הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

13.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59949

⸱

17 בדצמבר 2019

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים גישה מהימנה ליצור הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T תאים ולבדוק בידול שלהם ותפקוד מבחנה בvivo.

תקציר

חיסוני המאמצת מחזיקה הבטחה לטיפול בסרטן ומחלות זיהומיות. אנו מתארים גישה פשוטה לשנות את התאים הראשוניים של האדם הראשי עם קולטן אנטיגן צ'יאריק (רכב) ולהרחיב את הצאצאים שלהם לשעבר vivo. אנו כוללים בחני למדוד ביטוי רכב, כמו גם בידול, קיבולת ההתרבות ופעילות cytolytic. אנו מתארים בחני למדוד את הייצור cy, ציטוקין והפרשת ציטוקין דלקתיים בתאי T רכב. הגישה שלנו מספקת שיטה אמינה ומקיפה לתאי T מכונית התרבות עבור מודלים פרה-קליניים של טיפול חיסוני המאמצת.

מבוא

הקולטנים אנטיגן הצ (מכוניות) לספק גישה מבטיחה לנתב מחדש את תאי T נגד אנטיגנים הגידול ברורים. מכוניות הם קולטנים סינתטיים כי לאגד מטרה אנטיגן. בעוד הרכב המדויק שלהם הוא משתנה, מכוניות מכילות בדרך כלל 3 תחומים שונים. תחום החילוץ מורה כריכת אנטיגן היעד הוא מורכב בדרך כלל קטע נוגדן שרשרת אחת המקושרת למכונית באמצעות ציר מסחטות. התחום השני, הנגזר בדרך כלל משרשרת CD3ζ של קולטן תא T (TCR) מורכב, מקדמת הפעלת תא T לאחר האירוסין רכב. תחום מגירוי שלישי כלול כדי לשפר את תפקוד התא T, העפילה, חילוף החומרים והתמדה. ההצלחה של המכונית טיפול בתאי T ב ממאירות המטפאות שונים כולל B לוקמיה לימפובלסטית חריפה (כל), לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) ומיאלומה נפוצה מדגיש את ההבטחה הטיפולית של גישה זו1,2,3,4,5,6. המזון והתרופות האחרונות (FDA) אישורים עבור שתי CD19-ספציפיים מכונית T טיפולים, tisagenlecleucel עבור ילדים ובוגרים צעירים ALL ו-axicabtagene עבור לימפומה מפוזר תא B גדול, מחזקת את הכשרון הטרנסלאליות של טיפול בתאי T מכונית.

שיטות T מבוססות מכונית כרוכות בבידוד של תאי T מ דם היקפי, הפעלה, שינוי גנטי, והרחבת ex vivo. בידול הוא פרמטר חשוב הוויסות מכונית T יעילות תאים. בהתאם לכך, הגבלת בידול תא T במהלך התרבות vivo ex מגביר את היכולת של המוצר המוחדרת כדי חרט, להרחיב, ולהמשיך, מתן מעקב לטווח ארוך החיסונית בעקבות העברה המאמצת2,7,8,9. תאי t מורכבים ממספר קבוצות מערכות ברורות כולל: תאי T תמימים (Tn), זיכרון מרכזי (Tcm), זיכרון אפקטור (Tem), אפקטור הבדיל (Tte) וזיכרון תא גזע (Tscm). אפקטור הבדיל תאים T יש יכולת cytolytic חזקה; עם זאת, הם קצרים חיו והוא חרט גרוע10,11,12. לעומת זאת, תאים t עם הפנוטיפ פחות הבדיל כולל תאי T תמים ו Tcm התערוכה מעולה בתיאום ויכולות ההתרבות בעקבות העברת התא המאמצת13,14,15,16,17,18. הרכב של תאי T שנאספו במוצר שיוצרו מראש יכול להשתנות ברחבי החולים והתואם את הפוטנציאל התרפויטי של מכונית T. היחס של תאי T עם הimmunophenotype נאיבי כמו המוצר המתחיל apheresis הוא מתאם מאוד עם השני והתגובה הקלינית של התשובה19.

