Method Article

אפיון של תא החיסון-מסחטות נגזרות ושלפוחיות ולימוד השפעה פונקציונלית על סביבת התא

DOI:

10.3791/60118

⸱

June 2nd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדו ח הנוכחי מדגיש את הדרישות כרונולוגי לחילוץ שלפוחית לפוחית (EV) בידוד מ מיקרוגלייה או דם מקרופאגים. Microglia-EVs נגזר הוערכו כרגולטורים של neurite מוצלח בעוד דם מקרופאג-נגזר EVs נחקרו בשליטה של הפלישה C6 glioma תא ב מבחנה. המטרה היא להבין טוב יותר אלה פונקציות EV כמו מגשרים החיסונית במיקרו סביבות מסוימות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מצב הנוירודלקתי של מערכת העצבים המרכזית (CN) ממלא תפקיד מרכזי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. Microglia, התאים החיסוניים תושב במוח, ולפעמים את מח עצם החדירה מקרופאגים (BMDMs), לווסת את הפרופיל הדלקתי של המיקרוסביבה שלהם ב-CN. עכשיו זה מקובל כי החילוץ שלפוחית הזרע (EV) אוכלוסיות מתאי החיסון לפעול כמגשרים החיסונית. לפיכך, האיסוף והבידוד שלהם חשובים לזיהוי תוכנם, אך גם להערכת ההשפעות הביולוגיות שלהם על תאי הנמען. הנתונים הנוכחיים להדגיש דרישות כרונולוגי עבור EV בידוד מתאי מיקרוגלייה או דם מקרופאגים כולל ביטול הקוד הכולל ואת גודל ההדרה כרומטוגרפיה (SEC) צעדים. ניתוח פרוטמית לא ממוקד התיר את האימות של חתימות חלבון כמו סמנים EV והתאפיין את תוכן EV פעיל ביולוגית. Microglia-EVs נגזר היו גם בשימוש פונקציונלי על התרבות העיקרית של נוירונים כדי להעריך את החשיבות שלהם כמגשרים החיסונית neurite outgrowth. התוצאות הראו כי מיקרוגליה נגזר EVs לתרום כדי להקל על neurite מוצלח בתוך מבחנה. במקביל, דם מקרופאג נגזר EVs היו בשימוש פונקציונלי כמגשרים החיסונית בתרבויות ספרואיד של התאים C6 glioma, התוצאות מראה כי אלה EVs שלוט הפלישה התאים glioma בתוך מבחנה. דו ח זה מדגיש את האפשרות להעריך את הפונקציות של תא החיסון EV-בתיווך, אך גם להבין את הבסיסים המולקולריים של תקשורת כזו. פענוח זה יכול לקדם את השימוש בשלפוחיות טבעיות ו/או בהכנת הפריה חוץ גופית של שלפוחיות טיפוליות כדי לחקות את התכונות החסינות של המיקרו-סביבה של הפתווגיות של ה-CN.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירופתוגיות רבות קשורות למצב הנוירו-דלקתי שהוא מנגנון מורכב שנחשב יותר ויותר, אך עדיין מובן בצורה גרועה משום שהתהליכים החיסוניים מגוונים ותלויים בסביבת התא. אכן, הפרעות ה-CN לא מערבת בשיטתיות את אותם אותות הפעלה ואוכלוסיות תאים החיסונית ולכן התגובות pro-או אנטי דלקתיות קשה להעריך כסיבות או השלכות של הפתווגיות. מקרופאגים תושב המוח בשם "microglia" נראה להיות בממשק בין מערכת העצבים והחיסונית1. Microglia יש מוצא מיאלואידית ונגזר שק החלמון במהלך המטפיאה פרימיטיבי ליישב את המוח, ואילו מקרופאגים היקפיים נגזרות הכבד עובר במהלך המטפיאה הסופית להפוך מקרופאגים היקפיים2. התאים מיקרוגלייה לתקשר עם נוירונים ותאי העצב-הנגזרים הנגזרות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. התרבות הראשית של Microglia/מקרופאגים

