מאמר שיטה

בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן ליסוירוס מרקמות קבועות פורמלין

DOI:

10.3791/60138

⸱

26 באוקטובר 2021

 , 
1Poxvirus and Rabies Branch, Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן וירוס כלבת כמבחן אבחון חלופי לרקמות קבועות פורמרין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחת מאפשרויות האבחון העיקריות לכלבת היא זיהוי של קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין ויראלי (RNP) (אנטיגן) בדגימות הרקמה הנגועות. בעוד שבדיקת הנוגדן הפלואורסצנטי הישיר (DFA) או הבדיקה האימונוהיסטוכימית המהירה הישירה (DRIT) משמשות בדרך כלל לגילוי אנטיגן, שתי הבדיקות דורשות רקמות טריות ו/או קפואות להתרשמות בשקופיות לפני גילוי האנטיגן באמצעות נוגדנים. אם דגימות נאספות ומתוקנות בפורמלין, אף אחת מהבדיקה אינה אופטימלית לזיהוי אנטיגן, עם זאת, הבדיקות יכולות להתבצע על ידי אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית (IHC) לאחר הטמעה בבלוקים ופרפין וחתך. בשיטת IHC זו, רקמות מוכתמות בנוגדנים נגד כלבת, חלקים הם deparaffinized, אנטיגן אחזור על ידי פרוטאוליזה חלקית או שיטות אחרות, ודגורה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים. אנטיגנים מוכתמים באמצעות peroxidase חזרת / אמינו אתיל קרבזול ומוכתם עם המטוקסילין להדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור. בנוסף לגילוי אנטיגן ספציפי, קיבוע פורמלין מציע יתרונות אחרים כמו קביעת שינויים היסתולוגיים, תנאים רגועים לאחסון ותובלה של דגימה (בטמפרטורות הסביבה), יכולת לבדוק מקרים רטרוספקטיביים ובטיחות ביולוגית משופרת באמצעות אי-החלמה של חומרים זיהומיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלבת היא דלקת המוח מתקדמת חריפה הנגרמת על ידי וירוסי RNA תחושה שלילית השייכים לסוג lyssavirus1. כמעט 99% מכלל מקרי המוות האנושיים הנגרמים על ידי זיהום בנגיף הכלבת (RABV), סוג הסוג, מועבר על ידי כלבים2. אבחון כלבת של בעלי חיים חשודים מסתמך על גילוי אנטיגן (בעיקר נוקלאופרוטאין מקודד ויראלי, חלבון N) בקומפלקס עם RNA גנומי (קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין, RNP) ברקמת המוח3. גילוי אנטיגן על ידי בדיקת נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) נחשב תקן הזהב לאבחון כלבת4. השיטה משתמשת בחומר מוח קפוא טרי או טרי, רושם מגע על שקופית, קיבוע אצטון, כתמים באמצעות איזוטיוציאנט פלואורסצנטי זמין מסחרית (FITC) שכותרתו נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים (mAbs / pAbs) ונקרא על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית5. בדיקת DFA מהירה, רגישה וספציפית לזיהוי אנטיגן כלבת ברקמת מוח טרייה. לאחרונה, בדיקה אימונוהיסטוכימית מהירה ישירה (DRIT), טכניקה אימונוהיסטוכימיה שונה (IHC), הודגמה להפגין רגישות דומה DFA אבל מציע את היתרון של מיקרוסקופיה אור להדמיה6. בעוד שיטת הזיהוי המשמשת DRIT, דומה IHC, השלב הראשוני משתמש ברקמות טריות או קפואות כדי ליצור רשמי מגע של המדגם ואחריו קיבעון פורמלין.