משך התרבות הוא פרמטר חשוב המשפיע על בידול בתאי T רכב מוכן העברה המאמצת. פיתחנו לאחרונה גישה כדי ליצור באיכות מעולה בתאי T מכונית באמצעות פרדיגמה תרבות מקוצרת20. באמצעות הגישה שלנו, הראנו כי תרבות מוגבלת מעניקה העלייה לתאי T רכב עם פונקציה מעולה אפקטור והתמדה בעקבות העברה המאמצת במודלים מבע של לוקמיה. כאן, אנו מציגים את הגישות לייצר באופן אמין CART19 תאים (בתאי T אוטוולוגיים הנדסה כדי לבטא anti-CD19 scfv מצורף CD3ζ ו 4-1bb התחומים איתות) וכוללים תיאור מפורט של בחני כי לספק תובנה לתוך מכונית ביולוגי T ויעילות לפני העברה המאמצת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל לימודי בעלי החיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה.

1. הפעלת תא T, התמרה והרחבה

  1. הפעל טרי או cryopreserved מורות האדם הראשי T תאים על ידי ערבוב עם מחרוזות anti CD3/CD28 מגנטי (g., dynabeads) ביחס של 3 חרוזים לכל תא T ב 6-היטב מנות תרבות התא. תרבות T תאים ב-X-VIVO 15 בינוני בתוספת עם 5% סרום AB אנושי רגיל, 2 מ"מ L-גלוטמין, 20 מ"מ HEPES, ו IL2 (100 יחידות/mL). לשמור על תאי T בריכוז של 106 תאים T/mL במהלך ההרחבה. התרבות T תאים ב 37 ° c, 20% O2, ו 95% לחות עם 5% CO2.
  2. לאחר גירוי הלילה, להוסיף לתאי T מופעלים. לחשב את הנפח של סופרנטנט הדרוש כדי להשיג ריבוי של זיהום (מוי) של 3-5.
    הערה: מכונית CD19-BBζ מורכבת מציר CD8 וירוס, 4-1BB תחום מגירוי, ו CD3ζ איתות בתחום21. CD19-BBζ מאוד הופק על ידי סופר ויראלי כפי שתוארה בעבר21.
  3. ביום 3, לאסוף מייצג מייצגים של תאים עבור הקפאה קריוגנית. לפני הקפאת ההזמנה, להסיר את החרוזים המגנטי על ידי ליטוף עדין והפרדה מגנטית. הכינו אמצעי הקפאה המכילים תמיסת מלח (PBS) עם 0.5% diמתיל סולפוקסיד (DMSO) והחנות ב -4 ° c עד השימוש.
    1. התאים צנטריפוגה T ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט ולהוסיף 5 מ ל של PBS. בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר PBS.
    2. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של בינונית הקפאה קרה. הקפאת תאי T במיכל קפוא מקורר ולאחסן ב-80 ° c עבור 48 h. העבירו את התאים הקפואים. לחנקן נוזלי
  4. שטוף את שאר התאים T פעם ב 5 מ ל של PBS לחסל וקטור שיורית. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. decant ה-PBS ולהשעות מחדש את הגלולה התא במדיום תרבות התא T בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL.
  5. לפצל את התאים T לשתי תרבויות, מיועד ליום 5 ויום 9. ספירת T תאים על ידי זרימה cy, לנסות באמצעות חרוזי ספירה (טבלה של חומרים) ו נוגדנים חד שבטיים כדי CD4 ו CD8 האדם, כמו גם לצבוע את הכדאיות (טבלת חומרים).
    1. כדי למדוד ריכוז תא T, להכין תמהיל הורים המכיל 500 μL של PBS, 5 μL של חרוזים ספירה, 10 μL של 7-אמינו-אקטינומיצין D הכדאיות הפתרון, 4 μL של CD4-FITC ו-4 μL של CD8-APC. הוסף 40 μL של תאים T לתמהיל הראשי ולמדוד את הריכוז התא על ידי הזרמת cy, מבוסס על מספר תאים T לחיות/ספירות חרוז. להאכיל מחדש כדי לשמור על התרבויות בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL בכל יום אחר.
  6. ביום 5, לספור והקפאה היום 5 תרבויות כמתואר בשלבים 1.3 ו 1.5.
  7. ביום 7, לשטוף 0.5 x 106 תאים T ב PBS ו-resuspend ב 100 μl של מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs) מאגר. לזהות ביטוי חלבון פני השטח של המכונית על ידי כתמים חיסוני עם מבCAR19-מצומנת אנטי-בעלת מעלה-מעלה-מעלה-מעלה ידי זרימה cy, לנסות.
  8. ביום 9, לספור יום 9 תרבויות ו cryopreserve כמתואר בשלב 1.3.

