תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

Summary

הפרוטוקול מתאר את התיוג הספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם כתם של דנ א הזמין מסחרית, רכישת סדרה של לשגות בזמן של תאים בעלי תווית חיה על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SR-SIM), ומעקב אוטומטי של תנועה נוקלאואידית.

Abstract

נוקלאונואידים מדריאידים הם חלקיקים קומפקטית שנוצרו על ידי מולקולות DNA מיטוכונדריאלי מצופה חלבונים. דנ א מיטוכונדריאלי מקודד tRNAs, rRNAs, ומספר polypeptides מיטוכונדרימי חיוני. נוקלאונואידים מיטוכונדרילי לחלק ולהפיץ בתוך רשת מיטוכונדריאלי דינמית העוברת ביקוע/פיוז'ן ושינויים מורפולוגיים אחרים. ברזולוציה גבוהה לחיות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא טכניקה פשוטה לאפיון העמדה והתנועה של נוקלאואיד. עבור טכניקה זו, הנוקלאואידים מסומנים בדרך כלל באמצעות תגי פלורסנט של רכיבי החלבון שלהם, כלומר שעתוק הגורם (TFAM). עם זאת, אסטרטגיה זו זקוקה לביטוי יתר של חלבון פלורסנט לבנות מתויג, אשר עשוי לגרום לפריטים (מדווחים על TFAM), והוא אינו אפשרי במקרים רבים. לצבעי ה-DNA האורגניים אין החסרונות הללו. עם זאת, הם תמיד להראות כתמים של DNAs הן גרעינית ומיטוכונדריאלי, ובכך חסר ספציפיות לנוקלאונואידים מיטוכונדרילי. על-ידי לקיחת בחשבון את התכונות פיזיקאלית-כימיות של צבעים כאלה, בחרנו הזרע חומצה גרעין כתם (SYBR Gold) והשיגה תיוג מועדף של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים. מאפייני הצבע, במיוחד הבהירות הגבוהה שלה על הכריכה ל-DNA, לאפשר כימות הבאים של תנועה נוקלאואיד מיטוכונדריאלי באמצעות סדרת זמן של תמונות תאורה מובנית ברזולוציה סופר.

Introduction

מעגלית 16.5 kbp מולקולות DNA להוות את החומר הגנטי של המיטו, קידוד 22 tRNAs, 2 rRNAs, ו -13 פוליפפטידים הדרושים למערכות זרחון חמצוני מיטוכונזילציה. דנ א מיטוכונדריאלי מאוגד מקדם תמלול מיטוכונדריאלי (tfam) וחלבונים אחרים מהווים את הנוקלאונואידים מיטוכונדריאידים^1,2,3,4. נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים משנים את הפיזור בין המרכיבים של רשת מיטוכונדריאלי^5,6 במהלך שיפוץ מורפולוגית שלה, ביקוע או היתוך בהתאם לשלב מחזור התא, מתח, וגורמים אחרים (נבדק בתוך pernas ואח '⁷). בנוסף, התנועה של נוקלאונואידים מיטוכונדרילי, הוא מעורב זאבת מערכתית מחלת אודם⁸ ועשוי לשחק תפקיד במחלות אחרות. מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית היא טכניקה פשוטה ללימודי תאים לחיים של אורגלים, אבל לטכניקה יש רזולוציה של > 200 ננומטר, שהוא גדול יותר מהגודל של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים (~ 100 nm^9,10,11,12). מגבלה זו בוטלה על-ידי המכונה "טכניקות סופר-ברזולוציה", כגון מחסור בפליטה מאולצת (הוהיסטד) ומיקרוסקופ בודד לוקליזציה של מולקולה (smlm)^13,14. עד כה, נוקלאונואידים מדריאידים ו-DNAs אחרים היו מאופטים בתאים חיים על ידי מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישירה (Dnas)¹⁵. פיין מבנים תת מיטוכונדריאלי עם תנוחות הקשורות עם mtDNA נצפו על ידי סטד בתאים חיים¹⁶. עם זאת, אלה טכניקות סופר ברזולוציה דורשים עוצמת תאורה גבוהה, מה שגורם להשפעות פוטורעילות על תאים חיים¹⁷. לכן, פקיעה הזמן הדמיה של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם רזולוציה מעבר למגבלת עקיפה היא מאתגרת. כדי להתייחס לכך, השתמשנו במיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה סופר (SR-SIM)¹⁸. ה-SIM מחייב הרבה יותר כוח התאורה מ-סטד ו-SMLM¹⁹. יתר על כן, בניגוד לטכניקות הסטד ו smlm, ה-SIM מאפשר הדמיה פשוטה ססגוניות תלת מימדי (3d), וזה לא דורש מאפיינים פוטופיסיים מסוימים של fluorophores או מאגר הדמיה הרכב¹⁹.

