גרימת דלקת קרום הגרון הקבוצה C בעכברים באמצעות משלוח התאיים

Chiara Pagliuca; Elena Scaglione; Francesca Carraturo; Giuseppe Mantova; Maria Michela Marino; Maria Virginia Pishbin; Caterina Pagliarulo; Roberta Colicchio; Paola Salvatore

doi:10.3791/60047

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גרימת דלקת קרום הגרון הקבוצה C בעכברים באמצעות משלוח התאיים

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60047

⸱

5 בנובמבר 2019

Chiara Pagliuca¹ , Elena Scaglione¹ , Francesca Carraturo¹ , Giuseppe Mantova¹ , Maria Michela Marino¹ , Maria Virginia Pishbin¹ , Caterina Pagliarulo² , Roberta Colicchio¹ , Paola Salvatore¹^,³

¹Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, ²Department of Science and Technology, Sannio University, ³CEINGE – Advanced Biotechnology

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטה לגרום דלקת קרום הגרון דרך מסלול הזיהום התאיים בעכברים למבוגרים. אנו מציגים צעד אחר צעד פרוטוקול של דלקת קרום הגרון מתוך הכנת האיסיס לזיהום התאיים; לאחר מכן להקליט את ההישרדות בעלי חיים ולהעריך את העומסים חיידקי ברקמות murine.

תקציר

מנינגוקוקוס הוא מיקרואורגניזם בטווח הצר, המזוהה באופן גלובלי כגורם המוביל לדלקת קרום הגרון החיידקית. מנינגוקוקוס הוא הקולוניאליסט ארעי של האף האנושי האדם של כ 10% של נושא בריא. בנסיבות מסוימות, היא מקבלת יכולת פולשנית לחדור אל מכשול המוקוסל ופולשת למחזור הדם הגורם לספטיתרמיה. במקרה האחרון, אלח דם שתוללת יכול להיווצר גם ללא ההתפתחות הסוגר של דלקת קרום המוח. לעומת זאת, חיידקים יכולים להתרבות בצורה גרועה במחזור הדם, לחצות את מכשול המוח בדם, להגיע למערכת העצבים המרכזית, המובילה לדלקת קרום הדם הרועמת. מודלים murine של דלקת הקרום החיידקי מייצגים כלי שימושי כדי לחקור את האינטראקציות המארחים הפתוגן ולנתח את המנגנונים הפתוגנטיים האחראים למחלה קטלנית זו. למרות, מספר מערכות מודל ניסיוני הוערכו בעשורים האחרונים, אף אחד מהם לא הצליחו לשחזר את האירועים הפתולוגיים האופייניים של מחלת קרום הגרון. בפרוטוקול ניסיוני זה, אנו מתארים הליך מפורט עבור אינדוקציה של דלקת קרום הגרון במודל העכבר מבוסס על החיסון התאיים של חיידקים. הסימנים השונים של דלקת קרום המוח האנושי נרשמו במארח murine באמצעות הערכה של פרמטרים קליניים (למשל, טמפרטורה, משקל הגוף), הערכה של שיעור ההישרדות, ניתוח מיקרוביולוגית ובדיקה היסטולוגית של פגיעה מוחית. בעת שימוש ב-תאיים (i. ושכב.), מסירה מלאה לגמרי ישירות לתוך cisterna מגנה, המובילה לשכפול מאוד יעיל של קרום המוח ברקמת המח. גידול 1,000 מקפלים של ספירה קיימא של חיידקים הוא נצפתה כ 18 h. יתר על כן, מניגוקוצ'י נמצאים גם בטחול, ובכבד של עכברים נגועים, הרומז כי הכבד עשוי לייצג איבר יעד עבור שכפול קרום הגרון.

מבוא

מנינגקוקוס היא β שלילית-פרוטקוביום מוגבל לפונדקאי האנושי, ידוע בהיותו אחד הגורמים השכיחים ביותר של דלקת קרום הגוף ואלח דם באוכלוסייה האנושית ברחבי העולם. הוא מקולוניא את מערכת הנשימה העליונה (האף והגרון) של נשאים בריאים ואסימפטומטיים (2-30% מהאוכלוסייה), אבל החיידק מתחמק לפעמים שונים הגנות החיסון העצמי מתפשט ממחזור הדם למוח גרימת מקומי בלתי מבוקרת דלקת, הידועה בשם. דלקת קרום הגרון שילוב של גורמים מארחים וחיידקיים מופיע כדי לתרום את המעבר מן הקומנדציה להתנהגות פולשנית¹.

