הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

10.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60002

⸱

22 ביולי 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

במאמר זה

סיכום

השילוב של תיוג נוגדנים, ניקוי אופטי, ומיקרוסקופ אור מתקדם מאפשר ניתוח תלת מימדי של מבנים או איברים מושלמים. המתואר כאן היא שיטה פשוטה לשלב אימונויניום של פרוסות כליות עבות, ניקוי אופטי עם cinnamate אתיל, והדמיה מיקוד המאפשר הדמיה וכימות של מבנים תלת ממדיים כליה.

תקציר

שיטות ניקוי אופטי להפוך את רקמת שקוף על ידי הפחתת מדד השבירה לאורך מדגם עבור הדמיה תלת מימדי בעקבות (3-D). הם זכו לתשומת לב רבה בכל תחומי המחקר של הפוטנציאל לנתח מבנים מיקרוסקופיים מרחבי האזור המתפרסים על פני מרחקים מאקרוסקופיים. בהינתן כי tubules כליה, ואצלב, עצבים, ופקולי להאריך בכיוונים רבים, אשר נתפסו רק חלקית על ידי טכניקות דו ממדיות מסורתיות עד כה, ניקוי רקמות גם פתח אזורים חדשים רבים של מחקר כליות. רשימת שיטות הסליקה האופטיות גדלה במהירות, אך היא נותרת קשה למתחילים בשדה זה כדי לבחור את השיטה הטובה ביותר לשאלת מחקר נתונה. בתנאי כאן היא שיטה פשוטה המשלבת התיוג נוגדנים של פרוסות כליה עבה העכבר; ניקוי אופטי עם זול, לא רעיל ומוכן לשימוש כימי אתיל cinnamate; והדמיה ממוחשבת. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפעיל את הכליות ולהשתמש בצעד לאחזור אנטיגן כדי להגדיל את הנוגדן מבלי לדרוש ציוד מיוחד. היישום שלה מוצג הדמיה של מבנים שונים מגוונים בתוך הכליה, וכיצד לפתור חדירה של נוגדנים עניים לתוך רקמות ממוען. אנחנו גם לדון בקשיים פוטנציאליים של הדמיה מיאלואידית fluorophores ורכישת דגימות גדולות מאוד ואיך להתגבר עליהם. פרוטוקול זה פשוט מספק כלי קל להתקנה ומקיף כדי ללמוד רקמות בשלושה מימדים.

מבוא

העניין הגובר בלימוד איברים שלמים או מבנים מרחבי היקף גדולים הובילו לפיתוח שיטות סליקה אופטיות המערבות הדמיה של רקמה שקופה בשלושה מימדים. עד לאחרונה, השיטות הטובות ביותר להערכת מספר התא, אורך, או כמות של מבנים שלמים היו סטריאולוגיה או שיקוף סדרתי ממצה, אשר מבוססת על דיגום מערכתי של רקמות לניתוח הבאים בשני ממדים1, מיכל השני , 3. עם זאת, שיטות אלה צורכת זמן רב וזקוקים לרמה גבוהה של אימון ומומחיות4. שיטות ניקוי אופטי להתגבר על בעיות אלה על ידי הפחתת מדד השבירה לאורך מדגם כדי להפוך את רקמת שקוף להדמיה תלת-ממדית5,6,7.

מספר שיטות ניקוי אופטי פותחו אשר ליפול שתי קטגוריות עיקריות: הממס מבוססי שיטות מבוססות מימית. שיטות מבוססות מים ניתן לחלק עוד לטבילה פשוטה8,9, היפרחות10,11, ו הידרוג'ל הטבעה12,13. שיטות מבוססות ממס מייבשים את הרקמה, מסירים שומנים ומנרמל את מדד השבירה לערך סביב 1.55. מגבלות של רוב השיטות המבוססות על הממס הם המקוטטים של קרינה אנדוגניים של חלבונים העיתונאי הנפוץ בשימוש כגון GFP, רעילות ממס, יכולת לפזר דבקים המשמשים כמה חדרי הדמיה או עדשות אובייקטיבי, ואת הצטמקות של רקמות במהלך , התייבשות14,15,16.17,18,19,20,21 עם זאת, שיטות מבוססות-ממס הן פשוטות, יעילות בזמן, ויכולות לעבוד במספר סוגי רקמות שונים.

