית של DNA, RNA, חלבון, חומצות שומן, ופחמימות8,9,10,11. אם יעד הריבית הmetabolically נמצא על משטח התא, ניתן לתייג תאים חיים12. בנוסף, תאים יכולים להיות מעובדים עוד יותר עבור הוספת כתמים אימונולוורםעם נוגדנים.

הפרוטוקול הבא מתאר את השימוש ב-EdU התאגדות ולחץ כימיה כדי למדוד התפשטות בתאי השריר החלק כלי הדם האנושיים (איור 1). אנו מראים שלוש דרכים שונות של התאגדות של EdU ניתן למדוד, מייצגים תוצאות מכל אחד, ואת היתרונות והחסרונות שלהם. מדידת התפשטות באמצעות כימיה לחץ היא שימושית במיוחד עבור חסיד, תאים הגדלים לאט יותר. בנוסף, את המבנה של התא הוא מתוחזק היטב, מבוססי נוגדן מכתים ניתן גם לבצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זיהוי של EdU באמצעות תווית פלורסנט

  1. פתרונות מניות
    1. הכינו פתרון מניות של 5 ממ מ על ידי הוספת 12.5 מ"ג של EdU ל 10 מ ל של כפול מזוקקים H2O.
    2. להכין את רכיבי הפתרון תיוג: 200 mM טריס (3-הידרוקסימתיל) אמין (THPTA) (100 mg ב 1.15 mL H2o), 100 MM cuso4 (15.95 Mg ב 1 ml h2o; להפוך טריים), 10 מ"מ Cy3 picolyl-azide (1 מ"ג בתוך 95.3 mL-h2o) , מאוחסן ב-5 μL מעלות at-20 ° c), ו 1 ascorbate נתרן (200 mg ב 1 mL H2O; להפוך טריים).
    3. הכנת resazurin מניות פתרון בריכוז של 0.15 mg/mL. מסנן לעקר ולאחסן 1 mL הבליטים ב 4 ° c.
      הערה: picolyl אזיד זמין מצומת לכמה fluors שונים, biotin, ו חזרת peroxidase (hrp).
  2. סמן תאים שריר וסקולריים חלקה (VSMC) עם EdU.
    הערה: vsmcs האנושי מבודדים מעורקים כסל באמצעות התרחבות מפיסות הרקמה ההסבר. כאשר גדל בתוך מדיה חינם סרום עם אינסולין, העברת, סלניום תאים אלה לבטא סמנים VSMC smoothelin, שריר חלק רירן שרשרת כבדה (SM-MHC) ו-SMC αactin13.
    1. לוחית כלי דם חלקה שרירים בתוך 2 x 104/mL ב בינונית של הנשר שונה של העיט (dmem) ב 96 צלחת היטב.
      הערה: התאים גדלים ב 37 ° צ' בתקשורת תא שרירים חלקה עם 2% סרום עוברי העובר.
    2. אופציונלי אפשר מספר שעות למשך הלילה לצורך הדבקות. הוסף 20 מניות Μrea במלאי לכל באר. מחלת הקרינה ב 37 ° c עבור 3 ה. לקרוא את האות הפלואורסצנטית בקורא צלחת (560ex, 594em). החלף מדיה באמצעות DMEM טרי.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי. Resazurin משמש לנרמל מספרי תאים וחשבון עבור השתנות היטב בציפוי14.
    3. הוספת מלוחים באגירה פוספט (PBS) או גורם הגדילה הנגזר של טסיות (PDGF) 30 ng/mL ל 3-6 בארות לכל טיפול בתחילת תקופת התרבות ו הדגירה עבור 72 h.
    4. לדלל 5 מ"מ מלאי של המניה 1 מ"מ. הוסף 2 μL לכל הבאר (ריכוז סופי 20 μM) עבור 24 שעות האחרונות של תקופת התרבות 72 h. אל תוסיף EdU לקבוצה אחת של שכפול. בארות אלה ישמשו לקביעת מעבר לאור ברקע.
      הערה: משך התרבות והתיוג עם EdU מותאם במיוחד לתאי שריר חלקים, אך ייתכן שיהיה צורך לשנותם לכל סוג תא.
  3. תקן תאים פאראפורמלדהיד.
    1. הסרת מדיה והוספת 150 μL של 4% בכיוון הערוץ (PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. להסיר את התחתית ולהוסיף 150 μl של 1% פוליאתילן גליקול טרט-octylphenyl אתר (TX-100) (במים) בבאר עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הסר TX-100 על ידי שטיפת שלוש פעמים עם PBS.
      התראה: המטה רעיל, לטפל בזהירות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן תאים קבועים ב-PBS ב-4 ° c.
  4. זיהוי משולב של EdU.
    1. לבצע תיוג פתרון (10 מ"ל לכל 96 צלחת הבאר, באמצעות הפנימי 60 בארות) רק לפני השימוש על ידי הוספת ריאגנטים מתוך פתרונות המניה בסדר הבא: thpta 20 μl, cuso4 20 μl, Cy3 picolyl אזיד 5 μl, Na ascorbate 100 μl ל-PBS עבור נפח כולל של 10 mL.
    2. להסיר PBS מבארות ולהוסיף 150 μL של הפתרון תיוג לכל טוב. דגירה 30 דקות ב 37 ° c. כדי לזהות את כל גרעיני, להוסיף 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לכל טוב. קרא על הקורא צלחת הזריחה (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350לשעבר, 470em) או תמונה על מיקרוסקופ.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן תאים קבועים ומוכתמים ב-PBS ב-4 ° צ' ובתמונה במועד מאוחר יותר.