IHC היא טכניקה נפוצה לקביעת שינויים היסתולוגיים וזיהוי חלבונים באמצעות נוגדנים ספציפיים ברקמות קבועות פורמלין המוטמעות בלוקים פרפין. IHC הוא בדיקה חלופית הוקמה לגילוי אנטיגן כלבת בסעיפים7רקמה . IHC נוצל במיוחד לאבחון מקרים רטרוספקטיביים שהפגינו מחלות נוירולוגיות כדי לקבוע את נטל הכלבת8. רקמות קבועות פורמרין מוטבעות פרפין לשמר את החלבונים לגילוי גם לאחר מספר שנים כאשר מאוחסנים בטמפרטורתהסביבה 9. טיפול פורמלין משנה חלבונים על ידי הצלבה ושינוי שרשראות הצד של חומצות האמינו, מה שעלול לגרום לאפיטופים כבר לא להגיב נגד נוגדנים10. בעוד שבדיקת IHC לזיהוי אנטיגן נגד כלבת כוללת mAbs או pAbs, האחרון הוא יתרון כמו epitopes מרובים ו lyssaviruses מפוצלים ניתן לזהות11.

השלבים הסטנדרטיים המעורבים ב- IHC הם קיבוע פורמלין של רקמות, הטמעה בבלוקים פרפין, חלוקת רקמות, דפראפיזציה והידרציה, התאוששות אפיטופה, תגובתיות נגד נוגדנים ראשוניים ומשניים, והתפתחות באמצעות מצעים כרומוגניים. כתב יד זה מתאר תיאור מפורט של הפרוטוקול לאבחון כלבת. לגילוי אנטיגן כלבת, סרום עכבר מחוסן עם RABV (pAbs) המיוצר במרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה"ב (CDC) אטלנטה, ג'ורג'יה, בשילוב עם נוגדנים משניים נגד עכבר ביוטיניל מנוצלים. שרירי בטן ביוטינילאט מזוהים על ידי תוספת של קומפלקס peroxidase סטרפטאבידין-חזרת (HRP) ואחריו התפתחות הצבע עם מצע אמינו-אתילקרבאזול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד פרוטוקול IHC בוצע על רקמות קבועות פורמלין, אשר מנטרל RABV אם קיים, פרוטוקולים בטיחות ביולוגית מתאימים יש לעקוב כראוי. כל נהלי הבטיחות הביולוגית מתוארים בבטיחות הביולוגית במעבדות מיקרוביולוגיות וביו-רפואיות (BMBL) מהדורה 5 (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), כולל לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) ודרישת חיסון כמתואר12. בנוסף, יש לעקוב אחר בלימה וטיפול נאותים בכימיקלים מסוכנים (כמו פורמלין, AEC וקסילן), (למשל, ברדסים אדים).

1. קיבוע פורמלין של רקמות

  1. מניחים רקמות מוח 3-5 מ"מ שנאספו לאחר נמק13 לתוך 10% תמיסת פורמרין חוצץ פוספט (1:20 עד 1:50 יחס רקמות / פורמלין) עבור 24-72 שעות.
    זהירות: פורמלין הוא קיבעון רעיל.
  2. להקליט את משקל הרקמה המשוער (גודל), סוג הרקמה (אזורי המוח) ואת נפח הפורמלין. חשוב שמעבדות יתעדו ויתחזקו רשומות בזמני הקיבעון.
  3. לאחסון רקמות ארוך יותר לאחר קיבוע פורמלין ולפני העיבוד, מניחים את הרקמה ב-70% אתנול.

2. עיבוד רקמות

  1. לאחר קיבוע הדגימה, לנתח את הרקמה כדי לכלול את אזורי המוח החשובים כגון, חתכים צולבים של גזע המוח, המוח הקטן (3 אונות), או ההיפוקמפוס (שניהם היפוקמפי) כל לחתוך 3 עד 5 מ"מ עובי להציב לתוך קלטות עיבוד.
  2. לעבד את קלטות הרקמה עבור חדירת שעוות פרפין, מוטבע לתוך בלוקים פרפין מחולק (3 עד 6 מיקרומטר) על microtome.

3. הכנת חומרים / כלים מכתימים

  1. הגדר את צלחת הכתמים14 (שולחן החומרים)כפי שמוצג באיור 1. ממלאים כל מנה ב-250 מ"ל של הפתרון.
  2. הכנת פתרון מלאי מצע 3-Amino-9-אתילקרביזואל (AEC)
    1. ממיס טבליה אחת של 20 מ"ג של 3 אמינו 9-אתילקרבאזול (AEC) לתוך 5 מ"ל של N,N, דימתילפורמיד באמצעות פיפטה זכוכית.
      זהירות: AEC הוא מסרטן.
  3. הכנת פתרון המניות של הפרוטאז (למשל, פרונאז) לאחזור האנטיגן
    1. להמיס 7 מ"ג של פרוטאז ב 200 מ"ל של PBS.
  4. הכנת חיץ השטיפה PBS-T
    1. הוסף 10 מ"ל של Tween 80 עד 990 מ"ל של PBS. מערבבים אותו היטב כדי ליצור פתרון הומוגני.

