מאמר שיטה

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

DOI:

10.3791/60032

⸱

18 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center, Duksung Women's University, 2Korea Drug Development Platform using Radio-isotope, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג'ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים בתחום האנגיוגנזה גדלו באגרסיביות בעשורים האחרונים עם ההכרה שאנגיוגנזה הוא סימן ההיכר של יותר מ-50 מצבים פתולוגיים שונים, כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלות לב וכלי דם. , גרורות גידול. במהלך פיתוח התרופה לאנגיוגנזה, חיוני להשתמש במערכות של שיטות חוץ-גופית עם סוגי תאים מתאימים ותנאים נאותים כדי לשקף את תהליך האנגיוגנזה הפיזיולוגי. כדי להתגבר על המגבלות הנוכחיות של המערכות הקיימות במערכת השימוש בתאי האנגיוגנזה בעיקר, פיתחנו תלת מימדי (3D) שיתוף תרבות מערכת שיטת העיבוד. שיתוף תרבות הספרואידים הופקו על ידי שני תאים אנושיים בתאי כלי דם, המושבה אנדותל היוצרים תאים (ECFCs) ו-mesenchymal תאים גזע (MSCs) עם יחס של 5 אל 1. ECFCs + MSCs spheroids הוטבעו לסוג אני קולגן מטריצה כדי לחקות את הסביבה vivo מסחטות. מקליט תאים בזמן אמת היה מנוצל ברציפות להתבונן התקדמות של לבלוב אנגיוגנטית מן spheroids עבור 24 h. שיטת התיוג הפלואורסצנטי של תא חי החלה גם על בדרכי ההתאמה של כל סוג תא במהלך היווצרות נבט. פוטנציאל אנגיוגנטי היה כולל על ידי ספירת מספר נבטים ומדידת האורך המצטבר של נבטים שנוצרו מההרואידים הבודדים. חמש השפעות אקראיות שנבחרו. נותחו לכל קבוצה ניסיונית ניסויי השוואה הראו כי ECFCs + MSCs spheroids הראו מספר נבט גדול יותר ואורך נבט מצטבר בהשוואה ל ECFCs בלבד spheroids. Bevacizumab, שאושרו על-ידי ה-FDA מעכב אנגיוגנזה, נבדק עם מערכת החדשה שפותחה שיתוף תרבות ספרואיד במערכת כדי לאמת את הפוטנציאל שלה למסך תרופות אנטי-אנגיוגנטית. ערך IC50 עבור ecfcs + MSCs spheroids לעומת ecfcs בלבד הספרואידים היה קרוב יותר לריכוז פלזמה יעיל של אווסטין המתקבל ממודל העכבר הגידול של מבע. המחקר הנוכחי מצביע על כך 3D ECFCs + MSCs ספרואיד מערכת שיטת אנגיוגנזה רלוונטית לאנגיוגנזה פיזיולוגי, והוא יכול לחזות ריכוז פלזמה יעיל מראש של ניסויים בבעלי חיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כ 500,000,000 אנשים ברחבי העולם צפויים להפיק תועלת של אנגיוגנזה-מודלטינג טיפול עבור מחלות כלי דם משויכים כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלות לב וכלי דם, גרורות גידול1. לפיכך, התפתחות התרופות השולטות באנגיוגנזה הפכה לאזור מחקר חשוב בתעשיית הפרמצבטיקה. במהלך התפתחות התרופה, בחקר החיות הvivo יש צורך לבחון את ההשפעות של מועמדים לסמים בפונקציות פיזיולוגיות ואינטראקציות מערכתיות בין איברים. עם זאת, בעיות אתיות ועלויות הגדילו את החששות לגבי ניסויים בבעלי חיים2. לכן, יש צורך לשפר את מערכות המערכת החוץ-גופית כדי לקבל מידע מדויק וצפוי יותר שיוביל לקבלת החלטות טובה יותר לפני ניסויים בבעלי חיים. הזרם הנוכחי באנגיוגנזה, בדרך כלל למדוד התפשטות, פלישה, הגירה, או היווצרות המבנה הצינורי של תאי האנדותל (ECs) הנזרע דו מימדי (2D) לוחות התרבות3. האנגיוגנזה הדו מספר אלה הם מהירים, פשוטים, כמותיים וחסכוניים, ותרמו באופן משמעותי לגילוי הסמים המואפטים באנגיוגנזה. עם זאת, נותרו מספר נושאים שופרו.