  1. התרבות הראשית של מיקרוגלייה
    1. תרבות מסחרית חולדה מיקרוגליה ראשונית (2 x 106 תאים) (לראות את הטבלה של חומרים) ב-בינונית שונה של הנשר מאוד (dmem) שיושלם עם 10% אקסוזום הסרום, 100 U/mL של פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, ו 9.0 g/L גלוקוז ב 37 ° c ו 5% CO2.
    2. לאסוף את המדיום הממוזג אחרי תרבות 48 h ולהמשיך לבידוד של EVs.
  2. התרבות העיקרית של מקרופאגים
    1. תרבות מסחרי חולדה הראשי מקרופאגים ראשוניים (1 x 106 תאים) במדיום המסופקים על ידי היצרן (לראות את טבלת חומרים) ב 37 ° צ' ו 5% CO....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד האתגרים העיקריים לייחוס השפעות ביולוגים לEVs ושלפוחיות (מידה) היא היכולת לבודד את EVs מתוך מדיום התרבות כולה. בדוח זה, אנו מציגים שיטה המשתמשת בשיטת ultracentto (UC) וגודל כרומטוגרפיה להדרה (SEC) אשר מצמידים לניתוח בקנה מידה גדול של חתימות חלבונים כדי לאמת סמנים EV ולזהות תרכובות אקטיביים. מקרופאג-או microglia-נגזר EVs מבודדים מן המדיום הממוזג לאחר התרבות 24 h או 48 h בהתאמה (איור 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים המרכזית (CN) היא רקמה מורכבת שבה תקשורת תא לתא מסדיר פונקציות נוירואליות נורמליות הדרושות לומאוסטזיס30. EVs הם כיום נחקרו נרחב ותיאר מטענים מולקולרי חשוב עבור תקשורת תא אל התא31. הם מעבירים במפורש קוקטייל של מגשרים לתאי המקבל ומשפיעים על התפקודים שלהם בתנאים בריאים ופתולוגיים32. מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי EVs לשחק תפקיד מכריע במערכת ה24,33,34 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה המוצגת הייתה נתמכת על ידי המיניסטייר דה ל'חינוך הלאלה, דה L'Enseignement, et la Recherche ו-INSERM. אנו מכירים בהכרת העיר במרכז המדעי בקמפוס לגישה למכשירים ועצות טכניות. אנו מכירים בהכרת ז'אן-פסקל גיסימנו, Soulaimane Aboulouard ואיזבל פורנייר לסיוע בספקטרומטר המסה. אנו מכירים בהכרת הערב את טאננה הערבי, כריסטול ואן קאמפ, פרנסואז le Marrec-Croq, יאקופו ויזייולי ופייר-אריק סוטיץ ' על תרומתו החזקה להתפתחויות המדעיות והטכניות.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% מיני-פרוטיאן  ג'ל חלבון טרומי TGXBio-rad4561045EDU 
אצטוניטרילפישר כימיקליםA955-1 
פילטר צנטריפוגלי Amicon 50 kDaMerckUFC505024 
אמוניום ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'9830 
HSP90 α/β נוגדן (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
תוסף B27 פלוסGibcoA3582801 
BenchMixer V2 מערבולת מיקסרבנצ'מרק מדעיBV1003 
תרכיז ריאגנט צבע לבדיקת חלבון Bio-Rad (ברדפורד)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
תא גליומה של חולדה C6ATCCATCC CCL-107 
צינורות קנונייםSarstedt62.554.002 
צנטריפוגהאפנדורף5804000010 
CO2 אינקובטורThermoFisher  
מיקרוסקופ קונפוקלי LSM880Carl ZeissLSM880 
כיסוי זכוכיתMarienfeld111580 
צלחת תרבות (60 מ"מ)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 כרומטוגרף נוזליThermoFisher  
מיקרוסקופ אלקטרונים JEM-2100JEOL  
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N&פריים;-חומצה טטראצטיתסיגמא-אולדריץ'03777-10G 
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתסיגמא-אולדריץ'ED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1אקסוזום מדולדל מסד נתונים של FBS
ExoCarta (100 החלבונים המובילים של Evs)  http://www.exocarta.org/
סרום בקר עובריGibco16140071 
סרום סוס עובריBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
פישרברנד  Q500 Sonicator עם ProbeFisherbrand12893543 
פלקסאנליזהברוקר  
מדיום הרכבה פלואורסצנטיAgilentS3023 
חומצה פורמיתסיגמא-אולדריץ'695076 