(ש ע) מנינגטידיס , מתמחה באופן בלעדי בקולוניזציה אנושית וזיהום. יש לו טווח מארח צר, ולכן, יש מוגבל במחקרים vivo בפתוגנזה בשל העדר מודלים בעלי חיים מתאימים השעתקים מחלת הקרום האנושי. כתוצאה מכך, היא הובילה לפערים בסיסיים בהבנת הפתוגנזה של ספטטימיה ודלקת קרום הגרון שנגרמו מחיידק הקרום. בעשורים האחרונים, התפתחות של מערכות מבחנה רבות אפשרה זיהוי של מספר גורמים התקפה אלימה של הקרום²^,³^,⁴. למרות מחקרים יקרי ערך אלה סיפקו תובנות חשובות כדי להבין את התפקיד של גורמים אלה עבור זיהום קרום הגרון מוצלח, מודלים אלה לא אפשרו הערכה של ההשלכות של אינטראקציות חיידקי עם המוסר והסלולר מערכת החיסונית ואפילו פחות עם הרקמה כולה. במודלים של בעלי חיים vivo של זיהום הם בעלי רלוונטיות רבה גם עבור הערכה של תואר הגנה הענקת על ידי ניסוחים החיסון. כפתוגן אנושי-טרופי, מנינגוקוקוס בעלי דטרמיניזם מתאים הכרחי לזיהום מוצלח כגון מבני פני השטח (כלומר, הקלד IV והאטימות חלבונים) ומערכות ספיגה ברזל עבור קולטנים אנושיים וחלבונים הובלה (כלומר, transferrin ו-lactoferrin)⁵^,⁶^,⁷ כדי לדבוק כראוי, לשרוד ולפלוש הפונדקאי האנושי. לבסוף, את היכולות הגנטיות וריאציה של הפתוגן להתחמק ו/או לחסום את התגובה החיסונית האנושית עוד לתרום הזנים הגבוהים tropism⁸^,⁹. לכן, העדר גורמים מארחים מסוימים, המעורבים באינטראקציה, יכולים לחסום את הצעדים של מחזור החיים של הפתוגן, הקמת קשיים משמעותיים בפיתוח של מודלים בעלי חיים קטנים המסכמים את מחזור החיים של קרום הגרון.

במהלך העשורים האחרונים פותחו מספר גישות כדי לשפר את הבנתנו את המחזור הזיהומיות של קרום הגרון. זיהומים של שני דגם בעלי חיים, עכבר ועכברוש, או intraperitoneally (כיתה) או intranasally (i.n.), פותחו כדי לשחזר את מחלת קרום הגרון¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. עכבר המעבדה הוא כנראה אחד החיות תכליתי יותר עבור גרימת זיהום קרום הגרון ניסיוני.

עם זאת, הדרך הקומתי של זיהום מוביל להתפתחות של אלח דם חמורים למרות שהוא לא לחקות את התוואי הטבעי של זיהום, בעוד התוואי i.n. של זיהום היה שימושי כדי להעריך פתוגנזה מעיים, למרות שזה עלול לגרום לדלקת ריאות לפני אלח דם¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷.

מודל העכבר כאיי היה אינסטרומנטלי להעריך את ההגנה מפני האתגר של קרום הגרון¹⁰^,¹¹^,¹². מודל העכבר של הקולוניזציה מחלת הקרום מבוסס על תוואי i.n. של זיהום פותחה עם עכברים התינוק, כפי שהם רגישים יותר קרום הגרון, כדי לשכפל זיהום פולשני מחקה את הקורס של מחלת קרום הגרון בבני אדם¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. יתר על כן, כדי לקדם את שכפול קרום הגרון במארח murine, מספר גדל והולך של אסטרטגיות טכניות יושמו גם כולל את הניהול של הברזל לבעלי חיים כדי לשפר את הזיהום, השימוש בחיידקים גבוהים בקטריות, העכבר מאמץ חיידקי בקטריאלי, כמו גם את התעסוקה של התינוק או בעלי חיים מארחים חיסוני¹⁰^,¹³^,¹⁵^,¹⁸^,¹⁹. ביטוי של גורמים אנושיים ספציפיים כמו CD46²⁰ או transferrin²¹ הגביר את הרגישות של עכברים לחיידק זה אנושי-טרופי; התעסוקה של העור האנושי מודל מבע של זיהום גם היה שימושי כדי להעריך את היכולת הדבקה של מניגוקוצ'י לאנדותל האנושי²²^,²³. באופן קולקטיבי, ההתפתחות האחרונה של עכברים טרנסגניים הומניזציה שיפרה את ההבנה של הפתוגנזה קרום הגרון ואת האינטראקציות המארחות שלה.