2D כגון מערכות שיטת החוץ הגופית לא יכול לשקף אירועים מורכבים בשלב רב של אנגיוגנזה המתרחשת ב vivo התנאים הפיזיולוגיים, המוביל תוצאות לא מדויקות הגורמות לסתירות בין נתוני שיטת חוץ גופית ותוצאות ניסוי קליני4. התנאים תרבות 2D גם לגרום לשינוי של פנוטיפים סלולריים. לדוגמה, לאחר התפשטות בלוחות התרבות דו-ממדית, ecs יש פנוטיפ הסלולר חלש המתבטא על ידי ביטוי מופחת של CD34 ומספר אותות השולטים התגובות הסלולר5,6. כדי להתגבר על מגבלות מערכות שיטות האנגיוגנזה המבוססות על תרבות דו-ממדית, פותחו מערכות שיטת אנגיוגנזה תלת-ממדית (3D). לבלוב ואחריו היווצרות מבנה צינורי מתוך spheroids שנוצר על ידי ecs משקפים vivo ניאו-ואסיקולריזציה תהליכים7,8. לפיכך, שיטת האנגיוגנזה התלת-ממדית נחשבה למערכת שיטה יעילה לסינון תרופות פרו-אנאנציקליות פוטנציאליות.

רוב 3d האנגיוגנזה ספרואיד בחני לנצל רק ecs, בעיקר האדם וריד הטבור בתאי הטבורי (huvecs) או האדם מיקרוכלי הגוף האנושי מיקרו-סקולרית (hdmecs) כדי להתמקד בתגובה התאית של ecs במהלך האנגיוגנזה. עם זאת, נימים בדם מורכבים משני סוגי תאים: ECs ו כריתת קרום הלב. פירוט האינטראקציה הדו-כיוונית בין ECs לקרום הלב היא קריטית לשלמות כלי הדם הנכונים ולתפקוד. מספר מחלות, כגון שבץ תורשתי, רטינופתיה סוכרתית, ומומים ורידים, משויכים לצפיפות שונה בקרום הלב או לירידה המצורף לקרום הלב לאנדותל9. כלציטים מוכרות גם כמרכיב מרכזי בתהליך האנגיוגנטי. לייצב את מבני הספינה. שנוצרו מחדש ע י ECs בהקשר זה, שיטת האנגיוגנזה של מונו-תרבות, אינה משלבת כבלי קרום הלב7,10. לכן, הספרואידים של התרבות שנוצר על ידי ECs ו קרום הלב עשוי לספק גישה רבת ערך לחיקוי הדוק יותר של אירועים האנטי-אנגיוגנטיים הפיזיולוגיים.