רשתות נחושת מצופות פחמן פורמבראגר סיינטיפיק בע"מAGS162-3 
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8769 
גלוטראלדהידסיגמא-אולדריץ'340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
אידואצטמידסיגמא-אולדריץ'I1149 
InstantBlue Coomassie כתם חלבוןExpedeonISB1L 
מיקרוסקופ אור הפוך CKX53אולימפוס  
ל-גלוטמיןגיבקו25030-024 
LabTek II 8 בארות  נונק154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
למיניןקורנינג354232 
תוכנת MaxQuant (תוכנה לזיהוי חלבונים)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT סטל פולניברוקר8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
מתיל צלולוזסיגמא-אולדריץ'M6385-100G 
MiliQ מיםMerck Millipore  
חלב רגיליתREGILAIT300 
מיני PROTEAN אלקטרופורזה אנכית תאBio-Rad1658000FC 
עמודת MonoP FPLCGE Healthcare כבר לא זמין
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
תוכנת NanoSight NTA v3.2Malvern Panalytical  
משאבת מזרק NanoSightMalvern Panalytical  
גיבקו נוירובזאלי21103-049 
ממברנת ניטרוצלולוזהHealthcare10600007 
נונידת P-40פלוקה56741 
Nunc multidish 24 בארותThermoFisher82.1473 
פרפורמלדהידאלקטרו-מיקרוסקופיה מדע15713 
קו תאים PC-12ATCCATCC CRL-1721 
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו15140-122 
תערובת כיול פפטידיםLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
תוכנת פרסאוס (עיבוד חלבונים מזוהים)  https://maxquant.net/perseus/
מצומד פלואידין-טטרמתילרודמיןסנטה-קרוזsc-362065 
פנילמתאן סולפוניל פלואורידסיגמא-אולדריץ'78830 
מאגר פוספט תמיסת מלחInvitrogen14190094ללא סידן, ללא מגנזיום
פלורימסננת M/ 60 ומיקרו; מpluriSelect43-50060 
פולי-D-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P6407 
צינורות צנטריפוגה מפוליקרבונטבקמן קולטר355651 
מעכב פרוטאזסיגמא-אולדריץ'S8830-20TAB 
PureColCell Systems5005 
ספקטרומטר מסה Q-ExactiveThermoFisher  
ספקטרומטר מסה rapifleXBrucker  
נוירונים בקליפת המוח של חולדהיישומי תאיםR882N-20מקור תא: נגזר מקליפת המוח של יום 18 מוחות חולדות עובריים של Sprague Dawley
מקרופאג חולדה & תרבית מיקרוגליהיישומי תאיםR620K-100אורגין תאים: מח עצם חולדה בריא תקין
מקרופאגים ראשונייםיישומי תאיםR8818-10a 
מיקרוגליה ראשונית של חולדהLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
דרגת רצף שונה TrypsinPromegaV5111 
SlideDustsher100204 
סודיום כלורידשרלאוSO0227 
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'L3771 
נתרן פלואורידסיגמא-אולדריץ'S7920-100G 
סודיום הידרוקסידScharlabSO0420005P 
נתרן פירופוספטסיגמא-אולדריץ'S6422-100G 
רכז ואקום SpeedVacThermoFisher  
תוכנת מחרוזת (רשתות שיוך חלבונים פונקציונליות)  https://string-db.org/
מצע משך מורחב של SuperSignal West DuraThermoFisher34075 
מזרק 1.0 מ"לטרומו8SS01H1 
Trans-Blot SD תא העברה חצי יבשBio-Rad1703940 
חומצה טריפלואורואצטיתסיגמא-אולדריץ'T6508 
טריסאינטרכיםUP031657 
טריס-גליציןEuromedexEU0550 
טווין 20סיגמא-אולדריץ'P2287 
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרA95765 
רוטור אולטרה-צנטריפוגה 70.1 Tiבקמן קולטר342184 
אורניל אצטטאגר סיינטיפיק בע"מAGR1260A 
נייר סינון WhatmanSigma-AldrichWHA10347510 
&אלפא;-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמיתסיגמא-אולדריץ'C2020-25G 
GE בינוניים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesImmune CellsUltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyNanoparticle Tracking AnalysisWestern BlotProteomics AnalysisNeurite OutgrowthGlioma Cell InvasionMicroglia derived EVs

Related Articles