הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59950

⸱

19 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים ורקמות המוח, ניצול immunofluorescence כתמים ושיטות כתמי נקודה DNA.

תקציר

שינויי דנ א מרובים זוהו בגנום היונקים. מתוך זה, 5-מתילציטוסין ו-5-הידרוגרד מתילציטוסין-בתיווך מנגנונים גנטיים נחקרו באופן אינטנסיבי. 5-hydroxyמתילציטוסינוס מציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח המוח העובריים והפוסט-לידתיים, משחק תפקיד רגולטורי בביטוי הגנים, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות. כאן, אנו מתארים את השיטות המפורטות כולל כתמים immunofluorescence ו-DNA נקודה-כתם כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים מתורבתים ורקמות המוח של העכבר.

מבוא

שינויים אפיגנטיים, כולל שינוי ה-DNA, שינוי היסטון ו-RNA שינוי, הוכחו לשחק פונקציות חיוניות בתהליכים ביולוגיים שונים ומחלות1,2,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. במשך זמן רב, מתילציה DNA (כלומר, 5-מתיל ציטוסין (5-mC)) הוצג כסמן מאוד יציב אפיגנטי ולא ניתן לשנות עוד בגנום. לאחרונה, זה נמצא כי 5-mC יכול להיות תחמוצת ל 5-הידרוxyמתילציטוסין (5-hmc) על ידי ט (10-11 טרנסמקומות) משפחה חלבונים כולל TET1, TET2, ו TET38,9. מחקרים נוספים מראים כי 5-hmc יכול לשמש סמן יציב ולשחק תפקידים ביולוגיים באמצעות ויסות גן ביטוי4,10,11,12.

הראיות הקיימות מצביעות על כך 5-hmc הוא מועשר מאוד ברקמות הנוירואליות/תאים ביחס לסוגים אחרים של רקמות יונקים, ומציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח עצבי13,14. במערכת עצביים, 5-hmC בתיווך אפיגנטי שינויים לשחק תפקיד חשוב בוויסות תאי גזע עצביים, פעילות עצבית, למידה וזיכרון, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות כולל תסמונת רט, אוטיזם, אלצהיימר מחלה, מחלת הנטינגטון, וכו '2,13,15,16,17,18,19,20.

ישנן מספר גישות לגילוי 5-hmc בתאים ורקמות14,21,22,23,24. כאן, אנו מתארים שתי שיטות כדי לזהות את קיומו של 5-hmC ולכמת את הרמה הגלובלית של 5-hmC: מכתים החיסונית של כתמים ו-DNA נקודה-כתם. שתי שיטות אלה הן נוחות ורגישות, ובשימוש בהצלחה במחקרים קודמים25,26,27,28,29,30. השלבים העיקריים של שתי שיטות אלה הם denaturation DNA. עבור מכתים החיסונית של 5-hmC, טרום טיפול של דגימות עם HCl 1 M נדרש. עבור 5-hmC נקודה-כתם, דנ א הדנטורציה מבוצעת עם פתרון NaOH. שתי שיטות אלה יחד עם רצף הדור הבא הם כלים שימושיים מאוד לחקירת הפונקציה של 5-hmC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג.

1. התרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים ונוירונים

  1. בידוד בתאי גזע עצביים מבוגרים מן המוח הקדמי של מבוגר (8-10 בן שבוע) C57/BL6 עכבר זכר כמתואר בעבר31,32.
  2. תרבות תאי גזע עצביים למבוגרים בלבד/F-12 בינונית המכילה 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 תוספת, 1% אנטיביוטי-antimycotic, ו 2 מ"מ L-גלוטמין בחממה 5% CO2 ב 37 ° c. לגרום הבידול של תאים גזע עצבי מבוגרים עם חומצה retinoic 1 μm ו 5 μm forskolin עבור 48 h כמתואר בעבר31,32.
  3. בידוד נוירונים מן היום העובריים 17 (E17) היפוקמאני של העכבר והתרבות עם מדיום נוירוסיס המכיל של 0.25% L-גלוטמין, 0.125% גלוטמקס ו 2% B27 תוספת בחממה 5% CO2 ב 37 ° צ' כמתואר לעיל33.