המחקר הנוכחי שמטרתו לפתח שיתוף תרבות תלת-ממד בשילוב האנאיד אנגיוגנזה עם שילוב של מושבת האדם האנושי היוצרים תאים (ECFCs) ותאי גזע mesenchymal (MSCs) כדי לשקף יותר מקרוב vivo אנגיוגנזה. מערכת שיתוף תרבות ספרואיד כהרכבה בייצוג בלתי מתורבת של כלי דם רגיל הוקמה לראשונה על ידי Korff et al. ב 200111. הם שילבו HUVECs ואת עורק הטבור האנושי תאים השריר חלקה (HUSMCs), והפגינו כי שיתוף התרבות של שני תאים בוגרים כלי דם ירדו את הפוטנציאל לבלוב. Ecs בוגרת (huvecs) ידועים בהדרגה לאבד את יכולתם להתרבות ולהבדיל, אשר משפיע לרעה על תגובות האנגיוגנזה שלהם12,13. תאים בוגרים בעלי כלי דם (HUSMCs) יכולים לגרום להפעלת תא אנדותל באמצעות הארכה של מקדם הגידול של כלי הדם (באמצעות התגובה המתכלה)11. ההבדל העיקרי בין Korff לבין מערכת שיתוף התרבות שלנו ספרואיד הוא סוגי התא המשמשים. החלתי שני סמנים מוקדמים של כלי הדם, ECFCs ו MSCs, כדי ליצור מערכת שיטת אנגיוגנזה מתאימה למסך ולחקירת סוכנים פרו-או-אנטי-אנגיוגנטיים. ECFCs הם הקודמן של ECs. ל-ECFCs יש קיבולת הפצה איתנה לעומת ECs בוגרת14, המאפשרת להתגבר על המגבלה של ecs. Ecfcs תורמים להיווצרות כלי חדש בתנאים רביםשלאחר לידהלאחר לידה15,16,17. MSCs הם תאי גזע בעלי עוצמה גבוהה, שיש להם את היכולת להבדיל לתוך קרום הלב, ובכך לתרום לאנגיוגנזה18,19.

בדוחות הקודמים, ecfcs ו MSCs הראו השפעות סינגיסטיים על היווצרות צינור מבחנה20, ב vivo ניאו-vascularization21,22, ו reperfusion משופר של רקמות האיסכמי23,24. במחקר הנוכחי, ECFCs ו MSCs שימשו ליצירת spheroids שיתוף תרבות ומוטבע סוג אני קולגן ג'ל כדי לשקף בסביבה vivo 3D. קולגן נחשב מרכיבים עיקריים של מטריצה החילוץ (ECM) סביב Ecm25. ה-ECM ממלאת תפקיד קריטי בוויסות התנהגות התא26. פרוטוקול השימוש המוצע כאן יכול להתבצע בקלות ובמהירות בתוך יומיים באמצעות טכניקות מעבדה נפוצות. עבור מעקב תאים אפקטיבי במהלך לבלוב התהליך, כל סוג תא יכול להיות מתויג באופן מפוקח ומנוטרים באמצעות מקליט תא בזמן אמת. המערכת החדשה הוקמה 3D שיתוף התרבות מערכת שיטת אנגיוגנזה מיועדת להגביר את הרגישות להערכת מודולטורים פוטנציאליים מודולים ולספק מידע צפוי מראש במחקר vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האדם האנושי היה מבודד מדם היקפי אנושי כפי שמתואר בדו ח הקודם27. בקצרה, שכבת התאים המונחדנה הופרזה מדם כולו באמצעות הפידול-פנק פלוס, ומתורבתים במדיום הנכון עד להופעת המושבות האנדותל. המושבות נאספו ו-ECFCs היו מבודדים באמצעות חרוזים מגנטיים CD31 מצופים. MSCs היו מבודדים תא מונמונומנט ברור (MNC) חלק של מח עצם האדם מבוגר. פרוטוקול המחקר אושר על ידי לוח הסקירה המוסדי של אוניברסיטת Duksung נשים (IRB No. 2017-002-01).

