גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

מודלים ניסיוניים לבעלי חיים הינם חיוניים במחקרים חיסוניים בסיסיים. מינהל של חיידקים שלמים או מרכיבים מיקרוביאלית נעשה שימוש תכוף במודלים בעלי חיים קטנים כדי לגרום לדלקת מקומית או מערכתית¹. ליפופוליסכריד (LPS, או אנדוטוקסין חיידקי) הוא רכיב קיר תא ואנטיגן פני השטח של חיידקים גראם שליליים (למשל, בריקובאכניים, פסאודומונס spp.). המולקולה התרמויציבה והגדולה (משקל מולקולרי 1-4 x 10⁶ kda) מורכב moiety השומנים (ליפיד a), אזור הליבה (oligosaccharide), ו-o רב סוכר (או אנטיגן o). ליפיד A, עם שרשראות חומצות שומן הידרופובי שלה, עוגנים את המולקולה לתוך קרום חיידקי ו סכסוכי (על השפלה של חיידקים) את הפעילות החיסונית רעילות של lps. בעקבות הכריכה לחלבון איגוד lps (LBP), lps: LBP מתחמי פסיקים CD14/TLR4/MD2 מורכבות הקולטן ממוקם על המשטח של סוגי תאים רבים, גרימת תגובה חזקה proinflammatory עם טרנסלוקציה גרעינית NF-κB והבאים upregulation ביטוי של ציטוקין².

פגיעה חריפה בריאות (עלי) מוגדרת ככשל נשימתי חריף באמצעות בצקת בריאות דו-צדדית בהיעדר אי ספיקת לב³. מינהל דרכי הנשימה של lps היא דרך נפוצה כדי לגרום לדלקת ריאתי עלי^4,5,6,7. למרות שהחומר הסטרילי אינו מתאים לחקר התערבויות פרמקולוגית במחלות זיהומיות, ניתן לענות על שאלות אימונולוגיות מכניסטיות בדיוק מספיק. הסטיזילציה של LPS לתוך קנה הנשימה גורמת תגובה דלקתית חזקה עם הפלישה לוקיציט, upregulation של ציטוקינים proinflammatory, ושיבוש של מחסום מכתשי-נימי בתוך שעות לימים, בהתאם למינון LPS^{3, 6,7}.

הפרוטוקול המוצג מתאר נוהל צעד אחר צעד מפורט כדי לגרום לעלי בעכברים על ידי intratracheal לדבר. המודל אומת על ידי הערכת ביטוי ציטוקין, הפלישה נויטרופילים, ו מכתשיים הדליפה בתוך מכתשי כמתואר בעבר⁸.

פרוטוקול בעלי חיים זה אושר על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים (LANUV, רקלינגהאוזן, גרמניה; פרוטוקול 84-02.04.2015) ובוצע בהתאם הנחיות המכון הלאומי לבריאות לשימוש בעלי חיים חיים (הפרסום NIH No 85-23, תוקן 1996).