האסטרטגיה המקובלת לתיוג נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים היא תיוג פלורסנט של חלבון נוקלאואיד מיטוכונדריאלי, כגון TFAM²⁰. עם זאת, במקרים רבים, אסטרטגיה זו אינה מתאימה. יתר על כן, ביטוי יתר של חלבון פלורסנט-מתויג TFAM מייצרת חפץ רציני²¹. התוויות של דנ א עם צבעים אורגניים יש יתרונות מעל חלבון פלורסנט (FP) מבוססי אסטרטגיה. צבעים אורגניים הם ללא מגביל הקשורים לתיוג FP: הם יכולים לשמש עבור כל סוג של תאים או tissueand יכול להיות מיושם בכל נקודת זמן של ניסוי. הדמיה של תאים חיים של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים דווחה עם מספר צבעים מחייב DNA: dapi²², sybr ירוק²³, וברנט דיקטקל²⁴, ו picogreen^15,25,26. חיסרון משמעותי של רוב DNA-מחייב צבעים עבור תיוג נוקלאואיד הוא שהם כתם כל ה-DNA בתוך התא. מיקוד לצבוע בלבד DNA מיטוכונדריאלי הוא רצוי מאוד. כדי להשיג את זה, בחירה זהירה של צבע בעל תכונות מתאימות פיזיקאלית-כימיות הוא הכרחי. צבעי ליפוהיפילית בעלי מטען חיובי מנוקד, כגון rhodamine 123, ידועים לצבור בחיים המיטופינים, אשר לשמר את הפוטנציאל הממברנה שלילית שלהם. בנוסף, צבע אידיאלי עבור תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים צריך לאגד דנ א עם זיקה גבוהה לפלוט פלואורסצנטית בהיר על כריכת ה-DNA. בהתחשב דרישות אלה, cyanines מסוימים הם מבטיחים (למשל, picogreen), אבל DNA גרעיני הוא מוכתם בשפע על ידי צבעים אלה בו עם דנ א מיטוכונדריאלי^15,25,26. הפרוטוקול הנוכחי מתאר תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים עם צבע cyanine אחר, SYBR גולד (SG), ומעקב אחר הנוקלאונואידים בזמן לשגות סופר וידאו SIM ברזולוציה. יתר על כן, התאים לחיות SG ויטראז ניתן ליצור תמונה על ידי כל סוג של מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה (confocal וקד, מסתובב דיסק, epiפלואורסצנט, וכו ') מתאים לתאים חיים מצויד עם מקור אור ננומטר 488.

Protocol

הערה: כל הקווים המוזכרים כאן היו מתורבתים בינונית גבוהה של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום של שור עוברי (FBS), גלוטמין, פניצילין/סטרפטומיצין, ו פירובט. השפה כל מדיה ותוספי מזון לשמש ביום של תיוג והדמיה על ידי מחמם אותם עד 37 ° c בחממה להגדיר 5% CO₂. כל תרבות התא עבודה כולל תיוג מתרחש בתנאים סטרילי תחת כיסוי הזרימה לבינארי.