1. תרבית תאים

  1. הכנת לוחות ECFCs וMSCs בינוניים ומעילים
    1. הכנת הצמיחה של תא אנדותל בינונית MV2 (ECGM-MV2, למעט הידרוקורטיזון) שיושלם עם 10% סרום שור עוברי (FBS) ו 1% גלוטמין-פניצילין-סטרפטומיצין (GPS).
    2. הכן את הצמיחה של תא גזע mesenchymal בינונית-2 (MSCGM-2) המכיל 10% FBS ו-1% GPS.
    3. עבור תרבות ECFC, לחלוק את הצלחות תרבות התא עם 1% הג פתרון. כדי להכין 1% ג'לטין פתרון, לפזר 1 גרם של אבקת גלציה ב 500 מ ל של PBS עם הטירר המגנטי, ולעקר עם החיטוי. צלחות יכול להיות מצופה עם 3 מ ל/60 מ"מ, 5 מ מ/100 מ"מ, או 15 מ מ/150 מ"מ של פתרון ג'לטין 1%. הצלחות מצופות מתכת עבור 15 דקות בחממה תרבות התא (37 ° צ' ו 5% CO2). לאחר מכן, להסיר את הפתרון הנותר 1% ג'לטין על ידי שאיפה ולשטוף את הצלחות מצופה פעם אחת עם PBS.
  2. הגדלת ECFCs ו-MSCs
    1. Seed 1 x 106 ecfcs על 1% מצופה ג'לטין 150 מ"מ לוחות, ולצמוח באמצעות ECGM-MV2 (10% fbs, 1% GPS) בחממה לתרבות התא (37 ° צ' ו 5% CO2) כדי 80-90% שליטה. השתמש ב-ECFCs במעבר מספרי 7-10 כדי לקבל תוצאות עקביות.
    2. Seed 1 x 106 MSCs על לוחות 150 mm שאינם מצופים, ולצמוח באמצעות MSCGM-2 בחממה תרבות התא (37 ° צ' ו 5% CO2) כדי 80-90% השטף. השתמש MSCs במעבר מספר 7-10 כדי לקבל תוצאות עקביות.

2. הכנת 1.2% w/v מתילתאית פתרון

  1. מידה 6 גרם של מתיל תאית בבקבוק זכוכית 500 mL ולעקר ב חיטוי.
  2. חום ECGM-MV2 (ללא FBS ו-GPS) ב 60 ° c עבור 20 דקות, ולהוסיף 250 mL של ECGM מחומם-MV2 כדי לעקר אבקת תאית מתיל. כדי לשמור על התנאים הסטריליים, בצע את התהליך בתוך מכסה הזרימה.
  3. הוספת בר מגנטי מעוקר מערבבים ולערבב את הפתרון עבור 20 דקות על השטירר המגנטי עד התאית מתיל הוא התפזרו באופן מעמיק ומפוזר באופן שווה עם גושים לא. הוסף 250 mL של קר (4 ° צ') ECGM-MV2 (ללא FBS ו-GPS) תחת המצב סטרילי ולערבב עבור 10 דקות נוספות על השטירר המגנטי. ואז, לצנן את הפתרון במקרר (4 ° c) בלילה.
    הערה: מתילתאית הוא פולימר פחמימות מתמוסס היטב בטמפרטורות מגניב עקב נפיחות ומחות הבאים.
  4. למחרת, סדרת מחלקים the הפתרון בצינור 50 mL ו צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 3 h ב 4 ° c. קחו את הפתרון הנקי והצמיגי והחנות ב -4 ° צ' עד ל3-6 חודשים.
    הערה: המשקע עשוי להכיל סיבים תאית שיורית, כך בעדינות לקחת את הפתרון supernatant להשאיר מאחור לפחות 5 מ ל של נפח. אמצעי אחסון זה ניתן להתאמה בהתאם לתנאים ניסיוניים.