1. עלי השראה

1. השתמש במבוגר C57BL/6 עכברים בגילאים של כ 10-12 שבועות. הבית בעלי החיים בכלובים מאוורר באופן אינדיבידואלי עם גישה חופשית למים ואוכל מכרסם רגיל. עם זאת, ניתן לבצע גישה זו על בעלי חיים צעירים יותר עם זנים עכברים אחרים.
2. חנות LPS (EsO111 coli החיידק: B4) ב ali, בריכוזים של 5 מ"ג/mL ב-20 ° c. לגבי האינקטלציה, לדלל LPS בתמיסת מלח סטרילית באגירה (PBS) לריכוז הסופי של 2,000 μg/mL.
3. . שוקלים את העכבר הכנס קטמין [120 mg/ק ג משקל גוף העכבר (BW) ו xylazine (16 מ"ג/ק"ג BW) intraperitoneally (נמוך יותר משליש הבטן, פאראדין), ולחכות עד תחילת ההרדמה.
4. בדוק את עומק ההרדמה על ידי גרימת גירוי מישוש. במקרה של הרדמה מספקת, לחזור על הזריקה עם קטמין (30 מ"ג/ק"ג BW) ו xylazine (4 מ"ג/ק"ג BW).
5. מניחים את העכבר בתנוחה מועדת על שולחן טמפרטורה מבוקרת כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 ° c.
6. . כדי למנוע התייבשות של קרניות בהרדמה
7. הרם את הראש והקרס חותכות על פס אופקי הממוקם כ-5 ס מ מעל השולחן, בעוד שכפות הרגליים נשארות במגע צמוד עם השולחן. הארך את הצוואר בזווית 90 מעלות יחסית לטבלה (איור 1). להחזיק את הלשון עם מלקחיים כדי ליישר את הגרון לתנאי צנרור קל.
8. לגזור a 22 מד (ז) קטטר ורידי לאורך של 20 מ"מ. בעדינות להכניס את הצנתר בכיוון האנכי לאורך שורש הלשון. מניחים מקור אור קר על העור מעל הגרון כדי לעזור להמחיש את מיתרי הקול ולכוון את קנה הנשימה. אם התנגדות של הגרון מתרחשת, למשוך את הקטטר כמה מילימטרים לפני להתקדם שוב.
9. הכנס את הקטטר כ 10 מ"מ לתוך קנה הנשימה. ודא כי הכניסה אינה עמוקה מדי כמו זה יגרום הצטברות חד צדדית של נוזל לתוך ימין או שמאל ברונזה הראשי.
10. הכנס LPS (5 μg/g BW) מדולל ב-PBS באמצעות פיפטה [אמצעי אחסון מוזרק תלוי במשקל גוף העכבר (למשל, 20 גר' משקל ← להשתמש 50 μL של פתרון LPS)].
    הערה: העכבר יגיב בדרך כלל עם שיעול או מתנשף בחוסר הסדר המתאים של נוזל לתוך קנה הנשימה.
11. לחבר מזרק ולהוסיף בולוס של 50 מ"ל אוויר כדי להבטיח כי נפח נוזלי מלא מופץ בריאות. . הסירו לאט את הצנתר
12. לשמור על הגוף העליון של העכבר בתנוחה זקופה עבור 30 כדי למנוע דליפה של הנוזל מקנה הנשימה.
13. בבעלי חיים בעלי הפעלה מזויפת, הכנס 50 μL של הערוץ האחר במקום LPS.
14. הכנס בופרנורפין הידרוכלוריד 0.08 מ"ג/ק"ג תת-עורי לתוך העור רופף על הצוואר מיד לאחר האינדוקציה עלי ואת כל 12 h לאחר מכן, במהלך הראשון 48 h.
15. לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 ° צ' עד מודעות מלאה מגיעה על ידי שמירה על העכבר על משטח ההתחממות.
16. העבר את העכבר לכלוב מאוורר בנפרד עם גישה חופשית למזון ולמים. נטר את העכבר בקביעות. הפחתת טמפרטורת הגוף ודיכאון הנשימה מעיד על השראה מתאימה של עלי.

2. דגימת דם, ששטיפה ברונדושיים, קצירת איברים

הערה: עיתוי המתת החסד תלוי בסוגיה המדעית הנדונה. בדרך כלל, זה מבוצע 12-72 h לאחר ה, לאחר ה,^3,4,9,10. חומרת עלי ניתן לקבוע קלינית על ידי התבוננות סדירה של טמפרטורת הגוף ואת הסימפטומים מצוקה הנשימה¹¹.

