התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר, ובדיקה משותפת המשמשת להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. מדידת התפשטות היא, לכן, שימוש תכוף בביולוגיה התא. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, רב-תכליתית של מדידת התפשטות כי ניתן להשתמש בתאים חסיד ושאינם חסיד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
היכולת של תא להתרבות היא בלתי נפרד לתפקוד הרגיל של רוב התאים, והדיסרגולציה של התפשטות היא בלב תהליכי מחלות רבים. מסיבות אלה, מדידת ההפצה היא כלי נפוץ המשמש להערכת הפונקציה cell. ניתן למדוד את תפוצת התא רק על ידי ספירה; עם זאת, זהו אמצעי עקיף למדידת התפשטות. אחד האמצעים השכיחים של במישרין זיהוי תאים הכנת לחלק הוא על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. אלה כוללים את הרדיו האנלוגי נוקלאוטיל 3H-thymidine פלוס non-רדיואקטיבי נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' Deoxyuridine (bromo) ו-5-ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU). התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, אשר יש מספר יתרונות כאשר בהשוואה BrdU. בדוח זה, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התפשטות באמצעות התאגדות של EdU. פרוטוקול זה כולל אפשרויות לקריאות שונות, יחד עם היתרונות והחסרונות של כל אחד מהם. אנו גם דנים במקומות שבהם הפרוטוקול יכול להיות ממוטב או שונה כדי לענות על הצרכים הספציפיים של הניסוי המתוכנן. לבסוף, אנו נוגעים בדרכים כי פרוטוקול בסיסי זה ניתן לשנות עבור מדידת מטבוליטים תא אחרים.
מבוא
התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר1,2. שליטה על התפשטות ההשפעות על תהליכים נורמליים כגון פיתוח, תהליכים פתולוגיים כגון סרטן ומחלות לב וכלי דם. צמיחה היפרפלסטית של תאים שריר וסקולריים חלקה, למשל, הוא חשב להיות הקודמן טרשת עורקים3. שינויים בתפוצת התאים משמשים גם להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. בהתחשב בהשפעה הנרחבת שלה, מדידת ההפצה היא התווך של מעבדות רבות בביולוגיה המבוססת על תאים.
ניתן למדוד את תפוצת התא על-ידי ספירת תאים בלבד אם אוכלוסיית הריבית מתפצלת במהירות רבה. עבור תאים הגדלים לאט יותר, ספירת תאים עשויה להיות פחות רגישה. התפשטות נמדדת לעתים קר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. זיהוי של EdU באמצעות תווית פלורסנט
- פתרונות מניות
- הכינו פתרון מניות של 5 ממ מ על ידי הוספת 12.5 מ"ג של EdU ל 10 מ ל של כפול מזוקקים H2O.
- להכין את רכיבי הפתרון תיוג: 200 mM טריס (3-הידרוקסימתיל) אמין (THPTA) (100 mg ב 1.15 mL H2o), 100 MM cuso4 (15.95 Mg ב 1 ml h2o; להפוך טריים), 10 מ"מ Cy3 picolyl-azide (1 מ"ג בתוך 95.3 mL-h2o) , מאוחסן ב-5 μL מעלות at-20 ° c), ו 1 ascorbate נתרן (200 mg ב 1 mL H2O; להפוך טריים).
- הכנת resazurin מניות פתרון בריכוז של 0.15 mg/mL. מסנן לעקר ולאחסן 1 mL הבליטים ב 4 ° c.
הערה: picolyl אזיד זמין מצומת לכמה fluors שונים, biotin, ו ח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באיור 2, אנו להדגים את התוצאות של שלושה ניסויים שונים מדידת התפשטות VSMC בתגובה pdgf. לאחר שגדל את התאים במדיה שגובשה עבור SMCs, אנו ביצעו את הניסוי ב-DMEM בחינם סרום, כדי לחסל את כל ההשפעות הפוטנציאליות של סרום או גורמי גדילה על התפשטות. באיור 2A אנו משווים תוצאות, מאותו ניסוי, באמצעות פלורסנט לעומת הבדיקה זורח. כדי לקרוא את הלוחיות הללו, השתמשנו בקורא מיקרופלייט רב-שכבתי שיכול לקרוא ספיגה, זריחה והזדקנות (ראה טבלת חומרים).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התאגדות של EdU היא דרך פשוטה ופשוטה למדוד הפצת תאים; הוא שימושי במיוחד עבור תאים חסיד13. הפרוטוקול שלנו משתמש בתאי שריר חלקה, אבל זה חל על כל תא חסיד (אפיתל, אנדותל, וכו '). למרות שהפרוטוקול אינו מורכב, הצעד הקריטי היחיד מבצע את פתרון התיוג-יש להוסיף את החומרים בסדר המפורט. בנוסף, כמו הבלוטים המערביים, אם משתמשים בלוח האור באופן מיידי, יש לקרוא את הלוחית מיד.
ניתן לשנות או למטב כמה חלקים של הפרוטוקול בהתאם לצורך. חלק אחד הוא משך הדגירה עם EdU. מכיוון שהמטרה שלנו היתה לז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים לקייטי קארול. על סיוע טכני אנו מודים גם ד ר דוד Cool ואת המעבדה לניתוח פרוטאומניקס להוראה על והאספקה של הקורא לוחית הדמיה של העיבוד. עבודה זו נתמכת על ידי המענק של קרן רייט סטייט (כדי L.E.W.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין | קרבוסינת' | NE08701 | |
| ביוטין פיקוליל אזיד | קליק כלים לכימיה | 1167-5 | |
| CuSO4 | פישר סיינטיפיק | C1297-100G | |
| Cy3 פיקוליל אזיד | קליק כלים לכימיה | 1178-1 | |
| קורא צלחות ציטציה | ביוטק | ||
| EVOS מיקרוסקופ | Thermo Fisher Scientific | ||
| תמיסת מי חמצן | סיגמא-אולדריץ' | 216763 | |
| אסקורבט | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue קבוע תא כתמים מוכן בדיקות | Invitrogen | R37606 | DAPI כתם גרעיני |
| אודיסיאה חוסם מאגר | Li-Cor | 927-40000 | מאגר |
| חוסם | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| נתרן כלורי | סיגמא מדעי החיים | S3014-5 ק"ג | |
| סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז מצומד | Life Technologies | S911 | |
| סופר אות ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | מצע ELISA |
| קורא צלחות סינרגיה | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
מקורות
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
