Method Article

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

DOI:

10.3791/60029

⸱

August 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון חלבונים דינאמיות שולטות בהתנהגות התאית, מתנועתיות ועד לשכפול דנ א לסימני התמרה. עם זאת, מעקב אחר אינטראקציות דינמיות בין מספר חלבונים ברשת אינטראקציה חלבון היא קשה מבחינה טכנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור כמותיים מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI), המאפשר הערכה כמותית של שינויי מקפלים באינטראקציות חלבונים המבוססות על מדידות זריחה יחסית של חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי חשופים אפיסקופים מפני השטח (דגים). ב QMI, מכלולי חלבון מ-lysates תא הם immunoprecipitated על מיקרוספירות, ולאחר מכן נחקר עם נוגדן בתווית עבור חלבון שונה כדי לכמת את השפע של דגים. נוגדנים Immunoprecipitation מובחנות אזורים ספקטרליים שונים, אשר מאפשר cytometer זרם להבדיל immunoprecipitations מקבילים מרובים ובמקביל לכמת את כמות נוגדן בדיקה הקשורים לכל. QMI אינו דורש תיוג גנטי ניתן לבצע באמצעות ביומטריה מינימלית לעומת שיטות immunoprecipitation אחרות. QMI יכול להיות מותאם עבור כל קבוצה מוגדרת של שימוש בחלבונים, ולכן יש עד כה שימש לאפיון רשתות איתות בתאי T ו-הסינפסות העצבית גלוטמט. התוצאות הובילו ליצירת השערה חדשה עם יישומים פוטנציאליים אבחון וטיפולי. פרוטוקול זה כולל הוראות לבצע qmi, מן הבחירה הראשונית הפאנל הנוגדן דרך להפעיל בחני וניתוח נתונים. ההרכבה הראשונית של שיטת QMI כרוכה בסינון נוגדנים ליצירת פאנל, וקביעת מאגר פירוק מתאים. ההכנה הכימית הבאה כוללת מצמד מimmunoprecipitation נוגדנים לחרוזי מאגי, ונוגדנים ביולוגיים מבוססי ביוטילוטינג כך שהם יכולים להיות מסומנים על-ידי fluorophore streptavidin. כדי להפעיל את הבדיקה, ליפוסט מעורבב עם מאגחרוזים בן לילה, ולאחר מכן חרוזים מחולקים מודבטים עם נוגדנים בדיקה שונים, ולאחר מכן תווית fluorophore ולקרוא על-ידי cy, הזרמת לנסות. שני בדיקות סטטיסטיות מתבצעות כדי לזהות את הדגים שונים באופן משמעותי בין התנאים הניסיוניים, והתוצאות מתדמיינו באמצעות מפות חום או דיאגרמות קצה הצומת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבונים בחלבון חלבון מהוות מבני איתות מולקולריים ומבנים מורצפת המהווים את הבסיס התפקודי של רוב הפיזיולוגיה התאית1. תהליכים אלה מתוארים לעתים קרובות כמסלולים איתות ליניארי העוברים בין מצבים יציבים המבוססים על תשומות יחיד, אבל נתונים ניסיוניים ומידול מראים בבירור שהם מתפקדים כרשתות משולבות2,3, 4. במקרה של G חלבונים, קולטנים שונים לעתים קרובות יש את היכולת להפעיל את אותו חלבון G, ו קולטן יחיד יכול גם להפעיל יותר מסוג אחד של g חלבון5,6. על מנת מספר קטן יחסית של שיעורי חלבון G לווסת במי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עיצוב שיטת התכנון