2. הערכה פנוטימית של בידול תא T

  1. להכין תערובת הורים המכילים נוגדנים pre-titrated עבור anti-CD3 – BV605 (שיבוט OKT3), anti-CD14 – פסיפיק כחול (PB) (שיבוט HCD14), anti-CD19 – PB (שיבוט HIB19), אנטי CD4 – BV510 (שיבוט OKT4), anti-CD8 – H7APC (שיבוט SK1), anti-CCR7 – FITC 150503 ( anti-CD45RO – PE (שיבוט UCHL1), anti-CD27 – PE-Cy7 (שיבוט 1A4CD27), anti-CD95 – PerCP-Cy 5.5 (שיבוט DX2), ו-anti-CAR19-APC.
  2. להכין זריחה בודדת מינוס אחד (FMO) פקדים עבור anti-CD45RO – PE, אנטי CCR7 – FITC, anti-CD27 – PE-Cy7 ו anti-CD95 – PerCP-Cy 5.5 כדי להבחין תאים מוכתמים באופן חיובי מרקע.
  3. הכנת פתרון מכתים תא מת על ידי דילול מלאי חי/מת במלאי (טבלת חומרים) 1:10000 ב PBS.
  4. ההפשרה יום 3, יום 5, ויום 9 תאים T שהיו בעבר cryopreserved מורות. צנטריפוגה 1 x 106 תאים T מכל קבוצה ב 300 x g עבור 3 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. רחץ את התאים פעם אחת עם ה-PBS. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות ולהיפטר PBS.
  5. לערבב תאים T עם פתרון מכתים מתים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), מוגן מפני האור.
  6. הוסף 1 מ ל של מאגר FACS כדי להרוות את הצבע התא המת מכתים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות, למחוק את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 100 μl של מאגר facs המכיל את קוקטייל הנוגדן המתואר בשלב 2.1 ו 2.2. מיכל הדגירה 1 h ב 4 ° c.
  7. הוסף 1 מ ל של מאגר FACS ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות כדי לשטוף את הנוגדן לא מאוגד. חזור על שלוש פעמים עם מאגר FACS.
  8. השהה את התאים ב-1% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבית) ואחסן ב-4 ° c.
  9. כפי CD45RO ביטוי יורדת לאחר קיבעון, לנתח את הדגימות על ידי הזרמת cy, לאחר התניית החיסוני. להערכת בידול, שער לפי הסדר הבא: סינגמייטים (FSC-H vs FSC-A), live CD3+ T תאים (Dump [חי-מת סגול, CD14-PB ו CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). ב CD4+ ו CD8+ קבוצות מערכות, שער על CD45RO-PE VS CCR7-fitc להגדיר תאים לא תמימים כמו (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+ CCR7+), TEM (CD45RO+CCR7-), ו-Tte (CD45RO-CCR7-). כדי לזהות את Tscm, שער בתאים CD27+ T באוכלוסיית תאי T בדומה לתמים. בתוך תא זה, Tscm הם CD95+ ו-TN הם CD95-.