4. דפראפיזציה והידרציה מחדש של רקמות

  1. הפוך 5 מיקרומטר סעיף פרפין באמצעות microtome, לצוף אותו על אמבט מים ב 38 °C (5 °F) ולאסוף על מגלשות זכוכית. סמן את השקופיות באמצעות עט/סמן עמידים לריגנט.
  2. מניחים את השקופיות על מגש וממיסים בתנור 55-60 מעלות צלזיוס למשך שעה. אין להעלות את הטמפרטורה מעל 60 °C (60 °F) כפי שהוא יכול להרוס את האנטיגן הנגיפי.
  3. מוציאים מגלשות מהתנור ומיד מסירים ב-3 שטפונות קסילן רצופות של 5 דקות כל אחת בכלים 1, 2 ו-3.
  4. Rehydrate את החלקים על השקופית על ידי טבילה רציפה בהפחתת דילול של אתנול למים deionized: (4 עד 11 הוא לשטוף לטבול) צלחת 4: קסילן / 100% אתנול (1:1); מנה 5: 100% אתנול; מנה 6: 100% אתנול; מנה 7: 95% אתנול; מנה 8: 95% אתנול; מנה 9: 80% אתנול; מנה 10: 70% אתנול; מנה 11: מים דה-יוניים (איור 1). הגדרת צלחת).
    זהירות: קסילן הוא כימיקל מסוכן ועבודה צריכה להתבצע במכסה אדים.

5. אחזור אנטיגן פרוטאוליטי

  1. לטפל שקופיות עם פרוטאז (2.5 מיקרוגרם / מ"ל של PBS) במשך 30 דקות עבור אחזור אנטיגן פרוטאוליטי בצלחת 12.
  2. לאחר מכן לשטוף PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 13).
  3. לטפל עם 3% מי חמצן במשך 10 דקות (צלחת 14).
  4. שוב, לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 15).

6. הליך הכתמת

  1. טפל בשקופיות אחת בכל פעם תוך שמירה על השקופיות הנותרות שקועות במאגר (אל תסיר את כל מחזיק השקופיות - שמור שקופיות רטובות). הסר שקופית אחת ולהכתים את חוצץ עודף (באמצעות מגבת נייר) מסביב לאזור הרקמה נזהר לא להפריע סעיף הרקמה. דגירה מחליקה בתא לחות, שנעשו על ידי הצבת מגבות נייר לחות, על ספסל המעבדההעליון 14 בטמפרטורת החדר עם סרום עזים רגיל (חסימה) במשך 15 דקות.
  2. דגירה עם נוגדן דילול ראשוני אופטימלי שנקבע מראש נגד כלבת (1:250 דילול של סרום נגד כלבת עכבר, לא פורסם) (שליטה חיובית) ונוגדני שליטה שלילית בטמפרטורת החדר זהה לעיל (שלב 6.1.) במשך 60 דקות ללא שטיפה בין לבין.
  3. לאחר 60 דקות, לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
  4. דגירה עם הנוגדן הביוטינילי (ספציפי למינים) בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טיפול זהה לשלב 6.1).
  5. לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
  6. דגירה עם מתחם סטרפטאבידין-HRP בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טיפול זהה ל-6.1).
  7. לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
  8. דגירה עם מצע פרוקסידאז, אמינו-אתילקרבזול (AEC), בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפוך AEC ממש לפני השימוש. כדי לעשות זאת, להוסיף 1 מ"ל של פתרון מלאי AEC 14 מ"ל של 0.1M חוצץ אצטט, pH 5.2. הוסף 0.15 מ"ל של 3% H2O2. מסננים את התערובת ממש לפני השימוש (מסנן 0.45 מיקרומטר).
    הערה: פתרון העבודה של AEC יציב רק עבור 2-3 שעות. ניתן לאחסן את פתרון המלאי של AEC במקרר לתקופות ארוכות יותר.
  9. לשטוף במים דה-יונו 10 דקות (מנה 17)
  10. עם ההמטוקסילין של גיל מדולל 1:2 עם מים דה-יון במשך 2 דקות (מנה 18).
  11. לשטוף עודף המטוקסילין עם שטיפת מטבל מים deionized (צלחת 19 ו 20).
  12. יש לשטוף במי הברז של סקוט 30 s (תמיסת סומק) 21.
  13. לשטוף במים דה-יונו 10 דקות (מנה 22)
  14. הסר שקופיות אחת בכל פעם - הר עם מדיום הרכבה מסיס במים.
  15. קרא שקופיות על מיקרוסקופ אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מדגים תוצאות הכתמת IHC מייצגות של דגימות שליטה חיוביות ושליליות ברקמות מוח שונות שנבדקו. איור 2A,D,G מייצג דגימות חיוביות ב- 200x, ואילו איור 2B,E,H תואם להגדלה של פי 400, בהתאמה. איור 2A-C תואם לגזע המוח; איור 2D-F מתאים לתאי המוח הקטן והפורקיניה; ואיור

