הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

6.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60031

⸱

19 באוקטובר 2019

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור לימוד neurite מוצלח בנוירונים הקליפת המוח העובריים על ידי שיתוף הפעולה עם egfp ואת חלבון הריבית.

תקציר

Neurite מוצלח הוא אירוע בסיסי בהקמת מעגלים עצביים במהלך פיתוח מערכת העצבים. נזק neurite חמור ותפקוד סינפטית להתרחש במחלות ניווניות שונות ניוון הקשורות לגיל. חקירת מנגנוני הווסת neurite מוצלח לא רק לשפוך אור יקר על תהליכים התפתחותיים במוח אלא גם על הפרעות נוירולוגיות כאלה. בשל יעילות ההתפתחות הנמוכה, הוא כרגע מאתגר ללמוד את ההשפעה של חלבון מסוים על neurite מוצלח בנוירונים היונקים העיקריים. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לחקירה של neurite מוצלח ידי שיתוף ההתפתחות של נוירונים בקליפת המוח הראשי עם egfp וחלבון של עניין (פוי). שיטה זו מאפשרת זיהוי של הנוירונים מנוכר פוי באמצעות אות egfp, ובכך את ההשפעה של פוי על neurite מוצלח ניתן לקבוע בדיוק. זה מבוסס EGFP מספק גישה נוחה לחקירה של מסלולים ויסות neurite outgrowth.

מבוא

Neurites, כולל אקסונים ו דנדריטים, הם התחזיות מפני נוירונים המעורבים בהקמת רשתות עצביות. הצמיחה הדינמית של neurites היא חיונית עבור פיתוח נוירולוגי. עם זאת, מנגנוני הרגולציה הבסיסיים שמתחת נותרים ברורים. בפרט, נזק neurite הוא נצפה לעתים קרובות במחלות ניווניות שונים ואחרי פציעות המוח1. לכן, חקירת התפקידים של מולקולות neurite מוצלח מסלולים שונים הרגולציה ישפר את הבנתנו את התהליך. יתר על כן, זה עשוי לחשוף מטרות טיפוליות הרומן עבור הפרעות נוירולוגיות שונות. קווי התאים העצביים הם מודלים יקרי ערך עבור לימוד תהליכים עצביים כולל neurite מוצלח כפי שהם קל לתמרן ו transfect2,3. עם זאת, הסחף גנטי דווח להתרחש כמה קווי התאים הנפוצים, אשר יכול להוביל וריאציות התגובות הפיסיולוגיים שלהם4. יתר על כן, ביטוי החלבון הדיפרנציאלי הוכח בין קווי התאים העצביים והנוירונים הראשוניים. למשל, PC12, קו של תא עצבי שנגזר בלוטת יותרת הכליה חולדה המשמשת רבות ללימוד neurite מוצלח2,3, אינו מבטא קולטנים NMDA5. יתר על כן, זה כבר הציע כי התגובה מופחתת של העכבר שורה נוירובלסטומה בקווים עצביים-2a כדי נוירוטוקסינים בהשוואה לנוירונים הראשי הוא בשל חוסר ביטוי של קולטני קרום מסוימים וערוצי יון6. לכן, הנוירונים העיקריים הם מודל רצוי יותר ומייצג לחקירה של neurite outgrowth. עם זאת, השימוש בנוירונים הראשי מפריע היעילות שלהם הזיהום הנמוך7.

כאן, אנו מתארים שיטה המערבת שיתוף הזיהום של חלבון הריבית (פוי) ו-EGFP לנוירונים הראשי הקליפת העור הפנים. ה-EGFP משמש כסמן מורפולוגי לזיהוי נוירונים שעברו בהצלחה ומאפשר את המדידה של neurites. אנו אימות שיטה זו באמצעות תרכובות/מולקולות שדווחו לווסת neurite outgrowth. יתר על כן, FE65, חלבון מתאם עצבי כי הוכח לעורר neurite outgrowth, שימש כדי להמחיש את הגישה הזאת8,9. פרוטוקול זה כולל (1) בידוד של נוירונים בקליפת העור העיקרי מן היום העובריים 18 (E18) עוברי חולדה, (2) את שיתוף הפעולה של נוירונים עם EGFP ואת פוי (FE65 במחקר זה) ו (3) הדמיה וניתוח של הנוירונים באמצעות עיבוד תמונה ImageJ של תוכנה עם תוסף עצבי10,11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים שלאחר מכן היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת האתיקה של הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הסינית בהונג קונג.