שיטות מבוססות מים להסתמך על טבילה של הרקמה בפתרונות מימית כי יש מדדי השבירה בטווח של 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . שיטות אלה פותחו כדי לשמר את החלבון אנדוגני של כתבת פלורסנט ולמנוע הצטמקות המושרה, אבל מגבלות של רוב מימית מבוססי שיטות סליקה כוללים משך זמן ארוך יותר של הפרוטוקול, הרחבת רקמות, ו שינוי חלבון (כלומר דנטורציה חלקית של חלבונים על ידי אוריאה בפרוטוקולים היפרליחות כגון סקהלהA2)7,11,23,25. הרחבת הרקמה מפנה שתנן עם sorbitol, אשר מאזנת נגד ידי התייבשות הרחבת רקמות אוריאה-המושרה, ושימר את מבנה בדיקת הרקמה כפי שמוערך על ידי אלקטרון מיקרוסקופ10. הצטמקות רקמות או התרחבות משפיעים על הגדלים המוחלט של מבנים, מרחקים בין אובייקטים או צפיפות תא לכל אמצעי אחסון; כך, מדידת גודל שינויים על ניקוי של הרקמה עשויה לעזור לפרש את התוצאות המתקבלות7,26.

באופן כללי, פרוטוקול לניקוי אופטי מורכב ממספר שלבים, כולל טיפול מקדים, חדירות, אימונואולבלינג (במידת הצורך), התאמת מדד השבירה והדמיה עם מיקרוסקופ אור מתקדם (למשל, שני פוטון, מוקד, או מיקרוסקופ אור-זריחה מגיליון קל). רוב הגישות המסלקות פותחו כדי להמחיש את הרקמה העצבית, ומחקרים מתפתחים מאומתים את יישומם באיברים אחרים5. זה כלי מקיף כבר הפגינו בעבר כדי לאפשר ניתוח אמין ויעיל של מבנים כליות, כולל פקיולי27,28, החיסונית מחלחל28, ואסיקובלטורה28, ומגזרים כדורית 29, וזה גישה אידיאלית להבנה טובה יותר של תפקוד הפקפיות ושיפוץ כדורית בריאות ומחלות.

מסוכם כאן היא שיטה מבוססת ממס המשלבת כתמים חיסוני של tubules כליה; ניקוי אופטי עם זול, לא רעיל, ומוכן לשימוש כימי אתיל cinnamate (אי סי אי); והדמיה מיקרוסקופית הקונטוקלית המאפשרת הדמיה וכימות מלאה. שיטה זו היא פשוטה, משלבת אנטיגן-איחזור של פרוסות כליות עם כתמים של נוגדנים מסחריים, ואינו דורש ציוד מיוחד, מה שהופך אותו לנגיש לרוב המעבדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אורגון בריאות ומדע אוניברסיטת, פורטלנד, אורגון, ארה ב, ורשויות מקומיות רלוונטיות באאכן, גרמניה.