3. הדור והטמעה של ECFCs-בלבד, MSCs בלבד, ו ECFCs-MSCs Spheroids

היום הראשון

  1. הכנת השעיית תא ECFCs וMSCs
    1. רוחצים את 80-90% confluent ECFCs ומMSCs על ידי הוספת תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיום, ולאחר מכן מואבקת.
    2. לנתק ECFCs ו MSCs מלוח התרבות, מודקת אותם עם 0.05% טריפסין-EDTA עבור 3 דקות ו 5 דקות בחממה לתרבות התא (37 ° c ו 5% CO2), בהתאמה, בחממה לתרבות התא.
    3. הפעלת טריפסין באמצעות הוספת מדיום DMEM דיה המכילה 10% FBS ו-1% GPS. פיפטה את התאים למעלה ולמטה כדי ליצור השעיית תא בודד.
    4. משקע את התאים על ידי תפרידו ב 282 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    5. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים במדיום המתאים.
  2. תיוג ECFCs וMSCs עם צבע פלורסנט
    הערה: לבצע תיוג קרום התא של ECFCs עם PKH67 (ירוק) ו MSCs עם PKH26 (אדום) צבע פלורסנט בעקבות הוראות היצרן עם שינויים מעט כדלקמן.
    1. לשטוף את התאים פעמיים עם סרום בינוני חינם כדי להסיר FBS.
      הערה: חלבונים וליפידים ב-FBS מפחית את ריכוז הצבע האפקטיבי לתאי התוויות באמצעות כריכה.
    2. הרוזן ECFCs ו MSCs באמצעות הומוציטוטומטר מתחת למיקרוסקופ, ולהעביר 3 x 106 ecfcs ו 2 x 106 MSCs לתוך 2 mL מיקרו צינורות.
      הערה: אלה הם צפיפויות התאים האופטימליות לצורך תיוג תאים עם צבעים. שימוש במספר גדול של תאים גורם להכתמים הטרוגנית ועניים, בעוד השימוש בתאים מעטים מדי מניב התאוששות תאים עניים.
    3. צנטריפוגה את הצינורות ב 100 x g עבור 5 דקות ב-RT כדי לקבל גלולה תא. משאיר בזהירות את סופרנטנט עוזב לא יותר מ 15-25 μL של נפח שיורית.
    4. השעיה מחדש של ECFCs ו MSCs ב 250 μL של דילול C מערכת הצבע. בעדינות פיפטה את התא הבולם כדי להבטיח פיזור מלא.
      הערה: דילול C הוא מלח פיזיולוגי, והוא עשוי להפחית את יעילות הצביעת של צבע על ידי יצירת מיקרולים. לכן, לא נותנים תאים לעמוד לדלל C למשך זמן רב, ולא מערבולת את הצינורות.
    5. להכין את הפתרון המכתים עבור ECFCs על ידי הוספת 5 μL של PKH67 ל250 μL של דילול C (ריכוז סופי של 20 μM) ו עבור MSCs על ידי הוספת 3 μL של PKH26 כדי 250 μL של דילול C (ריכוז סופי של 12 μM).
      הערה: ריכוזי הצבע הסופיים שונים מההמלצות של היצרן. ריכוז גבוה יוביל לפיפינג. ולרעילות תאים ריכוז נמוך לא יספיק. להכתמים