בעבר, פיתחנו מודל murine של דלקת קרום הגרון שבו החיסונים של חיידקים בוצעה לתוך cisterna מגנה של עכברים מבוגרים עם העכבר-passaged חיידקים²⁴. פרמטרים קליניים ושיעור ההישרדות של עכברים נגועים הפגינו הקמתה של דלקת קרום המוח עם מאפיינים הדומים לאלה שנראו בפונדקאי האנושי, כמו גם, ניתוח מיקרוביולוגי היסטולוגית של המוח. מן העכברים הנגועים האלה, החיידק היו, גם, התאושש דם, כבד, טחול, ו חיידקים עומסים של איברים היקפיים בקורלציה עם המינון זיהומיות. בפרט, מודל זה הועסק כדי להעריך את התקפה אלימה של זן מוטציה איזוגניים פגום ב-L-גלוטמט המשלח GltT²⁴. לאחרונה, באמצעות מודל העכבר שלנו של קרום הגרון המבוסס על i. ושכב. המסלול עם קבוצת המיורית C זן 93/4286²^,²⁴ ו מוטציה איזוגנית פגום בקידוד cssa ב-UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase²⁵, ניתחנו את התפקיד של חומצה סילית חשופה בהקמת של מחלות בעכברים.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה ישירה כדי לגרום לדלקת קרום הגרון ניסויים בהתבסס על ה-i. ושכב. מסלול של זיהום בעכבר למבוגרים Balb/c. שיטה זו שימושית במיוחד לאפיון של זיהום קרום הגרון במארח מורכי, כמו גם להערכת התקפה אלימה בין מסוג פראי התייחסות זנים מוטציות איזוגניים. התוואי הפנים-cisternal של זיהום מבטיח משלוח שלם של קרום הגרון ישירות לתוך cisterna מגנה, אשר בתורו מקלה שכפול בקטריאלי בנוזל השדרה (שדרתי) ומעורר דלקת קרום הצורה עם תכונות המחקים אותם הנוכחים בבני אדם²^,²⁴^,²⁵^,²⁶.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה נערך כדי למזער את הסבל בעלי חיים ולהקטין את מספר העכברים בהתאם להנחיות מועצת הקהילות האירופיות של 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC). ב vivo ניסויים שדווחו במחקר זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים אתית והשתמש הוועדה (פרוט. מספר 2, 14 בדצמבר 2012) ו משרד הבריאות האיטלקי (פרוט. מספר 0000094-A-03/01/1/2013). כל ההליכים יש לבצע בתוך הקבינט Biosafety טיחות 2 (BSC2) בחדר BSL2, ואת הפסולת הנגועה פוטנציאל צריך להיות מושלך מכולות ייעודי.

1. זיהום של עכברים עם N. הזנים של הקבוצה C מאמץ

זהירות: נ. מנינגטידיס היא פוטנציאל פתוגן מזיק וכל אמצעי הזהירות הנחוצים יש לנקוט בעת טיפול במיקרואורגניזם הזה. כל הניסויים מחייבים בידוד ברמה 2 (BSL2). החוקר המעורב בלימודי בעלי חיים צריך ללבוש ציוד הגנה אישי חד פעמי (PPE) למשך הניסוי.