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשל שיעור התמותה הגבוה של כלבת לאחר הופעת הסימפטום, האבחנה של בעלי חיים חשודים לזיהום RABV היא קריטית ביותר לטיפול מניעתי מתאים לאחר חשיפה. אבחון כלבת תלוי בעיקר בטכניקות DFA, DRIT ו- PCR באמצעות רקמות טריות או קפואות. לבדיקת רקמות קבועות פורמרין, בדיקת IHC מספקת שיטה חלופית לזיהוי רגיש וספציפי של אנטיגן RABV. בעוד הרקמות קבועות פורמלין יש חלבונים התייצבו עקב שינוי של שרשראות צד כמו קישור צולב, הדגימות צריך להיות מעובד לפני גילוי אנטיגן. בפרוטוקול זה, האפיטופים נמצאו באמצעות העיכול הפרוטאוליטי החלקי על ידי הפרוטאז (למשל,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדות, לאפידמיולוגים ולשותפים עם מחלקות בריאות הציבור על הגשת מדגמים למרכז לבקרת מחלות ומניעתן. הממצאים והמסקנות בדו"ח זה הם של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את עמדתם הרשמית של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן. השימוש בשמות מסחריים ומקורות מסחריים מיועד לזיהוי בלבד ואינו מרמז על תמיכה על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3% מי חמצןPharamacyמהמדף 3% H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)Millipore SigmaA6926
אצטט בופר pH 5.2Poly Scientific R& D Corp.s140
חוצץ פורמלין 10% פוספט חוצץפישר מדעיSF100-4תלושי כיסוי מוסמכים
קורנינגפישר סיינטיפיק12-553-47124 X 50 מ"מ
אתנול 190 הוכחהPharmco-AAPER111000190
אתנול 200 הוכחהPharmco-AAPER111000200
ניסוח המטוקסילין של גיל #2Fisher ScientificCS401-1D
HistoMark ביוטין-סטרפטווידין ערכת פרוקסידאזseracare71-00-18נוגדן ראשוני לעכבר 
ImmunoHistoMountMillipore Sigmai1161אמצעי הרכבה
N,N, דימתיל פורממיד GRפישר מדעיD119
פוספט חוצץ מלח HyCloneRR14440.0101M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objectiveמספר ספקים
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objectiveספקים
PronaseMillipore Sigma53702פרוטאז, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water פולי סיינטיפיק מו"פ D Corp.s1887
סט כתמי שקופיות Tissue-Tekפישר סיינטיפיק50-294-72
TWEEN-80 Millipore SigmaP1754
XyleneFisher ScientificX3S-4היסטולוגית
Zeiss Axioplan 2 - מיקרוסקופספקים
מותגי מרובים הדמיה מרובים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
  3. Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
  4. WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).
  5. Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
  6. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  7. Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
  8. Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
  9. Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
  10. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  11. Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
  12. Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
  13. WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
  14. Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  15. Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
  16. WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
  17. Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AECPBS T

מאמרים קשורים