1. הכנת שוברי כיסוי

  1. מניחים כיסוי סטרילי מעגלי 18 מ"מ לתוך כל טוב של לוחית 12-היטב הרקמה רקמות.
  2. לחלוק את הסרבל עם 5 μg/mL פולי-D-ליזין פתרון מחולל 37 מעלות צלזיוס בחממה עבור 1 h לפחות.
  3. מנושף את התמיסה פולי-ליזין מצלחת תרבות הרקמה ולשטוף את הכיסויים מצופה פעם אחת עם מים סטריליים.

2. החולדה מתחלקים לנתיחה

  1. להקריב עכברוש מתוזמן בהריון ספראג-דאולי בגיל ההיריון של 18 ימים (E18) על ידי פריקה צוואר הרחם או שיתוף2 חנק.
    הערה: אנא בדוק את התקנות המקומיות. להקרבה של עכברושים בהריון
  2. פתח את חלל הבטן של עכברוש בהריון עם מספריים לבתר ולהעביר את הרחם על 10 ס מ צלחת פטרי.
  3. פתח את הרחם ואת שק השפיר בזהירות עם המספריים מבתר קטן ולהסיר את השליה מן העובר חולדה באמצעות מספריים מבתר קטן. להעביר את העובר כולו 10 ס מ צלחת פטרי עם מלוחים טרום מקורר פוספט באגירה בתוספת גלוקוז (PBS-גלוקוז, 10 מ"מ מלחי נתרן, 2.68 מ"מ אשלגן כלוריד, 140 mM נתרן כלוריד ו 3 g/L גלוקוז) באמצעות זוג מלקחיים קטנים.
  4. חותכים לאורך התפר המשונן של הגולגולת ופותחים אותו בזהירות עם זוג מספריים קטנים. העבר את המוח העובריים עם מרית קטנה ושטוחה לצלחת פטרי בגודל 10 ס מ עם הקרח הקר-גלוקוז.
  5. הפרידו בין שתי האונות המוחית לגזע המוח השני ובאמצעות שתי #5 פינצטה תחת מיקרוסקופ לחיתוך.
    הערה: בבקשה ראו התייחסות12 . למבנה של מוח החולדה
  6. הסר את הקרום הקרומי באמצעות ה#5 פינצטה.
  7. לבודד את קליפת המוח מהמיאונות המוחית עם שני מלקחיים #5 ישרים.
  8. העבירו את קליפת המוח הבודדת. ל-"PBS-גלוקוז" בתוך 15 מ ל

3. תרבית תא בקליפת היסוד

הערה: כל ההליכים בשלבים 3 ו-4 מבוצעים בתוך ארון מחלקה II Biosafety טיחות.

  1. ליישב את קליפת המוח הבודדת על ידי כוח הכבידה ב 4 ° c עבור 5 דקות ולאחר מכן לבשל את ה-PBS-גלוקוז.
  2. הוסיפו 1 מ ל של 0.05% טריפסין-EDTA לקליפת הקליפה הבודדת וערבבו בעדינות על ידי הקשה על הרקמה באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 10 דקות כדי לאפשר את העיכול האנזימטי. הקש על צינור בעדינות כדי ערבוב כל 2 דקות.
  3. הוסף 4 מ ל של מדיום תחזוקה (למשל, מדיום Neurobasal סיס) לרקמה/טריפסין תערובת.
    הערה: כל המדיום תחזוקה בשימוש בפרוטוקול זה הוא שיושלם עם פניצילין-סטרפטומיצין ו B-27 תוספת13.
  4. הנתק את הרקמה בעדינות על-ידי הטריטורציה באמצעות פיפטה של 1 מ ל.
  5. גלולה את התאים הנתק על ידי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות. ומתה את הסופרנטאנט.
  6. חזור על שלבים 3.5 עד 3.7 פעמיים.
  7. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של אמצעי תחזוקה.
  8. הוסף 10 μL של 0.4% הפתרון הכחול טרימין כחול 10 μL של הבולם הסלולרי עבור ספירת תאים קיימא על-ידי הומוציטומטר.
  9. צלחת הנוירונים בצפיפות של 65000/cm2 (תאים קיימא) ב 1 מ ל של תחזוקה בינונית לכל טוב בצלחת 12-באר.

