הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60060

⸱

20 בספטמבר 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

במאמר זה

סיכום

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

תקציר

בזאת, אנו מציגים שיטה יעילה שניתן לבצע עם מיומנויות מעבדה בסיסיות וחומרים להערכת התנועה לימפוציטים כימוקינטית במערכת vivo גלגול גירה לשעבר. קבוצה 2 מולדת תאים הלימפה (ILC2) ו CD4+ T מסייע תאים היו מבודדים טחולים והריאות של עוף ביצה אובלבומין (OVA)-מאותגרים balb/c עכברים. אנו אישר את הביטוי של CCR4 הן CD4+ T תאים ו ILC2, יחסית. CCL17 ו CCL22 הם ליגנדס ידועים עבור CCR4; לכן, שימוש זה לשעבר שיטה vivo גלגול גירה בדקנו CCL17- ו CCL22 המושרה תנועה של CCR4+ לימפוציטים. כדי ליצור מעברי כימוקין, CCL17 ו CCL22 הוצבו בחדר התחתון של מערכת ההגירה. לימפוציטים מבודדים נוספו אז ללשכה העליונה ובמשך תקופה של 48 h לימפוציטים באופן פעיל הועברו דרך 3 יקרומטר נקבוביות לעבר כימוקין בחדר התחתון. זוהי מערכת יעילה לקביעת כימוקינטיקה של לימפוציטים, אבל, באופן מובן, לא לחקות את המורכבויות שנמצאו ב vivo מיקרוסביבות העוגב. זוהי מגבלה אחת של השיטה שניתן להתגבר על ידי תוספת של הדמיה באתרו של האיבר ולימפוציטים תחת לימוד. לעומת זאת, היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבצע על ידי טכנאי ברמת הכניסה בשיעור חסכוני הרבה יותר מאשר הדמיה חיה. כמו תרכובות טיפוליות להיות זמין כדי לשפר את ההגירה, כמו במקרה של הגידול תאים חיסוניים ציטוטוקסיים, או לעכב הגירה, אולי במקרה של מחלות אוטואימוניות שבו immunopathology הוא של דאגה, שיטה זו יכולה לשמש כ כלי ההקרנה. באופן כללי, השיטה יעילה אם כימוקין העניין מייצר בעקביות כימוקינטיקה ברמה גבוהה מבחינה סטטיסטית מאשר בקרת המדיה. במקרים כאלה, ניתן לקבוע גם את מידת העיכוב/השיפור של תרכובת נתונה.

מבוא

שיטת הגירה מקורית זו הוצגה על ידי סטיבן בוידן ב-1962 בכתב העת לרפואה ניסויית1. הרבה ממה שאנחנו יודעים על כימוטקסיס וכימוקינטיקה לא יהיה אפשרי ללא התפתחות של החדר Boyden. לפני הגילוי של כימוקין הראשון ב 1977, לשעבר vivo גלגול גירה מערכות שימשו כדי ללמוד על סרום-גורמים שיכולים לעצור את התנועה הסלולרית ב מקרופאגים תוך הגברה תנועתיות הסלולר ב נויטרופילים1,2. עושר רב של ידע פותחה לגבי הגירה התא החיסונית, ועד היום, 47 נוגדנים התגלו כעת עם 19 קולטנים תואמים3,4. בנוסף, המוני מעכבי/משפרי מסלולים אלה כימוקין עברו פיתוח למטרות טיפוליות5,6,7,8. רבים מן התרכובות הללו נבדקו בתאי הגירה דומים כדי להבין אינטראקציות ישירות בין תרכובות והיענות לתא החיסונית של כימוקין9.