הכנת חיידקים לvivo במחקרים מזיהום
1. בחר מושבה אחת מן התרבות Neisseria טרי ב-GC (Gonococcal) לוחית אגר שיושלם עם 1% (vol/vol) תוסף Polyvitox ב 10 מ ל של ציר GC.
2. לגדל את החיידקים ב 37 ° c בחממה שייקר מסלולית עם מהירות של 220 rpm. תמשיך לבדוק את מנת היתר. של התרבות בעזרת ספקטרוסקופיה לגדל את התרבות עד השלב האקספוננציאלי המוקדם בצפיפות אופטית OD_600nm של 0.7, המתאים ≈ 7 x 10⁸ cfu/mL.
3. לאחר מנת יתר הנדרש מתקבל, לעשות מניות קפוא על ידי הוספת 10% גליצרול. לתת 1 מ ל של תרבות בהקפאה. אחסן את הבקבוקונים ב-80 ° צ' עד השימוש.
  הערה: למרות שעדיף להשתמש בתרבות חיידקים טריים, מניות קפואות שימשו כדי לפשט ולתקנן את הניסוי vivo. בדרך כלל מניות קפוא כבר מועסקים בתוך כ 6 חודשים מן ההכנה.
4. לפני הזיהום, להפשיר חיידקים קפואים בטמפרטורת החדר.
5. לקצור את התאים החיידקיים על ידי צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 1,500 x g ו להשעות מחדש 1 מ ל של מרק חדש GC המכיל תוספי ברזל (5 מ"ג/ק"ג).
  הערה: ציר GC מוכן עם תוספת של תוספי ברזל (5 מ"ג/ק"ג) על מנת להעדיף את השכפול של מניגוקוצ'י ברקמה המארחת¹⁴^,¹⁸^,²⁷.
6. לפני השימוש, לבצע ספירות קיימא של חיידקים כדי לקבוע את המספר המדויק של CFU לזיהום. כדי לעשות זאת, להרים 10 μL של הבולם החיידקי ולהמשיך עם דילול סדרתי ולהפיץ כל דילול על לוחות GC אגר ו-דגירה ב 37 ° צ' עם 5% CO₂, עבור 18-24 h.
הזרקת עכברים פנים-cisternal
הערהההליך כולו מבוצע בארון הזרימה למינארי כדי לשמור על תנאים אספטי.
1. עכברי מעבדה בבית (8 שבועות, נקבה Balb/c) תחת תנאים מסוימים הפתוגן חינם. מספקים כדורי מזון ומים libitum המודעה.
2. ליישב את החיות בסביבה החדשה במשך שבוע אחד לפני תחילת הניסוי.
3. לפני תחילת הניסוי, שוקלים ומעריכים את טמפרטורת הגוף שלהם.
  הערה: עכבר Balb/c הטבעי הנשי של בן שמונה שבועות שוקל ממוצע של כ 19 g. הטמפרטורה הממוצעת של עכברי מעבדה מבחינה פיזיולוגית החל מ 36-38 ° c²⁴.
4. סקרף החיה מן הצוואר, לנקות את אזור הבטן עם 70% אתנול והזרקת כדור הארץ ברזל (מומס 1% פוספט מאגר מלוחים, 250 mg/ק"ג) ברביע הימני התחתון של הבטן murine באמצעות מחט 25 גרם 0.5 mm x 16 מ"מ , כ 2-3 h לפני הזיהום.
  הערה: הזריקה התוך הצפק בוצעה ברבע הימני התחתון של הבטן murine כדי למנוע פגיעה באיברים הבטן כגון שלפוחית השתן, cecum, וכו '. הניהול של מקור ברזל אקסוגני, בצורה של dextran ברזל, לבעלי חיים לפני הזיהום מעדיף את הכפל חיידקי במחשב המארח¹⁴^,¹⁸^,²⁷.
5. לאחר 2-3 h, לבצע הרדמה בעלי חיים עם קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (3 מ"ג/ק"ג) וחומר סיכה אופטלמולוגי.
6. בדוק את עומק ההרדמה על ידי הבטחת היעדר תגובה כאב על צובט את הבוהן.