3. ניתוח תפקודי חוץ-גופית

  1. מכונית הפצת תאי T והפרשת ציטוקין
    1. לאמת ביטוי רכב, כמו גם הכדאיות של התא כפי שמתואר בשלבים 1.5 ו 1.7, על ידי הזרמת cy, לנסות.
    2. לשטוף 5 x 106 בתאי T מכל קבוצה (יום 3, יום 5 ויום 9) עם PBS ולהשעות את הפתרון 1 μm של carboxyfluorמחדש את שיטת הסינכרון (cfse) ב-pbs עבור 3.5 דקות ב-RT.
    3. מייד להוסיף 10 מ ל של PBS המכיל 10% סרום של שור עוברי (FBS) כדי להרוות את התגובה.
    4. צנטריפוגה את הפתרון ב 300 x g עבור 3 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולחזור על שלב זה שלוש פעמים. לספור את התאים בסיום הצביעת CFSE באמצעות מונה קולטר (טבלת חומרים).
    5. בציר CFSE מוכתם תאים (לא מגורה), להשעות מחדש 1% בכיוון הראשון ולאחסן ב 4 ° c עבור ניתוח על ידי הזרימה cy, try.
    6. מקרין את המספר הרצוי של מכונית מוכתמת cfse-T עם הקרינה הK562-CD19 (היעד) כמו גם K562-wild סוג (שליטה) תאים ביחס של 1:1 עבור 120 h ב ציטוקינים תרבות חינם בינונית ותרבות תנאים כמתואר בשלב 1.1.
    7. לאחר 24 שעות, צנטריפוגה את כלי התרבות ב 300 x g עבור 5 דקות. לאסוף 120 μl של הסלולר supernatant. להעריך את הייצור תלויי ההפעלה של IL2, IFNγ, TNFα, GM-שדרתי, ו ציטוקינים דלקתיים אחרים (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8, ו IL10) על ידי מנתח לומיקס בהתאם להמלצות של היצרן.
    8. החלף את עוצמת הקול של סופרנטאנט שנאסף בשלב 3.1.7 עם אמצעי אחסון שווה ערך (120 μL) של מדיום טרי.
    9. ביום 3 (כלומר, לאחר 96 h), לספור ולהאכיל מחדש בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL באמצעות מבוססי חרוז הזרימה cy, לנסות כמו בעבר בשלב 1.5.
    10. ביום 5, לספור את התאים live CD3+ ולחשב את שינוי הקיפול של תאי t לחיות ביחס לספירת התאים החיים t ביום 0.
    11. בצע ניתוח מקיף של דילול CFSE בחלוקת תאי T רכב באמצעות תוכנת FlowJo כדי להדגיש סיבובים רצופים של החטיבה התא.
      הערה: מספר ההפצה מתואר היטב במדריך FlowJo.
  2. שיטת רעילות התא
    הערה: היכולת של תאים CART19 להרוג את תאי היעד ביטוי CD19 מוערך באמצעות 51Cr שחרור שחרורו.
    1. סמן את תאי היעד על ידי ערבוב 5 x 105 K562-CD19, K562-פראי בקרת סוג תאים, או NALM6 תאים לוקמיה עם 50 μl של Na251קרו4 ו 0.5 ML של RPMI שיושלם עם 10% fbs עבור 90 מינימום בחממה ב 37 ° c.
    2. בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 2.5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט רדיואקטיבי בפחי סילוק המתאים ולשטוף את תאי היעד ב 5 מ ל של PBS. חזור על השלבים פעמיים.
    3. השהה מחדש את תאי היעד ב-פנול בינונית ללא אדום המכילה 5% FBS. השתמש במדיום זה להמשך ההליך כדי להקטין את הרקע.
    4. לאחר הערכת ביטוי רכב והכדאיות של התאים על-ידי שילוב cy, כמתואר בסעיף 5.1), מערבבים תאים T רכב עם תוויות היעד בתאי ב-אפקטור: היעד (E:T) היחס של 10:1, 3:1 ו 1:1, בטרילקאט. . העבר ללוחית התחתונה של 96
    5. במקביל, לכלול תאי יעד בלבד, ואת היעד תאים עם 1% נתרן dodecyl סולפט (SDS), כדי לקבוע ספונטנית (S) ומקסימום (M) 51Cr שחרור, בהתאמה.
    6. בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ו-דגירה עבור 4 h או 20 שעות בחממה 37 ° c עם 5% CO2.
    7. לאחר הזמן המיועד, צנטריפוגה את כלי התרבות ב 300 x g עבור 5 דקות. לאסוף 35 μl של supernatant הסלולר ולהעביר לוחית הקורא. להימנע בועות. . תנו לצלחת להתייבש בן לילה
    8. לאטום את הצלחת עם חותם לוחית סטנדרטי ולספור עם מונה של נוזל נוזלי. שפע כרום ב-supernatant מספק פרוקסי של רצח תא היעד. חשב את אחוז הליזה הספציפית כדלקמן: 100 x (ספירות לדקה [cpm] שחרור ניסיוני – cpm S שחרור)/(cpm שחרור – cpm S שחרור).