הגירה, או דיאפאדזיס, לתוך רקמה דלקתית היא תהליך חיוני לתגובה דלקתית בריאה לזיהום ברור10,11. חדר boyden, מערכת גלגול גירה, או מכשירי העברת התקנים מורכבים בדרך כלל משני תאים מופרדים על ידי קרום נקבובי1,12. החדר התחתון מחזיק בדרך כלל מדיה המכילה את כימוקין של עניין, בעוד לוקיציטים ממוקמים בתא העליון. גודל הנקבובית בקרום ניתן לבחור בהתבסס על גודל התא של עניין. עבור פרוייקט זה, בחרנו 3 יקרומטר ממברנה נקבובי, כמו תאים הלימפה הם 7-20 יקרומטר בגודל, בהתאם לשלב של פיתוח הסלולר. זה גודל הנקבובית מבטיח כי תאים אלה אינם מתפרקים פסיבי דרך הנקבוביות, אבל הם באופן פעיל מעביר בתגובה הדרגתי כימוקין.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא יעילותו. ב vivo גלגול גירה קשה כי זה דורש הכשרה נרחבת בטיפול בעלי חיים וניתוח, ולעתים קרובות כרוך מיקרוסקופ רב עוצמה כי הוא לא תמיד זמין לחוקר. עלות הקרנה אפקטיבית של תרכובות חשב לשפר או לעכב הגירה יכול להתבצע מראש בהדמיה vivo. בגלל מערכת גלגול גירה נשלטת בחוזקה, תאים עשויים להיות מטופלים בתחילה ולאחר מכן הוסיף המנגנון גלגול או, להיפך, כימוקין יכול להיות מטופלים הראשון עם מעכב כימוקין ולאחר מכן תאים הוסיף המנגנון גלגול יטב. לבסוף, תאים אנדותל ו/או חלבונים קרום המרתף ניתן להוסיף לחלק התחתון של הכנס transwell 1-2 ימים לפני הניסוי transwell גירה כדי להבין את המעורבות של תאי המכשול האלה בתוך כימוקינטיקה. שוב, מניפולציות אלה של המערכת לספק אמצעי רב עוצמה לקביעת מידע חשוב על האפקטיביות של מתחם נתון מראש יותר מסובך במחקרים vivo.

ניצול מערכת קאמרית הגירה היא דרך יעילה להעריך את ניידות הימפוציטים תחת שונות בvivo ובתנאי מבחנה12,13,14. להלן, אנו מתארים שיטה ממוטבת להערכת תגובתיות vivo לימפוציט לשעבר לנוגדנים בחדר הגירה טרנסטראני. בדוגמה זו ניסוי, CD4+ T תאים וקבוצה 2 תאי הלימפה המולדת (ILC2) היו מבודדים מזכר ונקבה, balb/c עכברים בעקבות החשיפה לאלרגן. השערה נוצרה כי CCR4+ CD45+ שושלת היוחסין-(LIN-) ILC2 מעכברים מאותגרים לאלרגן יועברו ביעילות רבה יותר כלפי CCL17 וCCL22 מאשר CCR4+ CD4+ T מסייע תאים. CCL17 ו CCL22 הם נוגדנים המיוצר בדרך כלל על ידי תאים דנדריטים ומקרופאגים של M2 (אלרגית) פנוטיפ, בין תאים אחרים, ב אלרגיה15,16. CCL17 ו CCL22 יכול להיות מחושב כמו סמנים ביוארגטים של דלקת אלרגית כפי שהם מזוהים בקלות בריאות במהלך המשך הנשימה16,17,18. חשוב מכך, ביטוי CCR4 הוא גבוה בהשוואה לפקדים לא מטופלים, כפי שנחשף בנתונים bio, שנוצר מ ILC2 מבודד קרדית אבק הבית בעלי חיים מטופלים, ובדומה ILC2 מבעלי חיים תמימים מטופלים לשעבר vivo עם IL-33 ( אלרגן-קידום ציטוקין מולדים) upregulates CCR419,20. יתר על כן, על פי נתונים עבור ILC2 במסד הנתונים של הגנום האימונולוגיים (www.immgen.org), CCR4 mRNA מתבטאת במידה רבה אלה תאים חיסוניים מולדים. עד כה, מעט ידוע לגבי הסחר של ILC2 לתוך רקמות, אבל סביר להניח כי ILC2 ו CD4+ T תאים להשתמש בנוגדנים דומה וקולטנים עבור כימוטקאס וכימוקינטיקה כפי שהם מבטאים את גורמי התמלול דומים וקולטנים. כך, אנו השוונו CCL17 לעומת התגובה CCL22, של ILC2 ו CD4+ לימפוציטים, הן זכר ונקבה, בעלי חיים מאותגרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדות השימוש במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה (UNMC) ואוניברסיטת יוטה.