1. הבטן רטרוזיזיה של אבי העורקים ואת קיבעון של כליות העכבר

  1. הכינו פתרונות באותו יום או ערב לפני והחנות במקרר למשך הלילה. פתרונות חמים לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
  2. הפוך את האצווה הטרייה של 3% פאראפורמלדהיד (PBS) בתמיסת מלח 1 x פוספט באגירה. כ 50-100 מ ל בכיוון הנכון של העכבר נדרש לכל העכברים.
    1. כדי להפוך 1 L של 3% בתחתית: שוקל 30 גרם של המשחק החצי הראשון ולהוסיף 800 mL של מים מזוקקים במנוע. מערבבים ומחממים עד 50-60 ° c. אין לחמם מעל 70 ° c.
      התראה: הכיוון הכדורגלן רעיל. . הכן את הכדורגלן בתוך המנוע
    2. הוסף באיטיות מספר טיפות של 2N NaOH. המתן כמה דקות עד שה "נכנס לפיתרון או יוסיף עוד כמה טיפות. כמה גושים קטנים לא להמיס.
    3. הסר את הפתרון מהחום. הוסף 50 mL של 20x PBS. להירגע על הקרח כדי RT.
    4. התאם את ה-pH ל-7.3-7.4 עם HCl. הוסיפו מים מזוקקים ל-1 ל.
    5. הסר את כל החלקיקים שאינם מומס על ידי סינון 1x PBS ו 3% בכיוון הערוץ עם פילטר יקרומטר 0.22.
  3. הוסיפו 1,000 יחידות של הפארין ל-1 ליטר של 1x PBS. העברת 1x PBS המכיל הפארין ו 3% בכיוון ההפוך ב-1x PBS לתוך הנפרד 50 mL מזרקים פלסטיים.
    הערה: אם הוא זמין, משאבת לחץ המופעל על 80-100 mmhg או לחץ הידרוסטטי (שיטת הטפטוף, הגובה של פתרונות זלוף: 160-200 ס"מ על בעל חיים) ניתן להשתמש עבור זלוף כליה.
  4. חבר את ה-PBS, המשחק החצי השלישי והמחט פרפר בצורת שלושה כיוון. ודא שאין בועות אוויר במערכת כולה.
  5. התווית צינורית של 15 מ ל ומחלק 10 מ ל לתוך זה.
  6. מורדם עמוקות זכר או נקבה C57BL/6 עכבר 12-24 שבועות של גיל באמצעות 120 מ"ג/ק"ג משקל הגוף קטמין 16 מ"ג/ק"ג משקל הגוף xylazine. יש לבדוק את בעל החיים על העדר היענות מלאה על-ידי צבירות הרפלקסים לפני שממשיכים לניתוח (למשל, רפלקס הבוהן).
  7. ברגע שהחיה הגיעה למישור כירורגי של הרדמה, הניחו אותו על גבו מתחת למיקרוסקופ הבתר. בניתוח לפתוח את הבטן עם חתך בטן באמצע באמצעות מספריים הפעלה לחשוף את אבי העורקים הבטן.
  8. הצמד את אבי העורקים הבטני מעל ההסתעפות לעורק הראשי באמצעות דימום מעוקל. לאחר מכן הצמד את אבי העורקים הבטני ממש מתחת לעורקים הכליות עם מיקרו שיפור. לעשות חתך קטן (1 מ"מ) על אבי העורקים הבטן בין שני מלחציים עם vannas מספריים. הכנס את המחט פרפר לתוך החתך לאט ולהיזהר לא לקרוע את אבי העורקים הבטן פתוח.
  9. ליגייט עורק הכליה הימני עם תפר משי 5-0 ולהסיר את הכליה הנכונה לניתוח אחר אם רק אחת כליה נדרשת עבור זלוף ו קיבעון.
  10. הסר את מיקרו העידון, החלפת וריד השער עם מספריים vannas, ומיד מיד עם 50 mL של PBS המכיל הפארין, ולאחר מכן לעבור ומבשם עם 50 mL של 3% בתחתית.
    הערה: לחץ היתוך גבוה דרך אבי העורקים הבטן נדרש כדי לפתוח tubules כליות עבור דיפוזיה נוגדן טוב יותר דרך הרקמה. הפרזיה דרך הלב לא יכולה לפתוח את הכליות.
  11. לאסוף את הכליה בזהירות ולהימנע מפני לסחוט את הרקמה.
  12. להסיר את הקפסולה ולחתוך את הכליה לתוך 1 מ"מ פרוסות ילתית עבה. השתמש במטריצה מבצעה (טבלת חומרים) כדי לתקנן את עובי הפרוסה.
    הערה: לחילופין, שקול להשתמש בשיטת רטט.
  13. הישאב את פרוסות הכליות לתחתית מוכנה באמצעות שפופרת חרוט בעלת תווית של 15 מ"ל.
  14. מחלק 10 מ ל של הרכבת התחתית לכיוון אחר המסומן ב-15 מ"ל. ריקון התרנגול שלוש כיוון ומחט פרפר עם PBS לפני המעבר לעכבר הבא.
  15. ביצוע הפוסט-קיבוע בלילה בשעה RT מוגן מפני אור.