2. הטרנס הפרזיה של העכבר

  1. הכינו 10% כלוראל הידרוקסיד, 4% פאראפורמלדהיד (הכלט) ו פוספט מאגור באגירה (PBS) יום אחד לפני הניסוי, ולאחסן ב 4 ° c.
  2. מורדם בוגר זכר או נקבה C57 BL/6J עכבר עם 10% כלוראל הידרוקסיד (50 מ"ג/ק"ג, כלומר), ולהבטיח כי החיה הוא מורדם עמוקות על ידי בדיקת תגובת הגוף. תקן כל איבר בסרט דביק על לוח פלסטיק (במצב פנים-למעלה).
  3. חותכים את העור ואז את השריר עם מספריים ניתוח. פתח את חלל בית החזה. עם מספריים כירורגיים לחשוף את הלב ולחתוך חלק קטן של האטריום הימני עם מספריים כירורגית נאה.
  4. מבשם העכבר עם מזרק 10 mL חד פעמיות מחדר שמאל עם PBS קר (סביב 30 mL לעכבר למבוגרים).
  5. מבשם העכבר עם 4% בכיוון התנועה (כ -30 מ ל ב -10 דקות למבוגר) עד שהוא נוקשה.
  6. לפתוח את הגולגולת של העכבר עם מלקחיים עצם. הסירו את המוח והכניסו לתוך 5 מ ל של 4% כלפי התחתית בצינורית צנטריפוגה של 15 מ"ל לפוסט-קיבוע ב -4 ° c.
    הערה: לנקות את האזור כירורגי לאחר הניתוח הסתיים.
  7. לפחות 24 שעות מאוחר יותר, להעביר את דגימות המוח לתוך 30% סוכרוז פתרון להתייבשות מלאה ב 4 ° c.

3. בנייה מוחית

  1. הטמע את דגימות המוח בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) במיכל קטן, וצנן את הטמפרטורה ב-20 ° c לפחות 1 h.
  2. דגימות מוח מקטע בעובי של 20-40 יקרומטר עם מיקרוסטט קריוטום.
  3. לאסוף מקטעים לתוך PBS ולאחסן ב 4 ° c.

4. מאימונולואובורנציה

  1. לאסוף את הסעיפים עם אזורי המוח ממוקד ולשים אותם לתוך צלחת 24-היטב עם PBS. עבור תאים מתורבתים על מחליק, ללכת ישירות לשלב 4.2.
  2. לשטוף עם PBS על שייקר בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.. חזור על זה פעמיים
  3. הסירו את ה-PBS, והתייחסו לרשימת הHCl של 1 מ' במשך 30 דקות ב-37 ° c.
    הערה: להכין הHCl 1 M על ידי הוספת 1 מ ל של חומצה הידרוכלורית (36-38%) לתוך 10 מ ל של מים בשכונה כימית. מחממים את הHCl 1 מ' בחממה ב 37 ° c.
  4. שטוף את הדגימות עם ה-PBS במשך 5 דקות.. חזור על זה פעמיים
  5. דגימות בלוק עם PBS המכילה 3% סרום עז רגיל 0.1% טריטון X-100 עבור 1 h על שייקר בטמפרטורת החדר.
  6. לילה ב -4 ° c על שייקר.
    הערה: השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: נוגדנים מפולי-שבטיים anti-5-הידרוקסימתילציטוסין (1:5000), העכבר נוגדן מונושבטיים אנטי NeuN (1:500).
  7. , תוציא את הדגימות. ועוד מודרות בטמפרטורת החדר לשעה
  8. שטפו את הדגימות בערוץ הPBS במשך 10 דקות.. חזור על זה פעמיים
  9. מודטה עם נוגדנים משניים המתאימים לנוגדנים העיקריים בטמפרטורת החדר עבור 1 h על שייקר. . כסו את הצלחת באלומיניום
    הערה: השתמש בנוגדנים המשניים הבאים: אלקסה Fluor 488 עז נגד ארנבת IgG (1:500), אלקסה Fluor 568 עז נגד עכבר מבוססי-IgG (1:500). גרעיני נגד כתמים עם 4 ′ -6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI).
  10. רחץ את הדגימות עם PBS עבור 10 דקות על שייקר. . חזור על זה פעמיים
  11. הר מקטעי המוח על השקופיות, להוסיף כמות נאותה של בינונית הרכבה antifade (סביב 100-150 μL), ולכסות עם זכוכית כיסוי פרימיום. . חותם עם לק
  12. לקחת תמונות עם מיקרוסקופ רגיל או קונפוקלית וקד הקרינה.