1. התקנה והכנת ריאגנטים

  1. הכינו את התקשורת המלאה RPMI (מכון הזיכרון ברוזוול).
    1. הוסף 10 מ ל של סרום בלתי מופעל חום של שור העוברי (FBS) כדי 90 mL של RPMI.
    2. הוסף 1 מ ל של הפניצילין 100x-סטרפטומיצין-גלוטמין ל 100 mL של 10% FBS RPMI.
  2. הכן ILC2 מדיית הרחבה.
    1. הוסף IL-2 ו-IL-33 (20 ng/mL כל cytokine) עד 10 מ ל של RPMI השלם.
    2. אם ציטוקינים מלאי הם 10 μg/mL, פיפטה 20 μL של IL-2 ו-IL-33 לתוך שפופרת 15 mL המכילה 10 מ ל של מדיה RPMI מלאה.
  3. הכנת מדיום לריאה דיסוציאציה.
    1. הוסף 50 מ"ג מסוג 1 כמוסות ל-250 mL של unsupplemented.
    2. הוסף 2.5 mL של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין ל 250 mL של מדיה בשלב 1.3.1.
    3. בעדינות לערבב את המדיה כדי להבטיח את סוג 1 הקולגן מומס לחלוטין לפני השימוש.
  4. הכנת סרום-RPMI חינם.
    1. לדלל 1 גרם של סרום ליאופלי (BSA) בשנת 200 mL של RPMI.
    2. הוסף 2 מ ל של סטרפטומיצין-גלוטמין 100x.
    3. ערבב בעדינות את המדיה כדי לוודא כי ה-BSA מומס לחלוטין במדיה לפני השימוש.
  5. הכן את אמצעי ההעברה באמצעות CCL17.
    1. לרכוש 10 מ"ל של RPMI ללא סרום ולהוסיף CCL17 [50 ng/mL].
      1. אם מלאי CCL17 הוא 10 μg/mL, להוסיף 50 μL של CCL17 stock כדי 10 מ ל של מדיה RPMI סרום חינם.
  6. הכן את אמצעי ההעברה באמצעות CCL22.
    1. לרכוש 10 מ"ל של RPMI ללא סרום ולהוסיף CCL22 [50 ng/mL].
    2. אם מלאי CCL22 הוא 10 μg/mL, להוסיף 50 μL של CCL22 stock כדי 10 מ ל של מדיה RPMI סרום חינם.
  7. להכין CCR4 נוגדן מכתים קוקטייל.
    1. עבור 10 בדיקות סה כ, להוסיף 5 μL של כל אחד מהנוגדנים הבאים לצינור 5 מ"ל: אנטי-עכבר CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2, ו ICOS.
      הערה: דוגמה לאופן הפיכת קוקטייל נוגדן עבור 10 דגימות: 0.5 μL של כל נוגדן x 10 דגימות = 5 μL של כל אחד מהנוגדנים המפורטים ב1.7.1.
    2. עבור 10 בדיקות בסך הכל, להוסיף 2.5 μL של נוגדנים הבאים לקוקטייל הנוגדן משלב 1.7.1: אנטי עכבר CD3, CD11c, ו-NK 1.1.
      הערה: דוגמה כדי להשלים את קוקטייל הנוגדן עבור 10 דגימות: 0.25 μL x 10 דגימות = 2.5 μL של CD3, CD11c ולאחר מכן 1.1 נוגדנים.
    3. לאחסן את הנוגדן CCR4 מכתים קוקטייל ב 4 ° צ' עד מוכן להוסיף דגימות. התעלם קוקטייל נוגדן לאחר 1 שבוע אם לא בשימוש.
  8. הכן 1x ייצוב מייצב.
    1. הוסף 10 מ ל של מים מזוקקים-מזוקק עד 5 מ ל של 3x ייצוב מייצב מרוכז

2. הכנת עכברים לאלרגן-התיגר BALB/c

הערה: עכברים זכר ונקבה BALB/c נרכשו מנהר צ'רלס (UNMC) או מעבדות ג'קסון (אוניברסיטת יוטה) בגיל 6 עד 8 שבועות.