2. הכנת רקמה ומכתים

  1. לאחר קיבעון, לשטוף את פרוסת הכליה פעמיים עם מאגר לשטוף 1 x (טבלת חומרים) עבור 1 h על הנדנדה אופקי ב RT.
  2. בצע אחזור אנטיגן. לחמם את 300 mL של הפתרון הבלתי מיסוך של 1x אנטיגן (Tמסוגל של חומרים) ב-500 ml בגביע ל 92-98 ° c. הקף את הפרוסה בהטבעת חדירות הקלטות למאגר המחומם באמצעות ערבוב של 1 h ב-92-98 ° c. להסיר את הגביע מהחום ולהשאיר אותו קריר כדי RT.
    הערה: חלק מהספקים בודקים את הנוגדנים שלהם עבור יישום אימונוהיסטוכימיה ויכלול שיטת אחזור אנטיגן המוצע בגליון הנתונים. לכן, מספר אפיסקופים עשויים לדרוש מאגר בסיסי יותר (לדוגמה, pH 9).
  3. העבר את הפרוסה לתוך 10 מ ל של מאגר שטיפת 1 X עם 0.1% טריטון X-100 ורוק לילה ב RT. שטוף את הפרוסות 2x עם 10 מ ל של מאגר שטיפת חדש 1x עבור 1 h למחרת.
  4. לדלל את הנוגדן העיקרי ב 500 μL של נוגדן נורמלי מדלל (טבלת חומרים). . התחילו בריכוז של 1:50-1:100 בעדינות לנדנד את פרוסת הכליה בנוגדן ראשוני מדולל עבור 4 ד ב 37 ° c.
    הערה: מאז כל נוגדן יש תכונות ייחודיות, טמפרטורה במהלך דגירה הנוגדן ו דילול של נוגדן צריך להיות ממוטב עבור בדיקה בודדים. עבור נוגדנים משני בלבד שולטת, מודטת רקמת כליה בדילול ללא נוגדן ראשוני. במקום נוגדן מסחרי דילול, 1x PBS עם 0.1% טריטון X-100 ו 0.01% נתרן אזיד ניתן להשתמש.
  5. לשטוף את הפרוסה כליה ב 10 מ ל של 1x מאגר לשטוף לילה ב RT עם שינוי אחד של מאגר לשטוף אחרי 8 h.
  6. דלל את הנוגדנים המשניים (למשל, 1:100 עבור אלקסה Fluor מצומדת נוגדנים משני) ב 500 μL של נוגדן רגיל מדלל. מודלת את פרוסות הכליה בנוגדן משני מדולל במשך 4 ימים ב 37 ° c. משלב זה והלאה, הגנו על פרוסות הכליות מהאור.
  7. לשטוף את פרוסות כליה ב 10 מ ל של 1x מאגר לשטוף לילה ב RT עם שינוי אחד של מאגר לשטוף אחרי 8 h.