1. תיוג תאים חיים

1. יום אחד לפני הליך תיוג, תרבות 4 x 10⁵ תאי הלה ב 2 מ ל של בינוני בצלחת פטרי 35 מ"מ עם #1.5 זכוכית תחתית. ניתן להשתמש בשקופיות מרובות שקופיות, אך יש לכוונן אמצעי אחסון באופן פרופורציונלי לעוצמת הקול של הבאר. לדלל את ההשעיה התא יש כ 50,000 תאים/mL וזרע 2 מ ל של השעיית התא בצלחת פטרי 35 מ"מ.
2. הכינו את הדלעות הבאות של פתרון מלאי מסחרי של SYBR גולד (SG): 1:5000. הכינו מיטומעקב אדום עמוק (כתם אדום רחוק) או מיטלגשש CMXRos אדום (כתם אדום) (טבלת חומרים; מלאימסחרימדולל 1:2000) במדיום התרבות האדום נטול פנול. הכן את אותן מדלעות הערכה של picoGreen כמו עבור SG.
   הערה: הפתרונות המתוארים בשלב 1.2 הם הפתרונות לתיוג 2x. הגן על כל הפתרונות המכילים צבעי פלורסנט מן האור ככל האפשר.
3. לשטוף את התאים חסיד עם 2 מ ל PBS פעם אחת. הוסף 1 ml פנול בינוני התרבות האדום ללא 35 מילימטר צלחת פטרי. עבור שקופית בעלת 8 היטב, השתמש באמצעי אחסון השווה ל-1/2 של הקיבולת הגבוהה ביותר (לדוגמה, הוסף 125 μL אם קיבולת היטב הכוללת היא 250 μL).
4. להוסיף 1 mLof את התמיסה 2x תיוג הכין בשלב 1.2 כדי 35 מ"מ צלחת פטרי. עבור שקופית בעלת 8 היטב, השתמש באמצעי אחסון השווה ל-1/2 של הקיבולת הגבוהה ביותר. מודיית את התאים 30 דקות ב 37 ° c תחת 5% CO₂.
   הערה: אין להפעיל את התאים עם פתרון תיוג SG עבור יותר מ 1 h, כי הדגירה עוד יגרום תיוג של דנ א גרעיני.
5. מטפי בזהירות את המדיום המכיל את צבעי פלורסנט ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
6. הוסף מדיום תרבות התא נטול פנול ושמור את התאים בחושך בחממה של CO₂ ב 37 ° צ' עד הדמיה.
7. תאים חיים תמונה על מיקרוסקופ SR-SIM מצויד יחידת דגירה (ראה להלן).