  1. לאחר הסתגלות (1 שבוע), ברגישות כל החיות כדי OVA.
    1. שילוב 100 μg/ml OVA נספחת כדי אלומיניום הידרוקסיד (20 מ"ג/ml) בצינור 5 מ ל פוליסטירן.
    2. מערבבים את הצינור ומיד לצייר 500 μL של הבולם של ה-בי-אלום ל 1 מ ל, 28 גרם מזרק (מזרק אינסולין).
    3. מניחים עכבר בצנצנת פעמון המכילה את איזוofלאנה (1 – 2 מ ל תחת רצפה מזויפת, כך שהחיה אינה עומדת ישירות באיזוללוראן). אפשר לעכבר לעבור תחת הרדמה עבור כ 1 – 2 דקות, או עד שיעור טיפות הנשימה.
    4. במהירות להרים את העכבר על ידי הפרווה על הגב והכתפיים ולהזריק 100 μl של נובה-אלום intraperitoneally לכל עכבר21,22.
    5. מניחים את העכבר בכלוב שלו ולצפות כדי לוודא שהם מחדש ניידות; זה אמור להתרחש בתוך 2 – 5 דקות.
  2. שבעה ימים לאחר הרגישות, נושא כל בעלי החיים לintranasal (i.n.) 1.5% OVA מדולל בתמיסת מלח סטרילית בחדר הניבולטיזציה (מדעי המידע הבינלאומי) עבור 20 דקות.
    1. מסירים עכברים מהכלובים שלהם ומניחים אותם בחדר החיות הניבולזציה. . תסגור את המכסה של החדר
    2. חברו את צינור הניבולטיזציה. לזרבובית הכניסה בחדר הניבולטיזציה
    3. הוסף 30 מ ל של 1.5% OVA מדולל בתמיסת מלח סטרילית לגביע הניבולטיזציה על הניבולייזר.
    4. הפעל את המנייצר ואפשר לחדר להתמלא בערפל במשך 20 דקות.
    5. . תכבה את הנייזר ותן לערפל להתיישב
    6. . להחזיר חיות לכלובים שלהם
  3. חזור על שלב 2.2 עבור סך של 5 פעמים, על 5 ימים רצופים, כדי לגרום לדלקת אלרגית.