4. באנליזה פונקציונלית Vivo

  1. להשיג 6 על 10-שבוע בן נוד-scid γc–/– (nsg) עכברים, אשר חסר מערכת חיסונית אדפטיבית, ולהקצות אותם לטיפול/בקרת הקבוצה באופן אקראי.
  2. הכנס בעלי חיים באמצעות וריד הזנב עם 1 x 106 NALM6 תאים ב 0.1 mL מעוקר PBS.
  3. לאחר 5-7 ימים, אשר בתאום הגידול על ידי הדמיה ביולומינסנציה (בלי). הכנס 150 מ"ג/ק"ג של D-לluciferin לעכברים אשר כבר מורדם עם isof, הכרך תלוי במסת הגוף).
  4. מדידת ערכים ביולומינציה באמצעות מערכת הדמיה. לכמת שטף הכולל באמצעות התוכנה המתאימה על ידי ציור מלבנים של אזור זהה סביב עכברים, להגיע מראש אל 50% של אורך הזנב. הפחת את הרקע עבור כל תמונה בנפרד.
  5. לאחר יצירת לוקמיה, להזריק 3 x 106 יום 9 CART19 תאים, 0.5 x 106 יום 3 מכונית T תאים, או המקביל לא התמרה (ntd) האדם תאים t באמצעות וריד הזנב בנפח של 100 μl של PBS וסטרילי/Ca2 +.
    הערה: כפעילות ביולוגית של תאים שנקטפו במרווחי זמן שונים במהלך תהליך התרבות הוא שונה, הריכוז הנבחר של יום 3 תאים נמוך יותר מיום 9.
  6. כדי לקבוע התקדמות מחלות, למדוד את ערכי biלומינסנציה פעמיים בשבוע כמתואר לעיל בשלב 4.3.
  7. כדי לקבוע מכונית תא T בתאום, לאסוף 75 μL דם דרך דימום מסלולית רטרו בתוך צינור EDTA-מצופה. העברת 50 μL של דם לצינורות ספירת מוחלטים.
  8. הכתם דם עם נוגדנים נגד CD45, CD4, CD8 ומכונית עבור 30 דקות ב RT. הוסף 400 μL של הפתרון הכולל של 1x FACS לצינורות ומערבולת ביסודיות. לאחר צביעת, לנתח ביטוי סמן פני השטח על ידי הזרמת cy, לנסות.
    הערה: סמנים פני השטח האחרים יכולים לשמש כדי להעריך את מצב הבידול והתשישות של תאי T בדם.
  9. כדי למדוד רמות ציטוקינים בדם, דם צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 30 דקות ב 4 ° צלזיוס כדי להפריד סרום מהשכבה העליונה של דם.
  10. לאסוף סרום למדוד את ציטוקינים עם לוחית הקורא המיועד על פי הוראות היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות השיטות המתוארות לעיל, אנו ממריצים והרחיבו תאי T עבור 3 או 9 ימים (איור 1א, ב). כמו כן ניתחנו את פרופיל הבידול שלהם, כפי שמצוין על-ידי אסטרטגיית האיתור המתוארים באיור 1C, על ידי מדידת השפע של גליקורופונים ברורים המתבטאת במשטח התא. אנו מראים שינוי פרוגרסיבי לקראת הבידול בידול לאורך זמן במהלך תרבות vivo לשעבר (איור 1ד). העריכו את הפונקציה האפקטור וקיבולת ההתרבות של תא T רכב בתג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מתארים גישות למדוד את הפונקציה ואת היעילות של תאי T רכב שנקטפו במרווחי זמן שונים ברחבי התרבות vivo ex. השיטות שלנו מספקות תובנה מקיפה לתוך בחני שנועדה להעריך את הקיבולת ההתרבות, כמו גם את התפקוד של אפקטור בתוך מבחנה. אנו מתארים כיצד למדוד פעילות תא T המכונית בעקבות גירוי דרך המכונית ופרטים מבע מודלים של לוקמיה באמצעות מכונית T תאים שנקטפו ביום 3 לעומת יום 9 של שלב ההתרחבות לוגריתמי שלהם.