2. SR-SIM רכישת תמונה

1. להתקין אינקובטור העליון הבמה על הבמה המיקרוסקופ. הגדר את הטמפרטורה הרצויה ו-CO₂ ריכוז (g., 37 ° צ' ו 5% עבור תאים מיונקים) ולהתחמם לפחות 1 h לפני תחילת רכישת התמונה.
2. הפעל את כל הרכיבים של מיקרוסקופ SR-SIM, כולל לייזרים, ולהשאיר אותם להתחמם לפחות 1 h.
3. בחר הגדלה גבוהה, הצמצם מספריים גבוה (NA) מטרה טבילה (למשל, 100x 1.46 NA שמן) מומלץ עבור SR-SIM על ידי יצרן המיקרוסקופ.
4. התקן שקופית הצ או צלחת 35 מ"מ עם תאים המסומנים (משלב 1.6) על הבמה מיקרוסקופ מודחת.
5. אתר את אזור העניין על המדגם, רצוי עם oculars. כדי להשיג את איכות הדימות SR-SIM הטובה ביותר, בחר את התאים המחוברים היטב לזכוכית.
6. השתמש האחורי מבוססי אלקטרון high-end הכפלת חיוב מצמידים המכשיר (EM-CCD) מצלמה כדי לרכוש SR-SIM תמונות.
7. באמצעות תוכנה לרכישת תמונות, להגדיר הגבוה EM גבוהה מומלץ עבור המצלמה בשימוש (למשל, 300).
8. לפני שרכשו את סדרת הזמן למעקב אחר נוקלאואיד, רכשו תמונה של שני צבעים של SR-SIM מאותו שדה תצוגה: ערוץ אחד לצביעת מיטוכונדריאלי ועוד אחד עבור SG. להגדיר את ערוץ הצבע הראשון המתאים לכתם מיטוכונדריאלי המשמש (למשל, עבור כתם מיטוכונדריאלי אדום רחוק, להגדיר את העירור על 633 ננומטר או יותר ו 650 nm לארוך פליטה מסנן). עבור האות SG, להגדיר את עירור ב 488 ננומטר ו 500-550 ננומטר מסנן פליטת מעבר.
9. באמצעות התוכנה, להגדיר את כוח הלייזר הנמוך ביותר האפשרי עבור שני 488 ננומטר וקווי כתם אדום הרחוק.
   הערה: הגדרה אופיינית היא 1% פלט לייזר כוח המותאם על-ידי מסנן tunable-אופטי acousto (AOTF).
10. אם מיקרוסקופ ה-SIM רוכש ערוצים ברצף בלבד (הגדרת מצלמה אחת), ולאחר מכן לכבות את ערוץ זיהוי הכתמים האדום הרחוק.
11. הגדר את הרכישה של מישור מוקד בודד על-ידי החלפת הרכישה של מחסנית Z על-ידי הסרת התיבה מחסנית z בתוכנה.
12. הגדר את הזמן הקצר ביותר האפשרי מצלמה EM-CCD.
13. קבע שלושה סיבובים של הרשת במקום חמישה סיבובים.
14. כדי להגדיל את קצב המסגרות, בכרטיסיה רכישה של התוכנה, הגדר את המצלמה כך שתקרא את הנתונים רק מהאזור המרכזי של חיישן המצלמה במקום "שבב מלא".
    הערה: לדוגמה, מעבר מקריאת שטח של 1,000 x 1,000 פיקסלים מלאים לקריאה רק 256 x 256 פיקסלים מאפשר ירידה בזמן חשיפה למצלמה מ 50 ms כדי 13.4 ms ואת זמן המסגרת הכולל מ 1.8 s עד 1.2 s. אם רק חלק מרכזי של חיישן המצלמה נקרא, אז שדה התצוגה יהיה קטן מאוד עבור יעד 63 x או 100x המשמש בדרך כלל עבור SR-SIM. זמן חשיפה קצר יותר יקטין את היחס בין האות לרעש של התמונות.
15. מיטוב כוח לייזר וחשיפה למצלמה זמן: לרכוש SR-SIM דו מימדי (2D) תמונות של תאים בעלי תוויות במספר ערכי כוח לייזר (g., 0.5%, 1%, 1.5%, 2%) כמה פעמים חשיפה (למשל, 13.4 ms, 25 ms, 50 ms).
16. עבד את ערכות הנתונים הגולמיים של ה-SIM (ראה שלב 3.1).
17. בחר כוח לייזר וחשיפה מצלמה פעמים התשואות תמונות ה-SIM עם נקודות בהירות המיטוסים (כלומר, נוקלאונואידים) עם פריטים קטנים או לא שנוצרו על ידי עיבוד ה-SIM. בדוק את האזורים מחוץ המיטו, (למשל, 1% כוח של 488 ננומטר לייזר המדינה מוצק 25 ms חשיפה של מצלמת EM-CCD).
18. התחל רכישה של סדרת הזמן לשגות באמצעות הגדרות אופטימיזציה בשלבים 2.15 – 2.17.