5. דנ א גנומית בידוד

  1. המתת חסד למבוגרים C57 BL/6J העכבר (זכר או נקבה) על ידי פריקה צוואר הרחם ולהסיר את המוח.
  2. מנתח את ההיפוקמפוס, הקליפה ואת הרקמות המוח על צלחת מקורר קרח. טוחנים רקמות עם מטחנת רקמות ב 1 מ ל של מאגר לפירוק DNA והעברה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי. הוסף 250 μg of פרוטטינואז K לכל 600 μL של מאגר הליזה. עבור כדורי תא, ישירות להוסיף מאגר הליזה, פרוטטינואז K, ו לערבב ביסודיות.
    הערה: הכנת מאגר לפירוק ה-DNA: 5 מ"מ EDTA, 0.2% SDS, 200 mM הנאקל ב-100 mM טריס-HCl, pH 8.5. רוחצים ומקלבים את מטחנת הרקמה לפני הניסוי.
  3. ביום השני, להוסיף כ 50 μg של RNase A לכל מדגם עבור לפחות 12 h ב 37 ° c.
  4. הוסף נפח שווה של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1) ולערבב לחלוטין.
  5. צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
  6. הוסף 600 μL של כלורופורם ל-supernatant כדי לזרז את ה-DNA, ולערבב היטב.
  7. צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את הסופרנטנט לתוך צינור חדש אחר.
  8. הוסף 500 μL של איזופנול לסופרנטאנט, וערבב היטב.
  9. צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את supernatant לחלוטין.
  10. לשטוף את המשקעים עם 1 מ ל של 70% אתנול, צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 1 דקות, ולהסיר את supernatant לחלוטין. . חזור על זה פעם אחת
  11. . תייבש את הגלולה לגמרי
  12. התמוססות את הגלולה DNA עם מאגר של Tris-HCl (pH 8.5) לריכוז הנכון.

6. כתם דנ א של נקודה

  1. הכינו את הפתרונות: 2 M NaOH, מאגר Tris-HCl (pH 8.5), 6x מלוחים נתרן ציטראט (מתחת לס).
  2. הפוך את הדוגמה לתערובת כטבלה 1.
  3. דגימות דנ א בספרות ב 100 ° c עבור 10 דקות, ולהתקרר על קרח.
  4. חותכים את הגודל המתאים של קרום ניילון (למשל, Hybond-N +) ולשטוף עם התחנה התחתית 6x.
  5. לשים את הקרום על מכשיר כתמי נקודה ולהתחבר למשאבת ואקום. ספוט 6 μL של תערובת לכל נקודה על הקרום.
  6. Hybridize עבור 30 דקות ב 80 ° c, ולחסום את קרום לדוגמה עם חלב ללא שומן ב מלוחים באגירה Tris (TBS) עבור 1 h.
  7. דגירה עם נוגדן ראשי ב 4 ° c לילה.
    הערה: הנוגדן העיקרי הבא: ארנב רב-שבטיים אנטי-5-הידרוקסימתיל (1:5000).
  8. ביום השני, מודפה את הקרומים לדוגמה בטמפרטורת החדר במשך 1 h. לשטוף עם TBS עבור 10 דקות. חזור על השטיפה. הזאת פעמיים יותר
  9. דגירה את הקרום עם נוגדן אנטי ארנב משני (1:5000) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. לשטוף עם TBS במשך 10 דקות. חזור על השטיפה הזאת פעמיים.
  11. . ומכמת את עוצמות האות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לחשוף את ההתפלגות של 5-hmC בהיפוקמפוס של עכברים למבוגרים, ביצעו immunofluorescence עם נוגדנים נגד תאים עצביים (NeuN) ו 5-hmC. בהיפוקמפוס, 5-hmC שיתוף מקומי היטב עם סמן תא עצבי NeuN (איור 1A-H), המציעה העשרה של 5-hmc ב נוירונים.