7. מיקום העכבר בתוך הלחץ הסטראלי ובזהירות למתוח את הגפיים ואת עמוד השדרה הצווארי כדי לשמור על העמודה החוליות במצב ישר.
8. בעדינות לערבב את ההשעיה חיידקי לשמור על השעיה עקבית לפני טעינת מזרק של 30 G מחט x 8 מ"מ.
  הערה: הכינו את ההשעיה החיידקית קרוב ככל האפשר לזמן ההזרקה; בינתיים, אחסן אותו בטמפרטורת החדר.
9. בהתבסס על הצבת סיכוייו חיידקי (cfu/mL), להמשיך עם החישוב של cfu הכולל לשמש, ביחס למספר הכולל של בעלי חיים להיות נגועים (מינון בקטריאלי cfu למספר בעלי חיים). להמשיך עם החישוב של הנפח המדויק להילקח מן המבחנה כדי לקבל את cfu הכולל החלת שיעור בין הצבת סיכוייו חיידקי (cfu/mL) ו-cfu הכולל שימושי עבור הזיהום של n עכברים (הודעה הצבה החוצה בקטריאלי חיידקים cfu : ml = סה כ CFU: x). לבסס את הכרך הסופי ביחס למספר הכולל של בעלי חיים להידבק.
  הערה: בניסויים אלה, מגוון רחב של סיכוייו מ-10⁴ עד 10⁹ לכל בעל חיים שימש.
10. לנקות את האזור כירורגי עם 70% אתנול.
11. לזהות את נקודת ההזרקה בעזרת מחט ולהזריק את cfu הוקמה של הקרום (סוג פראי זן מוטציה להתאמץ), או ציר GC שיושלם עם תוספי ברזל (5 מ"ג/ק"ג) כמו שליטה, בנפח כולל של 10 μl לתוך cisterna מגנה של עכברים דרך חור בגולגולת העורף באמצעות מחט 30 גרם x 8 מ"מ.
  1. לבצע את הcisternal אוקיים על ידי הצבת המחט בצומת הגולגולת צוואר הרחם, במיוחד בחלל הסוברהארכאניד. ונטרופלקס הראש כדי להפוך את החלל הזה נגיש²⁸.
  2. בקצרה, מניחים את בעל החיים בתוך שכיבה לרוחב, להחזיק את האוזניים מתוך הדרך ולהגמיש את הצוואר במתינות (90 כדי 100 °). ודא כי קו האמצע של הצוואר והראש (מהאף אל הocciput) נמצאים במצב מקביל לחלוטין לשולחן השולחן.
  3. לגעת כנפי האטלס ולוודא שהם חופפים, ביטול סיבוב צירית. כניסה טבעית יכול בדרך כלל להיות נגע על קו האמצע שבו המחט היא הסיכוי הטוב ביותר להיכנס לחור העורף.
  4. להשליך את המזרק ואת המחט בבטחה לאחר הזרקת עכברים עם Neisseria.
12. הנח את החיה בכלוב והמתן להתעוררות ולהתאוששות מלאה של התנועה.
13. שמרו על הכלובים עם עכברים נגועים תחת ארון זרימה למינארי.
14. לעקוב אחר עכברים, 24 h לאחר זיהום, עבור סימנים קליניים של תרדמת על פי קנה מידה של תרדמת²⁹. בקנה מידה: 1 = תרדמת, 2 = אינו עומד זקוף לאחר הפעלת על הגב, 3 = עומד זקוף בתוך 30 s, 4 = עומד זקוף בתוך 5 s, פעילויות אמבולטוריות מינימלי, 5 = נורמלי.
  הערה: כאשר בבעלי חיים הוקלט כאב, כאבים מלוקסיעם (5 מ"ג/ק"ג כיתה למשך הלימודים) היה מנוהל.
15. המשך להישרדות בעלי חיים או CFU מונה את הערך על בעלי חיים נגועים כמפורט בשלב 2.
16. לבצע המתת חסד של עכברים עם ציון של 2 על ידי פריקה צוואר הרחם להקליט מת לניתוח סטטיסטי.