3. בידוד CD4+ T תאים מתוך Spleens והריאות של עכברים מאותגרים

  1. המתת חסד הומאנית כל בעלי הטיפול בחיות זכר ונקבה על ידי שיתוף2 חנק על פי פרוטוקולים IACUC מאושרים, באמצעות 2 כדי 3 בעלי חיים לכל קבוצה, לכל ניסוי.
  2. ריאות בלו ומוטות מבעלי חיים ורקמות במקום בצינורות הדיסוציאציה נפרדים המבוססים על סוג הרקמה והמין של בעל החיים23.
  3. הנתק רקמת ריאה ב 500 μL של ריאה מדיה דיסוציאציה (25 U/mL; הקולגנאז, סוג 1) ב הניתוק רקמות אוטומטי באמצעות הפרוטוקול ' ריאה '.
    1. חזור על 3.2 ו 3.3 סכום כולל של שתי פעמים.
  4. לנתק את רקמת הטחול ב-500 μL של מדיית RPMI מלאה באמצעות פרוטוקול ' טחול ' על מנתק הרקמה האוטומטית.
    הערה: את הצעדים הנותרים יש לבצע בקבינט בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקה סטרילית.
  5. לשטוף את צינורות הדיסוציאציה המכילים ריאות והטחול הומוטים עם 5 מ ל של מדיה נוספת של ריאה דיסוציאציה או Complete RPMI, בהתאמה.
  6. לסנן את השעיות תא באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר ולאסוף לתוך 50 מ"ל צינורות חרוט.
  7. הריאה דגירה המגון עבור 15 – 30 דקות בחממה 37 ° c עם 5% CO2 כדי להוסיף עוד רקמת הריאה.
  8. הוסף 5 מ ל של RPMI להשלים את הריאה ואת הטחול המגון ו הגלולה התאים בחלק התחתון של צינורות 50 mL באמצעות צנטריפוגה; 378 x g בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות.
  9. לשלב את הטחול ואת התאים הריאות לתוך שפופרת יחיד 50 mL ולקבוע ספירות התא הכולל באמצעות מונה התא האוטומטי.
  10. התאימו את השעיות התאים הזכריים והנקביים ל-1 x 108 תאים/mL במאגר ההפרדה והוסיפו לצינור פוליסטירן של 5 מ ל.
    הערה: הפרוטוקול העשרה יכול להיות מותאם עד 14 מ ל שפופרת פוליסטירן כאשר התאים יותר נרכשים מן הטחול והריאות. פרוטוקול זה תוכנן עבור רקמות מ 2 – 3 עכברים לכל קבוצה; לכן שפופרת של 5 מ"ל צריכה להספיק.
  11. השתמש כ-2 שלישים מהתאים הכולל לבידוד ILC2 בהתאם לפרוטוקול העשרת הILC2.
    1. הוסף קוקטייל נוגדן (50 μL/mL) להשעיה של התא ו מודטה עבור 5 דקות at RT.
    2. וורטקס מהיר כדורים עבור 30 s ולהוסיף למדגם בקצב של 75 μL/mL של השעיית תא. בעדינות לערבב ו הדגירה עבור 5 דקות ב RT.
    3. מובילים את הצינורית עד 3 מ ל עם מאגר הפרדה ומקום במגנט הפרדה קל של 8 תאי. דגירה עבור 3 דקות at RT.
    4. עצה המגנט קדימה (הרחק מן הספירה-נוגדן תא מתחמי דבק לחלק האחורי של הצינור) ו פיפטה את ההשעיה התא לתוך צינור נקי 5 מ ל.
    5. הוסף 1.5 mL של RPMI להשלים את הצינורות ו צנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    6. יוצקים את המדיה מתוך הגלולה תא ולהשעות מחדש את ILC2 ב 1 x 107 תאים לכל mL.
    7. מקום 100 uL של זכר ונקבה ILC2 per גם ב-U-תחתון, 96-באר צלחת ולהוסיף 100 μL של ILC2 הרחבת מדיה לכל טוב.
    8. מרחיב את התאים במשך 4 – 5 ימים כדי להרחיב את ILC2.
    9. לאסוף את ILC2 לתוך שפופרת 5 מ"ל ולהוסיף עד 4.5 mL של RPMI סרום חינם. צנטריפוגה את התאים ב 378 x g עבור 5 דקות ב RT.
    10. ספירת תאים באמצעות hemacytometer ולהשעות מחדש ב 1 x 107 ILC2 per mL ב-RPMI ללא סרום.
  12. השתמש בתאים הנותרים עבור הליך בידוד התא CD4+ t, הנערך בהתאם לפרוטוקול בידוד התא CD4+ t עם מספר שינויים.
    1. הוסף סרום חולדה (50 μL/mL) לCD4 ההעשרה של תא T.
    2. הוסף קוקטייל בידוד (50 μL/mL) למדגם ו-הדגירה עבור 10 דקות ב-RT.
    3. וורטקס מהיר כדורים עבור 30 s ולהוסיף למדגם בקצב של 75 μL/mL.
    4. בעדינות לערבב את ההשעיה התא ו הדגירה עבור 2.5 דקות ו-RT
    5. למעלה דגימות של עד 3 מ ל ולמקם את 5 הצינורות mL לתוך מגנט 8-הפרדה קל ההפרדה ו דגירה עבור 5 דקות ב RT.
    6. טיפ המגנט קדימה ומנקז את התא ההשעיה לתוך צינור 5 מ ל נקי.
    7. הוסף 1.5 מ ל של סרום ללא RPMI כדי שפופרות ו צנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    8. יוצקים את המדיה מתוך הגלולה תא ולהשעות מחדש את התאים CD4+ T ב 1 x 107 תאים לכל mL ב-RPMI ללא סרום.

4. לקבוע CCR4 ביטוי על CD4+ T תאים וקבוצה 2 המולדת תאים הלימפה (ILC2) מבעלי חיים מאותגרים על ידי זרימה cy, לנסות

הערה: השלבים הבאים עשויים להתבצע על ראש ספסל פתוח כפי שהם טכניקות שאינן סטרילי.