3. עיבוד וניתוח נתונים

1. תהליך הנתונים הגולמיים של ה-SIM מגדיר את מודול התאורה המובנית של תוכנה מתאימה (טבלת חומרים): בחר את תיבת הסימון אוטומטי עבור פרמטרי עיבוד ה-SIM. לעיבוד אוטומטי של קבצים מרובים, להשתמש בכלי עיבוד אצווה, לבטל את השימוש הנוכחי עבור אצווה, לחץ על הפעל אצווה ובחר קבצים מרובים עבור עיבוד ה-SIM.
2. המרת ה-SIM מעובד סדרות זמן מערכות נתונים לפורמט ims עם ממיר קובץ imaris תוכנה (כלומר, הגירסה המתאימה לגירסה של Imaris אריס תוכנה).
3. פתח קובץ שהומר בתוכנה (גירסה 8.4.1 או מאוחרת יותר) הכולל רשיון עבור המודול ' שושלת יוחסין ' (או ' מעקב ').
4. הפעל את אשף היצירה "כתמים" על-ידי לחיצה על הוסף סמל כתמים חדשים . האשף ליצירה יופעל.
5. בחר בכרטיסיה ' יצירה ' של האשף.
6. בשלב הראשון של האשף, לחץ על מעקב אחר נקודות (לאורך זמן) והמשך לשלב השני של האשף.
7. הגדר את קוטר XY המשוער ל-0.1-0.15 μm, לחץ על ' חיסור רקע ' והמשך לשלב השלישי.
8. כוונן את הסף במסנן "איכות" על-ידי גרירת הקו האנכי בהיסטוגרמה, כך שרוב הנוקלאואידים מזוהים כ"נקודות", בעוד הממצאים אינם מזוהים (כלומר, הנקודות שזוהו מסומנות ככדורים המצופים בתמונה). בדוק אם זה המקרה בכל מסגרת ולאחר מכן להתאים את הסף במידת הצורך. המשך לרביעי ולאחר מכן לשלב החמישי של הקוסם.
9. בחר באלגוריתם שינוי אוטומטי של התנועה . הגדר מרחק מקסימום עד 0.5 μm. הגדר את גודל הרווח המירבי כ-0.
10. הסתכל על כל אחת מהמסגרות בסדרת הזמן ובדוק אם רצועות שווא מצוירות ואם מרווחים כלשהם בין רצועות מוצגים (הרצועות שנבנו על-ידי האשף עם ההגדרות הנוכחיות מסומנות באופן מיידי כקווים המצופים בתמונה). . כוונן את "מרחק מקסימום" אם יש צורך המשך לשלב השישי של האשף. בחרו במסנן ' מעקב אחר משך ' וקבעו סף של 3 – 5 s.
11. אם הנקודות או הרצועות שזוהו כרגע אינן אופטימליות, חזור לשלבים הקודמים של האשף באמצעות לחצני ניווט (בחלק התחתון של חלון האשף) הדרושים לכוונון כלשהו של כל פרמטר לנקודות או ליצירת רצועות.
12. כאשר הפרמטרים מכוונים בסדר לאפשר את התוכנה כדי לזהות את כל הנקודות ולבנות מסלולים כראוי, לחץ על כפתור הניווט החץ הירוק באשף כדי לאשר את היצירה של הרצועות.
13. חלץ את הנתונים הסטטיסטיים של הרצועות על-ידי לחיצה על חלון סמל הסטטיסטיקה . בחר את פרמטרי הסטטיסטיקה הדרושים (כרטיסיות ערכיםמפורטים וממוצעים תחת סטטיסטיקה) ויצא את הערכים כקבצי csv על-ידי לחיצה על סמל כונן התקליטונים עבור כימות ופריטים חזותיים.
    הערה: מהירות המסלול המירבית, המשמעות של מהירות המעקב, אורך המעקב והתזוזה של הרצועה הן דוגמאות לפרמטרים החשובים.
14. אם יש להציג או לפרסם את ערכת הנתונים של התמונה, צור תמונות ו/או קבצי וידאו המייצגים את סידרת הזמן עם שירים המצופים באופן אופציונלי באמצעות התמונה או כלי ההנפשה .