2. הישרדות בעלי חיים וספירות CFU

הישרדות בעלי חיים
1. הכנת בקטריאלי חיידקים במינונים שונים (החל 10⁴ כדי 10⁹ cfu לכל עכבר) כדי להדביק בעלי חיים על ידי ה-i. ושכב. נתיב (ראה שלב 1.2).
2. הנחסן שליטה עכברים עם ציר GC, שיושלם עם תוספי ברזל (5 מ"ג/ק"ג), באותו אופן.
3. ניטור בעלי חיים לתסמינים קליניים: פרווה מלאה, מראה כפופות, היפותרמיה, הרזיה, עייפות, או מוריבנד²⁴^,²⁵^,²⁶^,³⁰, כל יום במהלך הניסוי כולו עבור 168 h (7 ימים) לפחות פעמיים ביום למשך הניסוי.
4. מדדו את משקל הגוף והטמפרטורה באמצעות איזון דיגיטלי ומדחום רקטלי, בהתאמה כל יום.
5. להקליט את ההישרדות של עכברים במשך שבוע.
  הערה: הקלט את המוות הטבעי של זיהום בעלי חיים בעוד החיות להגיע לערך התרדמת של 2 או כי לשרוד מעל 168 h של התבוננות יהיה מורדמים.
6. עכברים מורדם עם ערך תרדמת של 2 או ששרדו על זמן התצפית עם קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (3 מ"ג/ק"ג) ולהחיל משחה אופטלמולוגית.
7. בדוק כי תגובת הכאב נעדר על ידי צביטה בבוהן.
8. לבצע המתת חסד של עכברים על ידי פריקה צוואר הרחם ולהקליט מת לניתוח סטטיסטי.
הערכה של יחידות ליצירת מושבה (CFU) ספירות באיברים היקפיים
1. השתמש במינון תת-קטלני בקטריאלי (5 x 10⁵cfu/עכברים) על בסיס תוצאות ההישרדות של בעלי חיים על ידי הושכב. תוואי (ראה סעיף קטן 1.2).
2. לפקח על טמפרטורת פי הטבעת כל יום במהלך הזיהום ולבצע הרדמה של בעלי חיים ב 48 h לאחר הזיהום כאמור בשלב 2.
3. המשך עם 70% לחיטוי אתנול של החזה ונסיגה 600-700 μL של דם על ידי ניקוב לב של חלל החזה באמצעות מחט של 25 גרם 0.5 mm x 16 מ"מ.
4. לאסוף את הדם בצינור המכיל 3.8% נתרן ציטראט וחנות ב-80 ° צ' עבור ספירות תא חיידקי קיימא מאוחר יותר.
5. לבצע נקע בצוואר הרחם כדי להקריב את החיות. לאשר את הקלטת המוות את היעדר פעימות הלב, לאחר הקרבת העכבר על פי כל ההנחיות המוסדי והאתיות הרלוונטיות.
6. הנח את העכבר במצב פרקדן ולהשתמש מספריים מלקחיים כדי להמשיך עם החתך של הפרווה לאורך מישור משונן של הגוף. לתקן את העור עם הפרווה על צידי הגוף עם סיכות.
7. חתכו את קרום הצפק. בעזרת מספריים חדים השימוש במספריים ומלקחיים חד פעמיים כדי לבלו את האיברים (למשל, הטחול והכבד) ולשים כל אחד בצלחת פטרי סטרילית עם 1 מ ל של ציר GC בתוספת 10% (vol/vol) גליצרול.
8. להיפטר בבטחה את גוף העכבר לפי הנחיות IACUC.
9. המגון האיברים מכנית בטמפרטורת החדר עם הבוכנה של מזרק 5 מ"ל עבור כ 2-3 דקות עד השעיה תא יחיד נוצר ולהעביר אותו בצינור.
10. שימי את הצינור עם דגימת העור. המנועלת מיד על הקרח היבש
  הערה: דגימות ניתן לאחסן ב-80 ° c ב-2 מ"ל צינור סטרילי לביצוע ספירת תאים בקטריאלי קיימא הערכה בנקודות מאוחרות יותר.
11. להפוך לוחות GC אגר עם אנטיביוטיקה כאשר נדרש. לייבש את הצלחות לפני השימוש מראש מקדם הדגירה ב 37 ° c עבור 2-3 h.
12. להכין מדלל סדרתי 10 מקפלים של דגימות בציר GC מכל רקמה הומוגניים לוחית על לוחות GC אגר. דגירה לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO₂.