כדי לקבוע את הדינמיקה של 5-hmC במהלך התפתחות עצבית, כתם נקודה התבצע לראשונה עם דגימות DNA מבודדים מתרבים והבדיל תאים גזע עצבי מבוגרים (NSCs). תוצאות כתמי הנקודה הראו כי הרמה הגלובלית של 5-hmC גדלה באופן משמעותי במהלך הב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שינויים אפיגנטיים לשחק תפקידים חיוניים במהלך התפתחות המוח, התבגרות, ותפקוד. כסמן יציב עבור שינוי DNA, דינמי 5-hmC מגיב לעיבוד התנהגותי, פעילות עצבית, והוא מתואם באופן חיובי עם ביטוי גנים; לכן, הוא מעורב בתפקוד תקין של המוח והפרעה נוירולוגית4. כדי לחקור את תפקידה בתאים ורקמות, יש צורך לזהות את קיומו של 5-hmC ולהשוות את הרמה לפני ואחרי הטיפול. כאן, הדגמנו שתי שיטות נוחות כדי לזהות 5-hmC בתאים ורקמות, אשר ניתן לבצע עם ציוד משותף במעבדה.

המפתח מגיב של גילוי 5-hmC עם כתמים i...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא קיימים אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

XL היה נתמך בחלק על ידי תוכנית הלאומית R & D של סין (2017YFE0196600), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט Nos. 31771395, 31571518). Q.S. היה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFC1001703) ואת תוכנית מחקר ופיתוח מפתח של פרובינצית ג'ה-ג'יאנג (2017C03009). W.X. היה נתמך על ידי הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'ה-ג'יאנג (LY18H020002) ואת טכנולוגיית המדע של מחוז ג'ה-ג'יאנג (2017C37057).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD8417
Adobe Photoshop softwareAdobe Inc./
Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgGThermo FisherA11008
Alexa Fluor 568 עז נגד עכבר IgGThermo FisherA11001
אנטי-5-הידרוקסימתילציטוזיןמוטיב פעיל39769
אנטי-NeuNMilliporeMAB377
B27 תוסףGibco12587-010
תוסף B27Gibco12580-010
תוסף B27Gibco17504-044
Cryostat microtomeLeicaCM1950
DMEM/F-12 בינוניOmegaScientificDM25
גורם גדילה אפידרמיסPeproTech100-15
גורם גדילה פיברובלסטים-בסיסיPeproTech100-18B
ForskolinSigma-AldrichF6886
GlutaMaxThermo35050061
L-גלוטמיןGibco25030-149
מדיום נוירובזאליGibco21103-049
סרום עיזים רגילVector LaboratoriesZ0325
קרום ניילון (Hybond™-N+)Amersham Biosciences
OCTLeica14020108926
Pen StrepGibco15140-122
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24:1)סיגמא-אולדריץ'516726
פולי-די-ליזיןסיגמאP0899-10
פרוטאינאז KVVR39450-01-6
חומצהרטינואיתסיגמא-אולדריץ'R2625
טריטון X-100סולארביוT8210
RPN303B

מקורות

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905(2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194(2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903(2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זיהוי 5-הידרוקסימתילציטוזיןצביעה אימונופלואורסצנטיתדוט-בלוט של DNAרקמת מוח של עכברחיתוך רקמותמיקרוטום קריוסטטנוגדנים ראשונייםנוגדנים משנייםמיקרוסקופיה קונפוקלית
זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.