3. ניקוי רקמות

  1. העבר פרוסה כליה ל 5 מ ל של כיתה גבוהה 100% אתנול (טבלת חומרים) עבור 2 h ב RT עם נדנדה עדין (עם שינוי אחד לאתנול טרי אחרי 1 h). . השלב הזה הוא להתייבשות ברקמות
    הערה: אתנול בדרגה גבוהה נדרש כדי להשיג ברקמות גבוהות הרי בשלב הבא. מתנול או טטרהידרופורזה הם התייבשות אלטרנטיבית ריאגנטים עם פוטנציאל מדליפיזציה גבוהה.
  2. לטבול את פרוסת הכליה ב 2 מ ל של אי סי איי (טבלה של חומרים) עם נדנדה עדין ב RT (עם שינוי אחד טרי אי סי לאחר 2 h) לילה.
    הערה: נקודת ההקפאה/ההיתוך של אי סי איי היא 6-8 ° c. לכן, אין לאחסן דגימות במקרר. התנהלות הטבילה בתוך מאוורר כראוי המאוורר ולהימנע מגע ישיר עם בגדים ועור (אי סי איי הוא מזון לא רעיל מינהל התרופות מאושר מתחם אבל יש ריח חזק). השתמש בצינורות או בכלי זכוכית רגילים (ללא כלי פוליסטירן).
  3. ניתן להשיג את הרקמה הטרנסלוסנסי לאחר הטבילה וכאשר פרוסות הכליות מוכנות לדימות.

4. ניתוח תמונה

הערה: עבור הדמיה, טכניקות מיקרוסקופ אחרות ניתן להשתמש כל עוד מדד השבירה התאמת פתרון תואם את העדשה האובייקטיבית. הפרוטוקול הזה משתמש. במיקרוסקופ מיקוד הפוך

  1. הוסף 600-1000 μL של אי-סי-איי לתוך המנה התחתונה בזכוכית (טבלת חומרים).
    הערה: הימנע משימוש במאכלים רגילים של תרבות התא, משום שאיי סי אי הוא מממס אורגני שימוסס את מנות הפלסטיק. באופן דומה, איי. סי. אי עלולים לתקוף חלקי פלסטיק/בידוד טבעות על עדשות אובייקטיבי. עיין בדוחות המתאימים לקבלת סקירה של מנות הדמיה תואמות30 ותאי מודפס תלת-ממדיים בעלי הדפסה עצמית28.
  2. העבר את פרוסת הכליה השקופים לתוך המנה. הניחו שמיכות עגולות על פרוסת הכליה כדי להחיל לחץ קל כלפי תחתית הזכוכית. חותם את הצלחת עם סרט פרפין (לוח חומרים) כדי למנוע דליפה של אי סי אי.
    הערה: איברים שלמים או מספר פרוסות רקמה בעובי מילימטר עשויים לדרוש גבול (מלט שיניים או אלסטומר סיליקון; ראה לוח חומרים) סביב הרקמה כדי להפוך את הבריכה אי-סי עבור המדגם.
  3. מניחים את הצלחת על פלטפורמת הדמיה מיקרוסקופ.
  4. לקחת כמה z-ערימות ולבצע תפרים. התחל בגודל z-step של 5 μm.
    הערה: שקול להשתמש במרחק עבודה ארוך (> 5 מ"מ) ו צמצם מספרי גבוה (> 0.9) מטרות עבור הדמיה של פרוסות רקמה עבה מאוד או איברים. לאחר הדמיה, להעביר את הרקמה חזרה אתנול ולאחסן מאגר לשטוף או PBS עם 0.02% נתרן azide.
  5. לנתח את התמונה באמצעות עיבוד תלת-ממדי עם תוכנה (רשימת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הכליות הן איברים מורכבים המורכב של 43 סוגים שונים של תאים31. רוב התאים הללו יוצרים מבנים גדולים בעלי מבנה משני, כגון גלואראולי וטובוקלס, ותפקידם תלוי מאוד באינטראקציות עם הזולת. טכניקות היסטולוגית קלאסיות לכידה חלקית של מבנים גדולים אלה עשויים להחמיץ שינויים מוקד בתוך מבנים שלמים31. כך, ניתוח תלת-ממדי באמצעות טכניקות ניקוי אופטי מסייע להבין כיצד הם פועלים בבריאות ובמחלות.