    6. הוסף 250 μL של השעיית תא ECFCs ל 250 μL של PKH67 צבען פתרון, ו 250 μL של MSCs כדי 250 μL של פתרון PKH26 צבען. מיד לערבב את התאים עם צבעים על ידי ליטוף למעלה ולמטה הדגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לקבלת תוצאות טובות יותר, לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום ומקום על שייקר כדי להבטיח ערבוב מספיק במהלך הצביעת.
    7. להפסיק את תהליך הכתמים על ידי הוספת 0.5 mL של FBS כדי ההשעיה התא ויטראז ', ולאחר מכן הדגירה עבור 1 דקות כדי לאפשר FBS לאגד צבע עודף לא מאוגד. משקע את התאים המוכתמת על ידי תפרידו ב 100 x g עבור 5 דקות.
      הערה: ECFCs ו MSCs כדורי הם בהירים צהוב וורוד, בהתאמה, לאחר כתמים.
    8. הסר בזהירות את supernatant ולשטוף את התאים פעמיים עם בינוני מלא כדי להסיר את הצבע העודף. צנטריפוגה את הצינורות ב 100 x g עבור 5 דקות ו-להשעות מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של כל מדיום שלם.
  3. יצירת ECFC, MSC או ECFC + MSC
    הערה: החל את טכניקת השחרור התלויה כדי ליצור spheroids כמתואר בעבר28. השלבים להכנת הספרואידים מקבלים להלן.
    1. . תספור את הMSCs והמוכתמת
    2. השהה ECFCs, MSCs או ECFCs + MSCs ב ECGM-MV2 המכיל 20% מתילתאית פתרון ו 5% FBS. להכין בצפיפות תא של 4 x 104 תאים/ML עבור ECFCs או MSCs (25 μl של תא הבולם מכיל 1,000 תאים). עבור שני השעיית תא של ECFCs ו MSCs, להכין בצפיפות תא של 2 x 104 תאים/Ml ECFCs ו 0.4 x 104 תא/Ml MSCs (25 μl מכיל 500 ecfcs ו 100 MSCs).
      הערה: היחס של ECFCs ל-MSCs לא יעלה על 5:1. מספר גדול יותר של MSCs עלול לגרום להגירה מוגזמת ולמבנה לא סדיר של נבט. מספר קטן יותר של MSCs יכול לגרום לאינטראקציה ירודה בין התאים, מניב לבלוב עניים.
    3. הכינו יחידת לחות על-ידי הוספת 15 מ ל של PBS לתחתית לוחית התרבות 150 מ"מ.
    4. להעביר את ההשעיה התא לתוך מאגר מלבני של פוליסטירן מעוקר לשימוש בצינורות רב-ערוצי. פזר את התאים מושעה באופן שווה על ידי ליטוף.
    5. הפקדה 25 μL טיפות של תא הבולם על העטיפה של 150 מ"מ צלחת התרבות באמצעות מחבר מרובת ערוצים (כ 100 טיפות/לכסות של הלוח 150 מ"מ). להפוך את המכסה על יחידת מילוי ממולא PBS ו מודטה בחממה תרבות התא עבור 24 שעות.
      הערה: פתרון מתילתאית מספק צמיגות נאותה לפתרון ההשעיה. כאשר שיטת ירידה תלויה ללא מתילתאית פתרון, טיפות היו בקלות החליק כאשר המכסה היה הפוך (איור משלים 1). יתרה מזאת, לאחר הדגירה של הלילה, הספרואידים לא נוצרו בצורה מושלמת ללא תמיסת מתילתאית. תוצאה זו מצביעה על צמיגות נאותה על ידי מתילזה פתרון הצלולוזה הכרחי כדי ליצור צורה עגולה של הספרואידים.