1. לגרום הרדמה על ידי הצבת העכבר בחדר מוצף באיזוofלאנה. השתמש ב-3 שימוש בזרימת חמצן של 1 L/min. להבטיח הרדמה עמוקה על ידי גרימת גירוי מישוש. במקרה של עומק מספיק של הרדמה, להגדיל את isofלאנה עד 5 vol%.
2. להקריב את העכבר בהרדמה מעמיקה. ע י פריקת העורף לאטלנטיס
3. תקן את העכבר עם קלטת על טבלת פעולה ובקרוב לחטא את הפרווה על הבטן עם 70% אתנול. פתח את חלל הבטן בזהירות בקו החציוני עם מספריים ומלקחיים. להסיר חלקים של המעי כדי להשיג גישה אל הנחות הבנה קאווה (IVC) הזכות לעמוד השדרה ואת אבי העורקים הבטני.
4. לאתר את הוורידים כליה ולהוסיף כפוף 23 G צינורית מחובר מזרק 1 מ ל לתוך ה-ivc ישירות מתחת למפגש של הוורידים. מאספירין 250 μl של דם והעברה לתוך שפופרת 1.5 mL מלא 20 μl של 0.5 M ethylenediamiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii\ טלטל בעדינות כדי להקל על הערבוב של EDTA ולשים את השפופרת על הקרח.
5. עבור ששטיפה ברונמאשיים (BAL), להכין שלושה מזרקים mL 1 מ מ עם 0.5 mL של PBS סטרילי ו 0.1 mL של אוויר כל אחד. זמן קצר לחטא את הפרווה של הגרון עם 70% אתנול ולחשוף בזהירות את קנה הנשימה עם מספריים ומלקחיים. להניע את קנה הנשימה. ולעטוף תפר
6. לבצע BAL: נקב את קנה הנשימה באמצעות מיקרו מספריים ולהוסיף 22 קטטר ורידי ורידים לחתוך לאורך של 20 מ"מ. תקן את הקטטר עם תפר ו-in, 0.5 mL של PBS סטרילי ו 0.1 mL של אוויר. . מרוב הנוזל לאחר 60 ס חזור על ההליך עם שני מזרקים נוספים ולאסוף את כל הנוזלים בצינור 15 מ ל על הקרח.
7. פתחו בזהירות את החזה עם מספריים ומלקחיים כדי לקצור את הריאות. חותכים את הסרעפת לאורך השוליים הקוסטל וחותכים את הצלעות עם שני חתכים לרוחב. הימנע בזהירות מלשאת את הריאות. הרם את עצם החזה בגולגולת. ותקן או הסר אותו
8. הכינו מזרקים 2 10 mL עם 37 מעלות צלזיוס חם PBS (ללא סידן ומגנזיום). לעשות חתך קטן לתוך החדר השמאלי. לנקב את החדר הימני עם משחק 26 G צינורית ולשטוף את זרימת הריאות עם PBS הקדם. להיות מודעים לריאות להפוך חיוור במהלך ההליך.
9. להסיר את האונה הימנית של הריאות ולחתוך אותו בשני חצאים. הצמד-הקפאת אותם בחנקן נוזלי, ואחריו אחסון לטווח ארוך ב-80 ° c עבור ביטוי גנטי נוסף ניתוח חלבונים.
10. להסיר את הריאה השמאלית כולה ואת המגון את זה ב 48 צלחת היטב על ידי מיניב את הרקמה עם מספריים ו tweezer. מודדת את הרקמה 2 מ ל של מאגר העיכול [RPMI 1640 with 10% סרום עגל עוברי (fcs) ו 0.1% נאן₃, כולגאז I (1 מ"ג/ml), ו dnase II (7 מ"ג/mL)] ב 37 ° צ' עבור 60 min. לבצע הומוגון נוספת על ידי ליטוף זהיר של חתיכות רקמת ה למטה.