רוב שיטות הסליקה האופטיות המבוססות על הממס לפחות יאריכו באופן חלקי את אות ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכניקות ניקוי אופטי זכו לתשומת לב רבה להדמיה תלת-ממדית ולקוונפיקציה של מיקרואנטומיה באיברים שונים. כאן, שיטת סליקה מבוססת ממס (אי סי אי) היתה משולבת עם אימונויניום עבור הדמיה תלת-ממדית של הפקעת שלמות בפרוסות כליה. שיטה זו פשוטה, זולה ומהירה. עם זאת, שאלות מחקר אחרות עשויות לענות באופן הטוב ביותר עם פרוטוקולי סליקה אחרים5. חשוב גם לזכור כי שיטות מבוססות ממס לגרום להתכווצות רקמות במעלות משתנה, בעיקר בשל התייבשות שלב14,18. רוב השיטות המבוססות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

T. S. נתמך על ידי מענקים מן הקרן DFG המחקר הגרמני (332853055), אחר Krner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), ואת הפקולטה לרפואה של אאכן (RWTH התוכנית ריטרנר). V. ג. פ. נתמך על ידי מלגות מחקר מתוך הפרווה הלאומית של דויטשה גיישכטר, קרן אלכסנדר פון הומבולדט, והמועצה לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה. ד. ה. ה. נתמך על ידי פונפה לדקיו. ר. ק. נתמך על ידי מענקים של DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), המדינה של Norhinewestfalia (MIWF-NRW) ואת המרכז הבינתחומי למחקר קליני ב RWTH האוניברסיטה של אאכן (O3-11).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; m פילטרפישר סיינטיפיק09-761-112
15 מ"ל צינור חרוטיפישר סיינטיפיק339650
21 G מחט פרפרבראוןונופיקס
תלת כיווני פקקפישר סיינטיפיקK420163-4503
תוכנת ניתוח תלת מימדBitplane AGIMARIS
תוכנת ניתוח תלת מימדCellprofilerתוכנת קוד פתוח בחינם
5-0 תפר משיFine ScienceTools 18020-50 50
מ"ל מזרקי פלסטיקפישר סיינטיפיק14-817-57
נוגדן חד שבטי נגד BrdURoche11296736001
מדלל נוגדניםDakoS0809
CD31-647BioLegend102516
תמיסת אחזור אנטיגן מבוססת ציטראטVector LaboratoriesH-3300
Curved hemostatFisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
ניתוח מיקרוסקופMoticDSK-500
הטמעת קלטותקארל רוטE478.1
אתנולMerck
אתיל סינמטסיגמא-אולדריץ'112372
סרט גמיש/פרפילם Mסיגמא-אולדריץ'P7793
עז אנטי-AQP2סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-9882
חזיר ניסיונות אנטי-NKCC2N/AN/ADOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClקארל רוטP074.1
הפריןSagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
נדנדה אופקיתLabnetS2035-E
צלחת הדמיהIbidi81218
קטמיןMWI בריאות בעלי חיים501090
Micro serrefineFine Science Tools18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
מספריים הפעלהMerit97-272
ParaformaldehydeThermo Fischer ScientificO4042-500
ארנב אנטי-פוסוThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
אלסטומר סיליקוןמכשירי דיוק עולמיים Kwik-SilKWIK-SIL
נתרן אזידSigma-AldrichS2002
פורס רקמותZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
Vannas מספרייםFine Science Tools15000-00
VibratomeLancer Series 1000
XylazineMWI Animal HealthAnaSed Inj SA (קסילזין)
100983

מקורות

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916(2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות קונפוקאלישחזור אנטיגןאתיל צינמטסימון נוגדניםדימות תלת-ממדישקיפות רקמהחלבונים פלואורסצנטייםקיבוע בפאראפורמאלדהיד
ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.