היום השני

  1. מבזבוזים מבוססי ג'ל קולגן לנטרל
    1. FBS חם ו ECGM-MV2 (ללא FBS ו-GPS) באמבט מים (37 ° c). מניחים קר מתילתאית פתרון על ספסל העבודה כדי להביא את טמפרטורת החדר.
    2. מניחים צלחת 24 היטב בחממה לתרבות התא (37 ° c) להתחממות.
    3. חותכים את המחודד 1 מ ג מחודד טיפים 3-5 מ"מ כדי מתיז spheroids והשעיות צמיגה, כגון הפתרון מתילתאית וסוג אני קולגן, בנוחות ובדייקנות.
    4. להכין 3 מ"ג/mL מנוטרל סוג אני קולגן ג'ל על הקרח בעקבות סוג אני ההוראה של יצרן הקולגן ג'ל.
      הערה: ניטרול צריך להתבצע על קרח כדי למנוע הגגנציה של קולגן בטמפרטורת החדר. עבור אחד טוב של צלחת 24-הבאר, 500 μL של קולגן לנטרל נדרש. הכינו תמיד 1 מ"ל נפח נוסף של קולגן. ג'ל קולגן ניתן להשתמש עד 2-3 h לאחר ניטרול אם נשמר על הקרח.
    5. לקצור את הspheroids על ידי שטיפה את המכסה המכיל spheroids עם 5 מ ל של PBS. לאסוף פתרון מושעה ספרואיד בשפופרת חרוט 50 mL. לשטוף מחדש את המכסה עם 5 מ ל של PBS כדי לקבל את הspheroids הנותרים.
      הערה: במהלך הקציר, להתבונן היטב כדי לאשר את קיומו של הספרואידים. לקבלת בדיקה חזותית נוספת, העבר כ-50-100 μL של פתרון מושעה באמצעות ספרואיד על זכוכית השקופית, ובדוק את הצורה העגולה של הספרואידים מתחת למיקרוסקופ.
    6. משקע spheroids על ידי תפרידו ב 282 x g עבור 5 דקות. לבטל את supernatant בזהירות בלי להפריע spheroids להשאיר מאחור לא יותר מ 100-200 μl של נפח שיורית.
    7. להקיש בעדינות על הקיר של הצינור, כך spheroids מושעה בחופשיות הנותרים 100-200 μL שיורית פתרון.
    8. הוסף ECGM-MV2 המכיל 5% FBS ו 40% מתילתאית פתרון הצינור המכיל את הצינורית. אמצעי האחסון שנוסף נקבע על בסיס כ-100 spheroids/mL. מערבבים בעדינות את ההשעיה הספרואיד באמצעות ליטוף עם טיפ קהה של 1 מ ל.
      הערה: פתרון מתילתאית משמש רבות כסוכן משהה שאינו מאפשר הספרואידים למשקעים. ריכוז FBS צריך להיות 5%. ריכוז FBS גבוה גורם לבלוב נורמלי בשל גורמי גדילה מוגזמת. ריכוז FBS נמוך אינו יכול לשמור על תנאים בריאים לתאים.
    9. מערבבים פתרון השעיה ספרואיד ו מנוטרל-סוג אני קולגן ג'ל (3 מ"ג/mL) ביחס 1:1 על קרח. השתמש בטיפ קהה של 1 מ ל כדי למנוע שבירת הספרואידים.
      הערה: 1 מ ל של הספרואידים-השעיית הפתרון ג'ל קולגן נדרש עבור אחד היטב של צלחת 24. לעשות פתרון השעיה מעורבת נוספת אם אפשר.
    10. אם המאפיינים האנגיוגנטיים של כל סוכן (ים) או כימיקלים צריך להיבדק, להעביר 1 מ ל של התמיסה השעיית כספרואיד ג'ל קולגן ב-1 mL מיקרו צינור ולהוסיף סוכן (s) או כימיים ואחריו ערבוב עדין עם טיפ בוטה 1 מ ל.
      הערה: נפח של סוכן כימי יכול לסכם ל 200 mL, אשר מדלל את סוג אני הקולגן ג'ל הריכוז מ 1.5 mg/mL ל 1.25 mg/mL, אבל לא משפיע על סוג אני הקולגן ג'ל פולימוניזציה. הוסף את אותו כמות הרכב. לפני ההרואידים בבקרה
    11. הוסף את הפתרון של ג'ל הקולגן ספרואיד-השעיית לבארות של צלחת טרום מחומם של 24 שעות (0.9 mL/ובכן) על ידי ליטוף, ולאחר מכן לאחר מכן מודקת 30 דקות בחממה לתרבות התאים לצורך פולימוניזציה.
      הערה: במהלך תהליך ההטבעה הספרואיד, אל תפריע לג על ידי הצלחת.
    12. לכסות את ג'ל הקולגן ספרואיד-השעיית על-ידי הוספת 100 μL של ECGM-MV2 המכיל 2.5% FBS עם/ללא מנהל. עבור הספרואידים של ECFC בלבד, לעורר את התאים עם תוספת אקסוגני של הריכוז הסופי של 50 ng/mL כדי ליצור נבטים הנכון. ECFC + MSC spheroids אינם דורשים גירוי אקסוגני על ידי כל גורמי גדילה.
    13. מניחים את הצלחת מקליט תא בזמן אמת מותקן בחממה תרבות התא (37 ° צ' ו 5% CO2), ובאופן אקראי להתמקד 5-10 spheroids (10x היעד עדשה). עקוב אחר לבלוב היווצרות של כל הספרואידים בעלי תווית פלואורסצנטית כל 1 עבור 24 שעות ללא כל הפרעה.