ישנם אתגרים הטבועות בהשוואת היעילות של מכונית T התאים שנקטפו בזמן נקודות שונות במהלך הרחבת vivo ex....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו באמצעות מימון שסופקו על ידי התרופות נוברטיס באמצעות ברית מחקר עם אוניברסיטת פנסילבניה (מייקל C. Milone), כמו גם את פרס מלומד בקרן סנט בלדריק (סאבא Ghassemi).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי CD3 / CD28 dynabeadsתרמו פישר40203D
APC עכבר אנטי אנושי CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 עכבר אנטי אנושי CD8 נוגדןBD Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X תרכיזBD Biosciences349202
BD Trucount צינורות ספירה מוחלטתBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 אנטי אנושי CD4 נוגדןBioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 אנטי אנושי CD3 נוגדןBioLegend317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation KitLife TechnolohgiesC34554
CountBright Absolute Counting,InvitrogenC36950
FITC אנטי אנושי CD197 (CCR7) נוגדןBD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC עכבר אנטי-אנושי CD4BD Biosciences555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
Human AB סרוםעמק ביו-רפואיHP1022
Human IL-2 IS, Miltenyi בדרגת פרימיום130-097-744
L-גלוטמיןGibco28030-081
מונה נצנוץ נוזלי, MicroBeta triluxPerkin Elmer
בדיקות מולקולריותסגולות לתיקוןL34964
Multisizer Coulter Counterבקמן קולטר
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific נוגדן CD14 כחול אנטי אנושיBioLegend325616RRID:AB_830689
פסיפיק כחול אנטי אנושי CD19 נוגדןBioLegend302223
PE אנטי אנושי CD45RO נוגדן BDBiosciences555493RRID:AB_395884
PE/Cy5 אנטי-אנושי CD95 (Fas) נוגדןBioLegend305610RRID:AB_493652
PE/Cy7 אנטי-אנושי CD27 נוגדן בקמן CoulterA54823
פנול בינוני נטול אדוםGibco10373-017
UltraPure SDS Solution, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ מלחפרקין אלמר122799
LIVE / DEAD

מקורות

  1. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).
  4. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
  5. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  6. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).
  8. Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
  9. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  10. Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
  11. Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  12. Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
  13. Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
  14. Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
  15. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  16. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  17. Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
  18. Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).
  19. Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  20. Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
  21. Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
  22. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  23. Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
  24. Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
  25. Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TX Vivo 15Anti CD3 CD28Cryopreservation
ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.