2. זיהוי של EdU באמצעות הומינסנציה

  1. סעיפים שלמים 1.1 – 1.3.
  2. הכינו טריס-מלוחים באגירה עם 0.1% polysorbate 20 (TBST).
  3. . בלוק בארות
    1. הוסף 150 μL של חסימת מאגר (טבלה של חומרים) על כל באר ו מארג עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר מאגר חוסם ושטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBS.
  4. זיהוי משולב של EdU.
    1. הפוך את פתרון התיוג כמכוון בשלב 1.4.1, והחליף ביוטין picolyl עבור Cy3 picolyl אזיד.
    2. רוחצים את הבארות חמש פעמים עם 200 μL של TBST, עם טלטול, 3 דקות לכביסה.
    3. Peroxidases אנדודוגני כיבוי עם 150 μL של 0.3% H2O2 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הסרת H2O2 ולשטוף חמש פעמים עם 200 ΜL של tbst, עם טלטול 3 דקות לשטוף.
    5. לדלל streptavidin-חזרת peroxidase (SA-HRP; 1:200) ב TBST ולהוסיף 50 μL לכל טוב. . משטח 1 בטמפרטורת החדר
    6. שטוף חמש פעמים עם 200 μL של TBST, עם טלטול, 3 דקות לכביסה.
    7. הוסף 50 μL של שיטת האנזים החיסוני המקושרת באמצעות אנזימים (שולחן חומרים) לכל באר.
    8. קרא מיד בקורא לוחית המסוגל לזהות הומינסנציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באיור 2, אנו להדגים את התוצאות של שלושה ניסויים שונים מדידת התפשטות VSMC בתגובה pdgf. לאחר שגדל את התאים במדיה שגובשה עבור SMCs, אנו ביצעו את הניסוי ב-DMEM בחינם סרום, כדי לחסל את כל ההשפעות הפוטנציאליות של סרום או גורמי גדילה על התפשטות. באיור 2A אנו משווים תוצאות, מאותו ניסוי, באמצעות פלורסנט לעומת הבדיקה זורח. כדי לקרוא את הלוחיות הללו, השתמשנו בקורא מיקרופלייט רב-שכבתי שיכול לקרוא ספיגה, זריחה והזדקנות (ראה טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התאגדות של EdU היא דרך פשוטה ופשוטה למדוד הפצת תאים; הוא שימושי במיוחד עבור תאים חסיד13. הפרוטוקול שלנו משתמש בתאי שריר חלקה, אבל זה חל על כל תא חסיד (אפיתל, אנדותל, וכו '). למרות שהפרוטוקול אינו מורכב, הצעד הקריטי היחיד מבצע את פתרון התיוג-יש להוסיף את החומרים בסדר המפורט. בנוסף, כמו הבלוטים המערביים, אם משתמשים בלוח האור באופן מיידי, יש לקרוא את הלוחית מיד.

ניתן לשנות או למטב כמה חלקים של הפרוטוקול בהתאם לצורך. חלק אחד הוא משך הדגירה עם EdU. מכיוון שהמטרה שלנו היתה לז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לקייטי קארול. על סיוע טכני אנו מודים גם ד ר דוד Cool ואת המעבדה לניתוח פרוטאומניקס להוראה על והאספקה של הקורא לוחית הדמיה של העיבוד. עבודה זו נתמכת על ידי המענק של קרן רייט סטייט (כדי L.E.W.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-אתיניל-2'-דאוקסיורידיןקרבוסינת'NE08701
ביוטין פיקוליל אזידקליק כלים לכימיה1167-5
CuSO4פישר סיינטיפיקC1297-100G
Cy3 פיקוליל אזידקליק כלים לכימיה1178-1
קורא צלחות ציטציהביוטק
EVOS מיקרוסקופThermo Fisher Scientific
תמיסת מי חמצןסיגמא-אולדריץ'216763
אסקורבטSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue קבוע תא כתמים מוכן בדיקותInvitrogenR37606DAPI כתם גרעיני
אודיסיאה חוסם מאגרLi-Cor927-40000מאגר
חוסםשירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710
PBSFisher ScientificSH3002802
נתרן כלוריסיגמא מדעי החייםS3014-5 ק"ג
סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז מצומדLife TechnologiesS911
סופר אות ELISA FemtoThermo ScientificPI137075מצע ELISA
קורא צלחות סינרגיהBiotek
THPTAClick Chemistry Tools1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Paraformaldehyde

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
  2. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  3. Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
  4. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
  6. Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
  7. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
  8. Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
  9. Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
  10. Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
  11. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  12. Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
  13. Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
  14. Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
  15. Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
  16. Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
  17. Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
  18. Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EdUTX 100

מאמרים קשורים