  1. הכנת נוגדן המועמד
    1. עבור כל חלבון של עניין, לבחור 3 כדי 5 נוגדנים למסך. במידת האפשר, השתמשו בנוגדנים חד-שבטיים המכירים באפיסקופים שונים. כלול גם נוגדן אחד שאינו ספציפי לפקד.
    2. כדי להסיר טריס, לבצע חילופי מאגר על ידי הוספת נוגדן למסנן 30 kDa ספין, מסתחרר למטה לנפח המינימלי שלה, הוספת 500 μL של מלוחים באגירה פוספט (PBS), ו חוזר 3 פעמים. כדי להסיר את החלבונים הנושא, לבצע טיהור נוגדנים בהתאם לפרוטוקול של היצרן (ראה טבלת חומרים להמלצה מסוימת של טיהור).
      הערה: זה נעשה בגלל חלבונים הנושא ומאגרים עם קבוצות אמין חינם (כגון טריס) יגיב עם הקבוצות COOH ולהרוות את צימוד חרוז הבאים ותגובות biotinylation. ודא כי כל הנו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנת נוגדנים
איור 2 B מציג את תוצאות המסך עבור חלבון Connexin36. רוב השילובים IP_probe מייצרים לא אות מעל פקדי IgG. IP עם הנוגדן המונשבטיים 1E5 ולבדוק עם או 1E5 או נוגדנים פוליבטיים 6200 מייצרת משמרת ימניים בהתפלגות חרוז לעומת שולטת IgG. כאן, IP 1E5 ו לחקור 6200poly נבחרו כדי להימנע משימוש באותו נוגדן כמו IP ובדיקה, הן כדי להפחית את ההסתברות של חלבון שאינו ספציפי להיות מוכר על ידי שני נוגדנים עצמאיים, כדי להגדיל את הסיכוי לזהות שיתוף אסוציאציות באמצעות א.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השקאת QMI דורש השקעה ניכרת בפיתוח פאנל הנוגדן, ציוד ריאגנטים, אבל ברגע שהנתון נקבע, ניתן לאסוף נתונים בעלי ממדים גבוהים התבוננות ברשתות אינטראקציה חלבון כפי שהם מגיבים ניסויים בשליטת גירויים. מבחינה טכנית, QMI דורש ליטוף זהיר ומעקב של דגימת ומיקומים היטב נוגדן. תיוג בזהירות של לוחיות הנתונים הוא שימושי, כפי שהופך תבנית מפורטת של מיקומים היטב על נייר, אשר נשמר לאחר מכן עבור ניתוח נתונים. החשיבות של שמירה על חרוזים וליפוסט קר כל הזמן, כולל בזרם cytometer מיקרופלייט המנשא (ראה איור S1 עבור הוראות קירור מותא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להכיר את טסה דיוויס לתרומות חשובות לפיתוח שיטת QMI, וחברים נוכחיים ולשעבר של מעבדות סמית ' ו-Schrum להדרכה טכנית ולקלט אינטלקטואלי. עבודה זו ממומנת על ידי NIMH מענקים R01 MH113545 ו R00 MH 102244.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחות עם תחתית שטוחה 96 בארותBio Rad171025001
96 בארות PCRVWR82006-704
Bioplex 200 עם HTFBio Rad171000205מותאמת לשמירה בקירור חלקי, ראה איור S1 לפרטים
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
חרוזי CMLInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx הוא אזור חרוז 3 ספרות
מלון ג'ל IgG ספין טיהור ערכת ThermoScientific45206המשמש לטיהור נוגדנים
MESSigmaM3671
סרט מיקרופלייט, לא סטריליארה"ב Scientific2920-0000
קוקטייל מעכב פוספוטאז #2סיגמאP5726
קוקטייל מעכב פרוטאזסיגמאP8340
מקרר הכנת כריכיםNorlakeSMP 36 15לקירור מותאם אישית של Bioplex 200
נתרן פלואורידסיגמא201154
נתרן אורתוונדאטסיגמא450243
סטרפטווידין-PEBioLegend405204
סולפו NHSThermo ScientificA39269
טריספישר סיינטיפיקBP152
מערכת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Co ImmunoprecipitationProtein Interaction NetworkQuantitative Multiplex ImmunoprecipitationFlow Cytometry AnalysisMagnetic Bead ImmunoprecipitationProtein Co AssociationsSignal Transduction SystemsAntibody Panel SelectionStreptavidin PE LabelingCytoscape Network Visualization

Related Articles