מאמר שיטה

שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס

DOI:

10.3791/60057

⸱

30 ביולי 2019

 ,  , 
1Ruth L. and David S. Gottesman Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Research, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Cell Biology and Stem Cell Institute, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 4Albert Einstein Cancer Center and Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משאבות xenoביוטיקה פעילים מאוד בתאי גזע ומחולל קדמון (HSPCs) ולגרום שחול TMRM, קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאל לצבוע פלורסנט. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במדויק פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ב HSPCs על ידי TMRM בנוכחות Verapamil, מדכא משאבת משאבה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמו חילוף החומרים הסלולר הוא וסת המפתח של תא גזע המטבית (HSC) התחדשות עצמית, התפקידים השונים שיחק על ידי המיטואיטין הומאוסטזיס ההטיות כבר נחקרו בהרחבה על ידי חוקרים HSC. רמות פעילות מיטוכונדריאלי משתקפות בפוטנציאל הממברנה שלהם (ΔΨm), שניתן למדוד אותם על-ידי שלבים העלולים להיות מיועדים לצבעים כגון TMRM (טטרמתיל, מתיל אסתר). היכולת של משאבות אפלוקס להבלטת צבעים אלה מתאים יכולים להגביל את התועלת שלהם, עם זאת. הטיית המדידה המתקבלת היא קריטית במיוחד בעת הערכת HSCs, כשטרנספורטי מובילים מציגים רמות גבוהות יותר של ביטוי ופעילות ב-HSCs מאשר בתאים המובחנים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ניצול Verapamil, מעכב משאבת משאבה, כדי למדוד במדויק ΔΨm על פני אוכלוסיות מרובות מח עצם. העיכוב כתוצאה של פעילות המשאבה מוצג כדי להגביר את עוצמת TMRM בתוך המטפאות גזע ומחולל קדמון (HSPCs), תוך השארת אותו ללא שינוי יחסית בשברים בוגרים. פעולה זו מדגישה את תשומת הלב הקרובה לפעילות צבען-אפלוקס הדרושה כאשר משתמשים בצבעים תלויי-ΔΨm, וכמו שכתוב ודמיינו, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות בין אוכלוסיות שונות בתוך מח העצם, או באותה אוכלוסייה על-פני דגמים ניסיוניים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע המטפאות (HSCs) מחדשים את עצמם, רב-עוצמה, ומסוגלים להצמיח את כל תאי הדם1,2. מטבוליזם הסלולר הוא וסת מפתח של תחזוקה hsc, יחד עם גורמים transcript, אותות פנימיים ומיקרואקולוגיה3,4,5. השליטה הנכונה של תפקוד מיטוכונדריאלי ואיכות הוא אפוא קריטי לתחזוקת hsc6,7.

פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) הוא פרמטר מפתח להערכת המיטו, כפי שהוא משקף ישירות את הפונקציונליות שלהם, אשר נובעת משיווי משקל של פעילות שאיבה פרוטון בשרשרת התחבורה אלקטרו....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה.

1. הכנת פתרונות

  1. צביעת מאגר (מלוחים באגירה פוספט (PBS) + 2% סרום של שור עוברי (FBS)): להוסיף 10 מ ל של FBS 500 mL של פתרון PBS סטרילי.
    הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c למשך חודש אחד לפחות במצב סטרילי. לפני תחילת ההליכים הבאים, לשים סדרת מחלקים של הפתרון הזה (50 mL) על קרח.
  2. ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) לישיר מאגר: מניחים מאגר של ACK ליסינג (1 מ ל) על הקרח לפני תחילת ההליך.
    הערה: כדי להכין את אותו מאגר לא מסחרי, לפזר 8.02 g של NH4Cl, 1 גרם של khco3 ו 37.2....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר בידוד קל של BM-MNCs ממודל העכבר. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של הפרוטוקול: בידוד עצם, הריקון מתוך מח העצם, לפירוק תא דם אדום, וכתמים נוגדן ואחריו tmrm כתמים כדי למדוד פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי באוכלוסיה מסוימת המטתית .

BM-MNCs מכילים מספר אוכלוסיות תאים, כולל HSCs. קוקטבי הנוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה מבוססים היטב בטיהור של HSCs ( CD34-CD34+), תאים רב-עוצמה (Mpps), לין -כמו גם לין+ תאים, .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המדידה הפוטנציאלית של קרום מיטוכונדריאלי היא אבן פינה של ניתוח והערכה של המיטו, אשר הם קריטיים למצב המטבולית של התא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח של ΔΨm על ידי כתמים TMRM. TMRM הוא צבע הניאון האמור לצבוע אשר מצטבר פעיל המיטומטר בשל ΔΨm, ואת הרמות המתאימות שלה להישאר בשיווי משקל בין מסחטות, cytoplasmic ומיטוכונדריאלי10. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור צבעים שונים, כולל טטרמתיל, אתיל אסתר (TMRE) ו JC-1. תנאי הצביעת המתאימים הם קריטיים להשגת תוצאות מדויקות. אלה כוללים: הגנה מפני חשיפה לאור, זמן .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לכל חברי המעבדה איטו, במיוחד K Ito ו-H סאטו, ו איינשטיין תא גזע המכון להערות הארגון איינשטיין Cy, הדמיה אנליטית מתקנים ליבה (ממומן על ידי המכון הלאומי לסרטן גרנט P30 CA013330) עבור סייע בביצוע הניסויים. K.I. נתמך על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK98263, R01DK115577, ו R01DK100689) ואת משרד ניו יורק המדינה לבריאות כמו מנהל ליבה של איינשטיין תא בודד גנומיקה/אפיגנומיקה (C029154). K.I. Ito הוא מלומד מחקר של החברה לוקמיה ולימפומה.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מאגר ליזינג ACKLife TechnologiesA1049201
B220-biotinBD Bioscience553086
CD3e-biotinLife Technologies13-0031-85
CD4-biotinFischer ScientificBDB553782
CD8-biotinLife Technologies13-0081-85
CD11b-biotinBD Bioscience553309
CD19-biotinBD Bioscience553784
CD34-FITCeBioscience11-0341-85
CD48-APCeBioscience17-0481-82
CD135-biotineBioscience13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5 Biolegend115922
c-kit-APC/Cy7Biolegend105826
Cyclosporin HMillipore SigmaSML1575-1MG
תמיסת DAPI (1 מ"ג/מ"ל)Life Technologies62248
סרום בקר עוברי (FBS)דנווילFB5001-H
FCCPMillipore SigmaC2920-10MG
Gr1-biotinBiolegend108404
IgM-biotinLife Technologies13-5790-85
Il7Rα-biotineBioscience13-1271-85
Nk1.1-biotinFischer ScientificBDB553163
Phosphate Buffered Sa Technologies (PBS)Life Technologies10010023
Sca-1-PE/Cy7eBioscience25-5981-81
SCF עכבריPEPROTECH250-03-10UG
StemSpan SFEM בינוניטכנולוגיות STEMCELL9605
Streptavidin-Pacific BlueeBioscience48-4317-82
Ter119-biotinFischer ScientificBDB553672
TMRMMillipore SigmaT5428-25MG
TPOPEPROTECH315-14-10UG
Verapamil hydrochlorideMillipore SigmaV4629-1G

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
  2. Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TMRMVerapamilFCCP

מאמרים קשורים