4. העברה וקיבוע תאים

  1. ב 2 ימים ב מבחנה (DIV2), transfect 0.5 μg של בניית EGFP (pEGFP-C1) לנוירונים יחד עם או בלי 0.5 μg של פוי באמצעות 1 μL של העברה מגיב (g., Lipofectamine 2000). השתמש בהוראות היצרן.
    הערה: ביטויים ממיונקים הוכנו על ידי שימוש בערכת ההכנה של הפלטוקסין בחינם. טיפול עם כימיקלים/מולקולות (בכתב יד ציטוסין D (Cyto D) ואת הצמיחה העצבים גורם (NGF) שימשו) ניתן לעשות ב 6 h לאחר מעבר החצייה.
  2. מנושף את מבנה התרבות 24 שעות לאחר ההעברה ושוטף את התאים המוגברים פעם אחת עם 37 ° c PBS (10 מ"מ מלחי נתרן, 2.68 מ"מ אשלגן כלוריד, 140 מ"מ נתרן כלוריד).
  3. תקן את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
  4. שטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים עם ה-PBS.
  5. הוסף כמות מינימלית של מדיום הרכבה פלואורסצנטית בשקופית זכוכית מיקרוסקופ. העבר בזהירות את הכיסויים של הצלחת 12-הבאר אל מדיום ההרכבה עם המדגם הפונה לשקופית זכוכית.
    הערה: לאטום את הקצה של שמיכות עם לק ציפורניים אם מדיום הרכבה מימית משמש.

5. מדידה של Neurite Outgrowth

  1. השתמש במטרה 40x עבור לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ אפינפרין-פלורסנט.
  2. לכידת תמונות מ לפחות 40 נוירונים שלמים עם אות EGFP לאחר הזיהום.
  3. פתח את התמונה שנלכדה בתוכנת ImageJ עם התוסף העצבי11 כדי למדוד את אורך הneurite הארוך ביותר, מגוף התא לקצה של קונוס הצמיחה, של כל תא עצב התמונה.
  4. לנתח את הנתונים שהושגו עם התוכנה כדי לקבוע את ההשפעה של חלבונים ייעודיים ב neurite outgrowth.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לבדוק מתודולוגיה זו, השתמשנו cyto D ואת גורם הגדילה העצבי ngf, אשר הוכחו לעכב ולעורר neurite מוצלח בהתאמה14,15,16. אורך neurite של נוירונים מנוכר עם EGFP נמדדו לאחר הטיפול עם Cyto D או NGF. היעילות של התרגום של EGFP לנוירונים הייתה 2.7% (1,068 נוירונים שנספרו). כפי שמוצג באיור 1, Cyto D דיכאneurite הארכהבצורה תלוית מינון. לעומת זאת, neurite מוצלח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כפי שצוין לפני, PC12 ושיבוטים שלה הם מועסקים נרחב ללמוד הארכה neurite כי יש להם יעילותמעולהמעבר 2,3. לעומת זאת, נוירונים ראשוניים יש שיעור מעבר נמוך, שהוא מכשול גדול ללמוד neurite מוצלח הרגולטורים על ידי התפתחות7. כאן, אנו מתארים פרוטוקול נוח לכמת neurite מוצלח בנוירונים הראשי. למרות היעילות הכללית הכוללת, יותר מ 80% מהנוירונים המזוהמים היו בהצלחה בשיתוף עם שני החלבונים: FE65 ו-EGFP (איור 2א)....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניין בתוכן של מאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי כספים מן המועצה מענקים מחקר הונג קונג, בריאות ומחקר רפואי הקרן (הונג קונג), CUHK מענק הערכה, קרן הנאמנות של המכללה המאוחדת ו TUYF נאמנות צדקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#5 פינצטהRegine5-COB
18 מ"מ כיסוי עיגול מחליקתרמו סיינטיפיקCB00180RAלעקר לפני השימוש
תוסף B27Gibco17504044
Cytochalasin DInvitrogenPHZ1063מומס ב-DMSO
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
דימתיל סולפוקסידSigma-AldrichD2650
מספריים לניתוח, 10 ס"ממכשירי דיוק עולמיים14393
מספריים לניתוח, 12.5 ס"ממכשירי דיוק עולמיים15922
ערכת מקסי פלסמידEndoFree QIAGEN12362
הרכבה פלואורסצנטית בינוניתDakoS302380
Lipofectamine 2000 Transfection ריאגנטInvitrogen11668019
נוירובזאלי בינוניGibco21103049
NGF 2.5S חלבון עכבר מקוריGibco13257019
Nugent Utility מלקחיים, 10 מ"מ, Straight TipWorld Precision Instruments504489
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
pEGFP-C1Clontech#6084-1
pCI FE65אנא ראה הפניות 8 ו-15
טבליות PBSGibco18912014
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7280
מריתSigma-AldrichS4147
Trypsin-EDTA (0.05%), פנול תמיסת גיבקו25300062
כחולה אדומה, 0.4%ג'יבקו15250061
טריפאן

מקורות

  1. Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
  2. Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
  3. Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
  4. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  5. Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  8. Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
  9. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  12. Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
  13. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
  14. Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
  15. Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
  16. Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
  17. Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
  18. Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
  19. Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18(2010).
  20. Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
  21. He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).
  22. Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
  23. Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
  24. Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
  25. Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
  26. Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
  27. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  28. Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
  29. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899(2013).
  30. Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).
  31. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  32. Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

EGFPImageJFE65
משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.