  1. לרכוש כ 1 – 2.5 x 105 ILC2 תאים משלב 3.11.10 ו 1 – 2.5 x 106 CD4+ T תאים משלב 3.12.8 בנפרד 5 מ"ל צינורות.
    1. לשמור על שפופרת נוספת של לפחות 5.0 x 104 CD4 + T תאים כפקד בלתי מוכתם.
  2. השהה את התאים ב-100 – 200 μL של מאגר FACS והוסף 1 μL של בלוק Fc לכל צינור, לאחר מכן דגירה על הקרח (או במקרר 4 ° c) עבור 10 דקות.
  3. להוסיף 1 – 2 מ ל של מאגר FACS לכל צינור וצנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  4. יוצקים את supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב-100 – 200 μL של מאגר FACS.
  5. הוסף 37.5 μL של הנוגדן CCR4 מכתים קוקטייל להשעיה התא בכל צינור למעט הצינור המכיל את ' תאים ' לא מוכתם.
  6. מודקון את הצינורות על הקרח, או במקרר 4 ° c, במשך 20 – 30 דקות.
  7. להוסיף 1 – 2 מ ל של מאגר FACS לכל צינור וצנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  8. . שפוך את הסופרנטאנט
  9. חזור על שלבים 4.7 ו-4.8.
  10. הוסף 250 – 300 μL של 1 x ייצוב מייצב (ראה טבלת חומרים) לכל צינור.
  11. להכין שולטת בצבע יחיד בצבעים עבור כל נוגדן בקוקטייל הנוגדן CCR4 בהתאם לפרוטוקול המסופק עם חרוזי פיצוי.
    1. . מערבולת את חרוזי הפיצויים
    2. הוסיפו טיפה אחת של החרוזים לכל צינור שליטה בצבע אחד.
    3. הוסף 1 μL של כל נוגדן בקוקטייל הנוגדן CCR4 לצינור התווית שלו.
    4. בעדינות לערבב הדגירה עבור 10 דקות במקרר 4 ° c או על קרח.
    5. להוסיף 1 – 2 מ ל של מאגר FACS לכל הצינורות והצנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    6. יוצקים את supernatant ולהשעות מחדש את החרוזים ב 200 μL של מאגר FACS.
    7. להכניס למקרר את הפקדים בצבע אחד עד כל הדגימות מוכתם ומוכן להיות מנותח על cytometer זרם.
  12. לנתח את התאים הבלתי מוכתמים, שולטת בצבע יחיד ואת דגימות ניסיוני על cytometer הזרימה בתוך 24 h של קיבעון.

5. נוהל הגירה Vivo טרנסלשעבר

הערה: את הצעדים הבאים יש לבצע בקבינט בטיחות ביולוגית, כפי שהם דורשים טכניקה סטרילית.

  1. רכוש את הILC2 משלב 3.11.10 וCD4 תאי T משלב 3.12.8 וקבע את מספר הוספות ההעברה הדרושות לניסוי.
    הערה: דוגמה: עבור 1.2 mL של תאים CD4 T מועשר משלב 3.12.8, להכפיל 1.2 x 1,000 μL = 1,200 μL; לאחר מכן לחלק 1,200 uL על ידי 100 μL = 12, מספר התוספות הדרושות עבור העברת CD4 T.
  2. להעביר בעדינות את 3 יקרומטר מוסיף שורות באמצע של צלחת 24-הבאר.
  3. הוסף 500 μL של מדיית הגירה עם CCL17 לערך שליש מבארות.
  4. הוסף 500 μL של מדיית הגירה עם CCL22 לעוד שליש מבארות.
  5. הוסף 500 μL של RPMI ללא סרום המכיל כימוקין לשליש האחרון של הבארות.
  6. ברור לתייג את המכסה על הצלחת עם מדיה ההגירה המתאים ממוקם בבארות התחתון.
  7. הציבו את מוסיף המשגר בחזרה לבארות המכילות את הטיפולים השונים.
  8. הוסף בעדינות 100 μL של תאים CD4 T או ILC2 לחלק העליון של כל הוספה. אל תערבב או מצנף את התא הבולם למעלה ולמטה בטרנסבארות, משום שזה עשוי לבלבל את תוצאות הניסוי.
  9. ברור לתייג את המכסה של הצלחת עם סוג תא ממוקם בכל באר ולכתוב את התאריך והשעה של היום כי התאים נוספו.
  10. חזור על שלבים 5.2 עד 5.9 עד שכל התאים הוצבו בתוך מוסיף העברה באמצעות מדיה.
  11. בעדינות למקם את הצלחת בחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור 48 h. למזער את הקשר עם הצלחת על פני תקופת הדגירה.