3. הכנת רקמות מוח לספירת CFU

השתמש במינון תת-קטלני בקטריאלי (5 x 10⁵cfu/עכברים) על בסיס תוצאות ההישרדות של בעלי חיים על ידי הושכב. תוואי (ראה סעיף קטן 1.2).
לבצע הרדמה של בעלי חיים בזמן זיהום הוקמה כפי שהוזכר בשלב 2.
לבצע המתת חסד של בעלי חיים על ידי פריקת צוואר הרחם.
לנקות את האזור כירורגי עם 70% אתנול.
לחתוך את הראש של העכבר באמצעות מספריים גדולים.
לכרות את הפרווה ואת העור בעזרת מספריים כירורגי קטן מלקחיים פלדה משופעת, ממשיך לכיוון העליון של הגולגולת כדי להיות מסוגל בבירור לראות את התפרים כדי להנחות את הפתיחה של הגולגולת.
הכניסו את קצה המספריים הזעירות דרך מגנום האמן כדי לפתוח את הגולגולת.
חותכים לכיוון מרכז הגולגולת ומעבר לקו האמצע של עצם הקודקוד לצדו הנגדי של הגולגולת. חותכים בעדינות את השפה הצדדית. של התפר המדוליד
הרם את הגולגולת החל בפינה הקודקודית האחורי ומשוך אותו באלכסון כלפי מעלה כדי לגלות את המוח, באמצעות מלקחיים משופעת עדין.
ודא שרקמת המוח אינה מחוברת לעצם של הראש, כאשר הגולגולת מוסר.
השתמש מלקחיים חד פעמיים כדי להסיר את כל רקמת החיבור בין הגולגולת והמוח, כדי להבטיח כי רקמת המוח הוסר יחד עם הגולגולת.
אל תאפשר לרקמת המוח. להתייבש יותר מדי מניחים את המוח, באמצעות מלקחיים חד פעמיים, בצלחת פטרי עם 1 מ ל של ציר GC בתוספת 10% (vol/vol) גליצרול.
המגון מכנית את המוח עם הבוכנה של מזרק 5 מ ל (ראה שלב 2.2.9). העבר את הדגימות לתוך שפופרת סטרילי 2 מ ל וחנות-80 ° c עבור הערכה מאוחר יותר של תא חיידקי קיימא ההערכה כפי שנדונו בשלב 2.2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הישרדות של עכברים נגועים ב -N. מנינגטידיס מסוג פראי וזנים מוטנטים איזוגניים.
זנים neisseria בשימוש בתוצאות אלה הנציגים הם קבוצת המסרוט C התייחסות מאמץ 93/4286 (ET-37) ואת המוטציה האיזוגנית שלו 93/4286Ωcssa שהושגו על ידי insertional איון פעלה של הגן cssa , קידוד עבור ה-UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase, כי מפות ב סינתזה הקפסולה לוקוס²⁵. כדי להעריך את הרמה התקפה אלימה של מאמץ פגום Cssaבמודל murine הנוכחי, את המינון הקטלני מסוגל לקבוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול ניסיוני לגרום דלקת קרום הגרון בעכברים למבוגרים על ידי i. ושכב. חיסון. של חיידקים מקרום הגרון לידיעתך, אין מודל אחר של קרום הגרון שפותחה בעכברי מעבדה נגועים על ידי i. ושכב. דרך בעבר, בדרך זו נחקרו כדי לספק מודלים של דלקת קרום הגרון בשני עכברוש³¹ ו ארנב³². זה ידוע כי השיעור הגבוה ביותר של מחלת קרום הגרון נמצא בין ילדים צעירים, מתבגרים, ומבוגרים צעירים³³^,³⁴^,^35<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחקרים היו נתמכים בחלק על ידי מ2012 [מספר מענק 2012wjsx8k]: "מארח-חיידק אינטראקציה מודלים זיהומים רירית: פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות הרומן" ועל ידי מורה 2017 [2017sfbfer]: "גישה משולבת להתמודד עם הגומלין בין הסתגלות, תנאים מלחיצים ועמידות מיקרוביאלית של פתוגנים מאתגרים ".