4. כימות הנביטה

  1. יבא את קבצי התמונה לתוכנת ImageJ כדי לכמת את מספר הנבטים ולמדוד את אורכו של כל נבט. עבור הספרואידים שיתוף תרבות, התווית ECFCs עם צבע פלורסנט ירוק לפני ביצוע spheroids. לאחר מכן, למדוד את מספר ואורך של נבטים מוכתם עם זריחה ירוקה (משלים איור 2). חמישה מכרואידים שנבחרו באופן אקראי. היו מרושמות לכל קבוצה ניסיונית
    הערה: נבטים הם מבנים מאורכים משתף פעולה הנוצר על ידי מספר ECFCs הארכת מתוך spheroids. אורך נבט נמדד כאורך מנקודת מוצא נבטים מן המשטח של spheroids לקצה של נבטים.
  2. בטא את הערכים כאמצעי ± SEM של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. קבע את ההפרש המשמעותי הסטטיסטי באמצעות ANOVA בכיוון אחד עבור השוואות מרובות או מבחן tשל סטודנט עבור השוואות לשיוך.
    הערה: P ≤ 0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויי השוואה בוצעו באמצעות spheroids מונו תרבות (ECFCs בלבד) ושיתוף תרבות משותף (ECFCs + MSCs) כדי לבדוק אם MSCs לשחק תפקיד ניכר ב-ECFCs-תיווך באנגיוגנזה. לבלוב היווצרות של כל ספרואיד היה מפוקח 24 שעות על ידי מקליט תא בזמן אמת שיכול ללכוד את ההתקדמות של לבלוב אנגיוגנטי מתוך הספרואידים. פוטנציאל אנגיוגנטי היה כולל על ידי ספירת מספר נבטים ומדידת האורך המצטבר של נבטים שנוצרו מההרואידים בודדים. חמש באקראיות שנבחרו. לקבוצה ניסיונית עבור ECFCs + MSCs spheroids, מספר הנבטים ואורך הנבט המצטבר היו גבוהים באופן משמעותי בהשוואה לא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מציג שיפור מערכת האנגיוגנזה מחוץ למערכת שיטה ניצול שיתוף התרבות הנוצרת על ידי שני ושלתי cell האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs. Co-תרבות ספרואיד מערכת יכול לחקות vivo כלי הדם נבט היווצרות, אשר הוא שבוצעה באמצעות אינטראקציה והתאגדות בין תאי האנדותל וכלי קרום הלב. לעומת אחרים באנגיוגנזה מתורבת, שמשקף רק את האנגיוגנזה של ECs-תיווך, מערכת שיתוף התרבות הזו מייצגת יותר את המפל הרב של האנגיוגנזה הפיזיולוגי, כולל אינטראקציה תאית, לבלוב, היווצרות שפופרת, וההבשלה של הספינה. זו מערכת שיטה חדשה מבוססת גם דומה הvivo מיקרו הסב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק (17172mfds215) מהמשרד של מזון ובטיחות סמים, הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (msip) (2017r1a2b4005463), ואת תוכנית המחקר הבסיסי המדע באמצעות ה הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך (2016R1A6A1A03007648).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין EDTA (1x)Gibco25300-054
BevacizumabRocheNAשם מסחרי: Avastin
Dulbecco Modified Eagle MediumGibco11885-084DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered salt (10x)Gibco21600-010PBS (10x)
Dulbeco's Phosphate buffered מלח (1x)קורנינג21-031-CVRPBS (1x)
ערכת MV2 בינונית גידול תאי אנדותלPromocellC-22121ECGM-MV2
סרום בקר עוברי (FBS)אטלסFP-0500AFBS
ג'לטיןBD Sciences214340
L-גלוטמין– פניצילין– StreptomycinGibco10378-016GPS
מדיום גידול תאי גזע מזנכימליים-2PromocellC-28009MSCGM-2
מתיל תאיתSigma-AldrichM0512
PKH26 ערכות קישור תאים פלואורסצנטייםSigma-AldrichMINI26PKH26
PKH67 ערכות קישור תאים פלואורסצנטייםSigma-AldrichMINI67PKH67
נתרן הידרוקסידSigma-AldrichS5881
סוג I ג'ל קולגןקורנינג354236
גורם גדילה אנדותל כלי דםR& D293-VE-010VEGF

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
  3. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  4. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  5. Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
  6. Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
  7. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
  8. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
  9. Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
  10. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
  11. Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
  12. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  13. Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
  14. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  15. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  16. Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
  17. Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
  18. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
  21. Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
  22. Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
  23. Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
  24. Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770(2017).
  25. Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
  26. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
  27. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
  28. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  29. Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716(2018).
  30. Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IIC50 Bevacizumab

מאמרים קשורים