6. קוונפיקציה של הגירה Vivo Transmigration שעבר

  1. להסיר בעדינות את הצלחת מן החממה ולהסיר את כל מוסיף transwell מן השורות האמצעיות לתוך הבארות הריקות ממש מעל או מתחת.
  2. לאסוף את התאים מלמטה הבארות העליון של מוסיף transwell לתוך צינורות המסומנים עם העליון או התחתון, עם, CCL22, או מדיה, עם סוג התא, עם מספר שכפול (לפחות 3 משכפל לכל ניסוי).
  3. לשטוף את הבארות התחתונה עם 500 μL של 1x PBS ולאסוף את זה לשטוף לתוך הצינור המקביל.
  4. לשטוף את הבארות העליון עם 250 μL של 1x PBS ולאסוף את זה לשטוף לתוך הצינור המקביל.
  5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 378 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  6. בעדינות מצנלת את כל. הסופרנטי מהגלולה
  7. השהה מחדש את תאי T ו ILC2 לתוך 50 μL של 1x PBS.
  8. קח 10 μL של השעיות התא והוסף ל-90 μL של 0.4% טרימטר כחול.
  9. ספירת התאים במונה התאים האוטומטיים.
    1. הקלטת% כדאיות.
    2. הקלט את ספירת התאים לכל mL עבור כל דוגמה.
    3. קבע את המספר הכולל של תאים לכל טיפול בחלק העליון ובחדר התחתון; תעד את ספירות התא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

CCR4 ביטוי בתאים CD4 + T וILC2.

להצלחה של ניסוי vivo גלגול גירה לשעבר, זה הכרחי כדי לקבוע אם לימפוציטים הם מגיבים CCL17 ו CCL22 דרך CCR4; לכן, קבענו CCR4 ביטוי בשני CD4+ T תאים וILC2 על ידי זרימה cy try. בעוד ידוע היטב כי CD4+ מסייע בתאי T CCR4 express, פחות ידוע על הביטוי של CCR4 על ILC2. איור 1 מציג את תוצאות הנציג של ביטוי CCR4, יחסית, על CD4+ T תאים (איור 1A, C) ו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

להלן, אנו מציגים שיטה מבוססת היטב להערכת כימוקין המושרה הגירה של לימפוציטים במערכת vivo גלגול גירה לשעבר. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, הראשון אשר מאמת את הביטוי של קולטן כימוקין הנכון על התאים החיסוניים בניסוי. בידינו, בחרנו CCR4 בגלל הגוף של ספרות המדגיש את החשיבות של CCR4 על Th2 תאים T מסייע בדלקת אלרגית. Ovalbumin המושרה דלקת הוכח בעבר להיות מוגבל על ידי לפחות שני CCR4 וניסטים24,25; עם זאת, זה היה לפני גילוי של הקבוצה 2 תאים הלימפה המולדת (ILC2)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילויים כספיים או קונפליקטים של עניין לגלות.