3. הכנת רקמות לניתוחי FACS

1. הכן מאגר FACS טרי (טבלה 1): השתמש תמיד ב-PBS ללא סידן ומגנזיום כדי להפחית את הדבקה של תא לתא-לתא התלוי בקטיון ולמנוע הסתעפות. תוספת עם FCS (1%) כדי להגן על התאים ואפופטוזיס, למנוע כתמים לא ספציפיים, ולמנוע תאים לדבוק צינורות FACS. כלול EDTA (0.5 mM) כדי למנוע הדבקה מבוססי-הקטיון תא לתא כאשר עובדים עם תאים נדבקים וחסיד כמו מקרופאגים. הוסף נתרן אזיד (0.1%), כפי שהוא מונע זיהום חיידקי והלבנת של fluorochromes וחוסם נוגדן שפיכת.
2. להעביר את דגימות הדם (צעד 2.4) לתוך 5 מנורות FACS ולערבב בעדינות את הדם עם 2 מ ל של מאגר פירוק הדם של תא דם אדום. לשים את הצינורות על הקרח ולסיים את התגובה לאחר 2 דקות על ידי הוספת 2 מ ל של הקרח קר PBS. צנטריפוגה את הדגימות עבור 5 דקות ב 400 x g ולהיפטר supernatant. להשעות מחדש את הגלולה תא עם 60 μL של מאגר FACS והתהליך עבור כתמים של FACS לאחר מכן על פי פרוטוקולים שתוארו בעבר¹².
   הערה: עיתוי של המתת חסד של השפעות העכבר לספירה כחלק מדלקת מערכתית. לכן, מומלץ להתאים את מספר התא ל 1 x 10⁶ תאים/60 μl בשלב זה כדי להשיג את התוצאות מכתים הטוב ביותר עבור הניתוח cy, try הזרימה.
3. צנטריפוגה נוזל BAL (שלב 2.6) עבור 5 דקות ב 400 x g. לאחר מכן, הקפאת הסופרנטאנט והקפא אותו בחנקן נוזלי, ואחריו אחסון לטווח ארוך ב-80 ° c לניתוח חלבון נוסף. השהה מחדש בל התאים עם 2 מ ל של מאגר facs קר, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה לתוך 5 ml facs צינור באמצעות מסנן רשת מ100 יקרומטר לרסן שערות.
4. שוב, צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 400 x g. השהה מחדש את הגלולה עם 60 μL של מאגר FACS ותהליך עבור כתמים של FACS לאחר מכן בהתאם לפרוטוקולים שתוארו בעבר¹².
   הערה: עיתוי של המתת חסד של השפעות העכבר לספור בתוך בל כחלק מדלקת. לכן, מומלץ להתאים את מספר התא ל 1 x 10⁶ תאים/60 μl בשלב זה כדי להשיג את התוצאות מכתים הטוב ביותר עבור הניתוח cy, try הזרימה.
5. העבר את רקמת הריאה השמאלית מתעכל (שלב 2.10) לתוך צינור של 5 mL FACS באמצעות מסנן שינוי מגוון 100 μL כדי לחלץ גושים ולסיים את תהליך העיכול על ידי הוספת 2 מ ל של מאגר FACS קר קרח. צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 400 x g. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 60 μL של מאגר FACS והתהליך עבור כתמים הבאים של FACS בהתאם לפרוטוקולים שתוארו בעבר¹².
   הערה: העיתוי של המתת החסד של השפעות העכבר ספירת לוקיציט ברקמת הריאה כחלק מדלקת. לכן, מומלץ להתאים את מספר התא ל-1 x 10⁶ תאים/60 μl כדי להשיג את התוצאות מכתים הטוב ביותר עבור ניתוח cy, הזרמת ציטונסה.
6. עבור ניתוח FACS, התאים המענבית עם CD16/CD32 נוגדן ב 4 ° צ' עבור 15 דקות כדי לחסום את הכריכה הלא ספציפית של האימונוגלובולין לקולטנים Fc. הוסף 20 μL של פתרון חסימת 1 x 10⁶ תאים ב 60 μl בתוך צינור 5 מ ל.
7. בינתיים, להכין תערובת הורים עם מאגר FACS ונוגדנים כפי שמתואר בטבלה 2.
8. לאחר חסימת, לא לשטוף את התאים. הוסף 20 μL של שילוב מאסטר נוגדן לדוגמה כדי לקבל את הנפח הסופי של 100 μL. מארג הדגימות עבור 20 דקות בחשיכה ב-4 ° c.
9. לשטוף כל מדגם עם 1 מ ל של מאגר FACS ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 400 x g. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה עם מאגר ה-FACS לריכוז התא המתאים עבור מדידות ה-FACS.
   הערה: מספר תא של 1 x 10⁶ תאים/500 μl הוא הציע להשיג את התוצאות הטובות ביותר של הפנוטיפים החיסונית בניתוח facs עם פרוטוקול זה. עם זאת, מומלץ לחייב את הנוגדנים בנפרד.
10. במקרה הצורך, הוסיפו כתמים חיים/מתים לפני הצביעת המשטח באמצעות ערכות מסחריות זמינות מסוימות⁸.
11. לבסוף, להוסיף מספרים קבוע של מסחרית fluorochrome בשילוב חרוזי כיול (3 x 10⁵ חרוזים ב 20 μl של מאגר facs) לכל מדגם כדי לקבוע מספרי תאים מוחלטים¹². באיור 2מוצגת אסטרטגיית היציאה לדם, בל ותאי הרקמה.

הגישה המתוארת כדי לגרום ALI בעכברים היה מאומת על ידי הערכת ביטוי cy, הסתננות נויטרופילים, ומחסום מכתשי-נימים הפרעה 24 h ו 72 h לאחר LPS הפרעות. בעלי חיים מוזרקים. שימשו כשליטה ממשלת intratracheal LPS הנגרמת תגובה יציבה הריאות הריאתי. ביטוי של TNF-α ברקמת הריאה היה upregulated באופן משמעותי, הגעה מתמשכת ויותר 50-קיפול להגדיל בהשוואה לבעלי חיים בקרה [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53.7 (SD = 11.6); 72 h: 55.0 (SD = 20.6); p < 0.05)] הפלישה הלוקוציט לתוך רקמה ומכתשיים היא סימן ההיכר ומאפיין לפיתוח עלי13. ניתוח FACS חשף חדירה משמעותית של נויטרופילים גרנולוציטים (NG) לתוך interstitium הריאה, עם ספירת תאים מוחלטים לאחר גדל כמעט 9-קיפול לעומת שולטת לאחר 24 h [65,243 (SD = 15,855) vs. 7,358 (SD = 4,794), p < 0.05] ( איור 3ב). מוחלט NG ספירה ירד מעט לאחר 72 h; עם זאת, הפקטור גדל לעומת הפקדים נשאר יציב [48,946 (SD = 5,223) לעומת 5,510 (SD = 654), p < 0.05]. בקנה אחד עם הסתננות NG ביניים, MMP-9 ביטוי רקמת הריאה כולה היה גם גדל באופן משמעותי על פני תקופת התצפית הכוללת [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7.4 (SD = 1.5); 72 h: 10.4 (SD = 2.0); p < 0.05] (איור 3ג).