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1,8 חצאית Cryovial עם חוט חיצוני	Starlab	E3090-6222
50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן	Falcon	352070	30 מ"מ x 115 מ"מ
מלקחיים אדסון	FST	11006-12
מדחום אזעקה	TESTO	9000530
BactoTM Proteose Peptone	BD	211693
BD מזרק מיקרו עדין	BD	320837	U-100 אינסולין
BD מזרק פלסטיפק 1 מ"ל 25 גרם 5/8 אינץ'	BD	300014	05 מ"מ x 16 מ"מ
מזרק BD פלסטיפק 5 מ"ל	BD	308062	07 מ"מ x 30 מ"מ
BIOHAZARD AURA B ארון זרימה למינרית אנכית	Bio Air S.C.r.l.	Aura B3
ביופוטומטר	אפנדורף	דגם #6131
בקבוק D	Tecniplast	D	בוגר עד: 400 מ"ל, נפח כולל 450 מ"ל, 72 מ"מ x 72 מ"מ x 122 מ"מ
C150 CO₂ קלסר אינקובטור		9040-0078
גוף כלוב Eurostandard Type II	Tecniplast	1264C	267 x 207 x 140 מ"מ³, שטח רצפה 370 ס"מ²
תרבית תאים צלחת פטרי עם מכסה	תרמו מדעי		150288 נפח עבודה: 5 מ"ל
צנטריפוגה	Eppendorf	מיקרוצנטריפוגה 5415R
Cuvetta semi-micro L. Form	Kartell S.p.A.	01938-00
די-אשלגן מימן פוספט טריהידרט	קרלו ארבה	471767
די-נתרן מימן פוספט נטול מים ACS-לניתוח	קרלו ארבה	480141	g1000
תעודה סטנדרטית דיאטה	Mucedola srl.	4RF21	גלולת מזון לבעלי חיים
Dumont HP פינצטה 5 נירוסטה	F.S.T. על ידי DUMONT	AGT5034	0.10 x 0.06 מ"מ ^{2< / sup> טיפ}
איזון אלקטרוני	Gibertini	EU-C1200	מקסימום 1200 גרם, d = 0.01 גרם, T = -1200 גרם
Eppendorf צינור מיקרוצנטריפוגה מנעול בטוח	Eppendorf	T3545-1000EA
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E-6376	25 גרם
מספריים משובחים במיוחד של בון	FST	14084-08	נירוסטה
עליון (מיני מבודד), H-Temp עם מהדקי נעילה	Tecniplast	1264C400SUC
GC בסיס אגר	OXOID	CM0367
Gillies מלקחיים 1 x2 שיניים	FST	11028-15	נירוסטה
Glicerin RPE	Carlo Erba	453752	1 ליטר
מלקחיים Graefe	FST.	11052-10	רוחב קצה משונן: 0.8 מ"מ
מכסה פנימי	Tecniplast	1264C116
תמיסת דקסטרן ברזל	Sigma-Aldrich	D8517-25ML
ארון בטיחות מיקרוביולוגי קטמין אינטרווט

	כובע	בורג PP780751	מותג PP, מלקחיים לטיפול
בעכבר	FST	11035-20	גומי משונן; משטח אחיזה: 15 מ"מ x 20 מ"מ
Mucotit-F2000	MERZ	61846	2000 מ"ל
כפפות לטקס טבעיות	Medica	M101
ניו ברונסוויק קלאסי C24 אינקובטור שייקר	PBI בינלאומי	C-24 קלאסי ספסל אינקובטור שייקר
פטרי PS כלים	VWR	391-0453	90 x 14.2 מ"מ²
Pipetman קלאסי P20	גילסון	F123600	2-20 ומו; L
Pipetman Classic P200	Gilson	F123601	20-200 μ LL
Pipetman Classim P1000	Gilson	F123602	200-1,000 μ L
Polyvitox	OXOID	SR0090A
אשלגן כלורי	J.T. Baker Chemicals B.V.	0208	250 גרם
אשלגן דימימן פוספט	J.T. Baker Chemicals BV	0240	1 ק"ג
PS מלקחיים חד פעמיים	VWR	232-0191
מחלק נשלף	Tecniplast	1264C812
צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים	פלקון	352063	5 מ"ל
נתרן כלורי	MOLEKULA	מחזיק SS 41272436
ומסנן פוליאסטר	Tecniplast	1264C
מלקחיים דפוס סטנדרטי	FST	11000-12	מספריים
טנוטומיה של סטיבנס	FST	14066-11
מספריים כירורגיים מנירוסטה - ToughCut	FST	14130-17
כפפות ניטריל חד פעמיות מגע N טוף	Ansell	92-500
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד (ULT) Haier		DW-86L288	נפח = 288 L
מספריים וגנר	FST	14070-12	נירוסטה
קסילזין	אינטרווט

מנירוסטה מסנן BH-EN ו- BHG Class II מהיר יותר BH-EN 2004 צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל גראד אל חלד

מקורות

van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139(2013).
Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).
Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750(2016).
Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116(2007).
Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36(2004).
Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137(2018).
Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653(2012).
Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מודל עכברים הזרקה תוך-ציסטרנלית Neisseria Meningitidis דלקת קרומי המוח חיידקית ציסטרנה מגנה (Cisterna Magna)אינטראקציה בין מאחס לפתוגן זיהום רקמת מוח ניתוח שיעורי הישרדות בדיקה היסטולוגית

גרימת דלקת קרום הגרון הקבוצה C בעכברים באמצעות משלוח התאיים