4. רכישת תמונה מוקד

1. התקן חממה שלב העליון על הבמה המיקרוסקופ, להגדיר את הטמפרטורה הרצויה CO₂ ריכוז (כלומר, 37 ° צ' ו 5% עבור תאים מיונקים) ולשמור חם לפחות 1 h לפני תחילת רכישת תמונה.
2. להפעיל את כל הרכיבים של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד סריקה, כולל לייזרים, ולהשאיר אותם להתחמם לפחות 1 h.
3. בחרו את האמצעי הרצוי לדגימת ההגדלה והדגימה המרחבית לפי קריטריוני נייקוויסט.
4. עבור ערוץ SG, להגדיר את עירור על 488 nm וטווח זיהוי של 500 – 550 ננומטר. עבור ערוץ כתמים מיטוכונדריאלי, מוגדר ל 561 ננומטר ו-570 – 630 לפליטת nm עבור צבע אדום, או 633 הריגוש ננומטר ו > 650 ננומטר לצבע אדום רחוק.
5. הגדר את כוח הלייזר הנמוך ביותר האפשרי (בדרך כלל 1% או פחות) המאפשר רכישה של האותות עם רווחי גלאי PMT של 700 mV.
6. לרכוש שני צבעים מיקוד תמונות של התאים, שבו הנוקלאונואידים מיטוכונדריאידים מזוהים "ערוץ SG" ו המיטו, מזוהים בערוץ "אדום" או "אדום רחוק".

Results

אפיון של תיוג תאים חיים עם SG
ראשית, התפלגות ה-SG בתאים על הדגירה עם הצבע בדיעות שונות התאפיין במיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר הדגירה עם ריכוזים גבוהים של SG או picoGreen, שתי הצבעים בעיקר התווית את הגרעינים והראו כתמים מדומה בציטופלסמה (איור 1), בדומה לנתונים שפורסמו עבור אחר טעונה חיובי cyanine צבען (כלומר, picoGreen)¹⁵. עם זאת, עם הדגירה עם SG ב 1:10000 דילול, הכתמים קלוש הופיע גרעינים, ואילו בציטופלסמה, הבחנו דפוס ...

Discussion

ישנם מספר רכיבים קריטיים לפרוטוקול: כדי להשיג תיוג מועדף של דנ א מיטוכונדריאלי, הריכוז של הצבע איגוד ה-DNA במהלך הדגירה צריך להישמר נמוך מאוד (למשל, 1:10000 דילול של מלאי מסחרי אופייני), ואת זמן הדגירה צריך להיות 30 דקות. זמן הדגירה צריך לעולם לא יעלה על 1 h. SYBR זהב צבע יש להשתמש; אחרים DNA-כריכת צבעים אינם בהירים מספיק כדי ליצור אות חזק על תיוג בריכוז נמוך.

הגבלת הפרוטוקול שלנו היא שהצבען נשטף מן הנוקלאונואידים הדריאידים במהלך שלב החדירות. לכן, ההליך המתואר אינו מתאים לפרוטוקולים immunofluo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elyra PS1	Carl Zeiss		מיקרוסקופ רב-מודאלי ברזולוציה גבוהה המכיל מודול למיקרוסקופ תאורה מובנית ברזולוציה גבוהה (SR-SIM)
גלוקוז גבוה DMEM	GIBCO/ThermoFisher	31966021
צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית	Ibidi Gmbh	81158
ibidi 8-well microSlide, תחתית זכוכית	Ibidi Gmbh	80827
Imaris 8.4.1	Bitplane/Oxford Instruments		חבילת תוכנה לניקוב והדמיה של תמונות
iXon 885	Andor Technologies		מצלמת EMCCD עם חיישן עם תאורה אחורית
LSM880 Airyscan	Carl Zeiss		סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי עם גלאי מערך
Mitotracker CMXRos Red	ThermoFischer	M7512	מיטוכונדריה של תאים חיים אדומים כתם
Mitotracker אדום עמוק FM	ThermoFischer	M22426	אדום רחוק תא חי כתם מיטוכונדריאלי
picoGreen	ThermoFischer	P7581	תא כתם DNA פרמונד
תוכנית Apochromat 100x/1.46 מטרת שמן	קארל זייס
SYBR זהב	ThermoFischer	S11494	תא פרמונד, כתם DNA
שחור 2012 תוכנה	קארל זייס		תוכנה לרכישת ועיבוד תמונות