NG לא הוגדלה רק ברקמת הריאה אלא גם בנוזל BAL. להגדיל את הקיפול לעומת חיות בקרה היה בולט יותר מאשר ברקמת הריאה, עם מוחלטים NG ספירות 24 h לאחר האינדוקציה ALI של 52,005 (SD = 21,906) vs. 1,829 (SD = 1,724) (p < 0.05) (איור 3ד). לאחר 72 h, NG הוגדלה כדי 37,254 (SD = 4,478) vs. 17.0 (SD = 10.8) (p < 0.05). בצקת ריאות עקב פגיעה קשה במכשול מכתשי-נימי היא פתולוגית לפיתוח עלי, כאשר lps ממריץ במהירות את האפופטוזיס של האנדותל ומגדיל את היכולת לחלחל14,15. ניתוח של תוכן אלבומין בנוזל בל על ידי אליסה חשף אובדן משמעותי של תפקוד המכשול. 24 שעות אחרי LPS לאחר המניפולציה, אלבומין בנוזל BAL היה 43 ng/mL (SD = 13), לעומת 20 ng/mL (SD = 9) תחת תנאי שליטה (p < 0.05) (איור 3E). לאחר 72 h, בעלי חיים ALI, תוכן אלבומין היה 48 ng/mL (SD = 14), לעומת 29 ng/mL (SD = 9) (p < 0.05).

איור 1 : דיאגרמה סכמטית של הגדרת הצנרור. יצוין כי הצוואר של העכבר צריך להיות סופר מורחב בזווית 90 ° יחסית לשולחן הפעולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2 : הקמת Facs מהווה אסטרטגיה לתאי דם, בל ורקמות. בלוטים של נקודות מופת של ניתוח FACS מוצגים בחלקות צבעוניות מדומות לשני פרמטרים (פלואורסצנטית בצבע כפול). האסטרטגיה המתאימה לדגימות מבוססת על תאים בודדים. (א) לעבור לתאי הדם: a = תאים מתים; b = תאים חיים (על פי כתמים לחיות/תא מתים; אין CD45 מכתים הכרחי כמו בדם, גבוהה באופן אוטומטי הופך את אוכלוסיות התאים להבדיל בבירור); ד = נויטרופילים גרנולוציטים; e = מונוציטים (על פי Gr1 ו CD115 כתמים). (ב) מיועד לעץ לאחר ששטיפה ברונבשיים (BAL) נוזל: a = תאים מתים; b = תאים חיים (על פי צביעת תא חי/מת); c = CD45+ תאים חיסוניים; ד = נויטרופילים גרנולוציטים; ו-e = מקרופאגים (לפי Ly6G ו-F4/80 כתמים). (ג) לעבור לרקמת ריאה: a = תאים מתים; b = תאים חיים (על פי צביעת תא חי/מת); c = CD45+ תאים חיסוניים; ד = נויטרופילים גרנולוציטים; ו-e = מקרופאגים (לפי Ly6G ו-F4/80 כתמים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 : ואלידציה של מודל מוריין עלי נגד בעלי חיים. (א) ביטוי של tnf-α ברקמת הריאה של הנקבה C57BL/6 עכברים 24 h ו 72 h בעקבות intratracheal לאחר הכול (שינוי מתקפל של ביטוי של בעלי חיים מופעלים). (ב) מנתח של מניופיל לספירת גרנולוציט המוחלטת ברקמת הריאה. (ג) ביטוי של mmp-9 ברקמת הריאה (שינוי מתקפל של ביטוי של בעלי חיים מופעלים). (ד) facs ניתוח של נויטרופילים מוחלטים בספירת גרנולוציט של ששטיפה ברונבשיים. (ה) התוכן אלבומין בנוזל BAL [פירושו ± SD, n = 7, מאן-ויטני U מבחן, * p < 0.05 (לעומת השליטה PBS)]. דמות זו השתנתה מ הארהאוט et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב של מאגר FACS.

טבלה 2: הכנת תערובת בסיס עבור כתמים של FACS. הטבלה מתארת הכנה לערבוב הורים עבור 10 דגימות.

. למחברים אין מה לגלות