תודות

עבודה זו ממומנת על ידי האגודה האמריקאית לריאות (K.J.W.), הקרן יוג'ין קני הזיכרון הוענק T.A.W. ו K.J.W., התחלה נדיבה תמיכה מאוניברסיטת יוטה עבור K.J.W., ו המחלקה לענייני ותיקי לשנת הפרס T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. הוא המקבל של פרס מדען קריירה מחקר (IK6 BX003781) מהמחלקה לענייני ותיקי. המחברים רוצים להכיר בסיוע המערכת מגברת ליסה צ'דואלקה. המחברים מודים על הליבה UNMC זרימה Cy, לתמיכה שלהם באיסוף הזרימה cy, לנסות את הנתונים שנוצרו עבור כתב יד זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.4% טריפן כחולסיגמא-אולדריץ'15250061
1 מ"ל מזרקBD Bioscience329424U-100 מזרקים מיקרו-פיין 28 גרם 1/2 אינץ' 1 סמ"ק
100x פניצילין-סטרפטומיצין, L-גלוטמיןGibco10378-016מדלל ל-1x במדיה RPMI
15 מ"ל צינורות חרוטייםאולימפוס פלסטיק28-101צינורות פוליפרופילן
3 μ m transwell מוסיףGenesee Scientific25-288צלחת 24 בארות המכילה 12 תוספות transwell
3x מייצב קיבועBD Pharmigen338036הכן תמיסה 1x על פי פרוטוקול היצרנים
5 מ"ל צינורות פוליסטירןSTEM Cell Technologies38007
50 מ"ל צינורות חרוטייםOlympus Plastics28-106צינורות פוליפרופילן
מגנט הפרדה קל בעל 8 חדריםSTEM Cell Technologies18103
ACK Lysing BufferLife Technologies CorporationA1049201
מסננת תאים מתקדמת, 40 μ mGenesee Scientific25-375רשת ניילון, 40 μ m מסננות
אלומיניום הידרוקסיד, דרגת ריאגנטסיגמא-אולדריץ'239186-25G20 מ"ג/מ"ל
נגד עכבר CCR4; Biolegend מצומד APC1312110.5 μ g/test
נגד עכבר CD11bBD Pharmigen5573960.5 μ g / בדיקה
נגד עכבר CD11c; PE eFluor 610תרמו-פישר סיינטיפיק61-0114-820.25 μ g/test
נגד עכבר CD16/32, Fc בלוקBD Pharmigen5531410.5 μ g/test
נגד עכבר CD19; APC-eFluor 780 מצומדתרמו-פישר סיינטיפיק47-0193-820.5 μ g/test
CD3 נגד עכברים; PE Cy 7 מצומדBD Pharmigen5527740.25 μ g/test
נגד עכבר CD45; PE מצומדBD Pharmigen560870.5 μ g/test
anti mouse ICOS (CD278)BD Pharmigen5640700.5 μ g/test
נגד עכבר NK1.1 (CD161); 553164מצומד BD PharmigenFITC0.25 μ g/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 מצומדBiolegend1453110.5 μ g/test
מונה תאים אוטומטיBIORAD1450102
מפרק אוטומטיMACS Miltenyi Biotec130-093-235
אלבומין סרום בקר, אבקת ליופיליזציהSigma-AldrichA2153-10G0.5% בקלידים ללא סרום RPMI
Cell CounterBIORAD1450015
ביצת עוף Ovalbumin, דרגה Vסיגמא-אולדריץ'A5503-10G500 μ גרם/מ"ל
קולגנאז, סוג 1, מסוננתWorthington Biochemical CorporationCLSS-1, רכישה כבקבוקונים 5 X 50 מ"ג (LS004216)25 U/mL
בחרוזי פיצויAffymetrix01-1111-41טיפה אחת לכל שפופרת קונטול
צינורות דיסוציאציהMACS Miltenyi Biotec130-096-335
FACS BufferBD Pharmigen5546571x PBS + 2% FBS, עם נתרן אזיד; מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
מומת בחום-FBSGenesee Scientific25-525H10% ב-RPMI מלא & ILC2 הרחבת עכבר מדיה
CCL17GenScriptZ02954-2050 ננוגרם/מ"ל
עכבר CCL22GenScriptZ02856-2050 ננוגרם/מ"ל
עכבר CD4+ ערכת העשרת תאי T טכנולוגיותתאי גזע19852
עכבר IL-2GenScriptZ02764-2020 ננוגרם/מ"ל
ערכת העשרה ILC2תאי גזע19842
עכבר רקומביננטי IL-33STEM Cell Technologies7804420 ננוגרם/מ"ל
RPMILife Technologies Corporation22400071
מאגר הפרדהSTEM Cell Technologies201441x PBS + 2% FBS; מאוחסן ב-4 ° C
נבולייזר ותא לבעלי חיים קטניםמדעי הנתונים הבינלאומיים
מי מלח סטרילייםבקסטר2F7124; NDC 0338-0048-040.9% נתרן כלורי
מצומד RPMI טכנולוגיות

מקורות

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548(2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477(2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508(2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038(2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684(2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51(2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מפלס כימוקיניםביטוי CCR4בידוד ILC2תאי T מסוג CD4בדיקת Transwellפלואו ציטומטריהחיות תאיםסריקת כימוקינים
הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.